Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Op papier gebaseerde preconcentratie en isolatie van microvesicles en exosomen

doi: 10.3791/61292 Published: April 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Gepresenteerd is een protocol om een op papier gebaseerd apparaat te fabriceren voor de effectieve verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen.

Abstract

Microvesicles en exosomen zijn kleine membranous vesicles vrijgegeven aan de extracellulaire omgeving en verspreid door het hele lichaam. Omdat ze verschillende door ouderlijke cellen afgeleide biomoleculen bevatten, zoals DNA, mRNA, miRNA, eiwitten en lipiden, zijn hun verrijking en isolatie cruciale stappen voor hun exploitatie als potentiële biomarkers voor klinische toepassingen. Conventionele isolatiemethoden (bijvoorbeeld ultracentrifugatie) veroorzaken echter aanzienlijk verlies en schade aan microvesicles en exosomen. Deze methoden vereisen ook meerdere repetitieve stappen van ultracentrifugatie, laden en verspillen van reagentia. Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methode om een op origamipapier gebaseerd apparaat (Exo-PAD) te fabriceren dat is ontworpen voor de effectieve verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen op een eenvoudige manier. Het unieke ontwerp van de Exo-PAD, bestaande uit accordeonachtige multifolded lagen met convergente monstergebieden, is geïntegreerd met de ionconcentratiepolarisatietechniek, waardoor de microvesicles en exosomen op specifieke lagen vervijfvoudigd kunnen worden. Bovendien worden de verrijkte microvesicles en exosomen geïsoleerd door simpelweg de Exo-PAD uit te vouwen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Microvesicles en exosomen zijn kleine membraanvezelpen van respectievelijk 0,2−1 μm en 30−200 nm. Ze worden afgescheiden in de extracellulaire omgeving door verschillende celtypen1,2,3,4,5. Ze bevatten ouderlijke cel informatie in de vorm van subsets van DNA, mRNA, miRNA, eiwitten, en lipiden, en circuleren door het hele lichaam via verschillende lichaamsvloeistoffen zoals serum, plasma, urine, hersenvocht, vruchtwater, en speeksel6,7,8,9. Zo kunnen technieken voor een efficiënte isolatie van microvesicles en exosomen van biologische vloeistoffen uitgebreide mogelijkheden bieden op het gebied van de diagnose, prognose en real-time monitoring van de ziekte, evenals in de ontwikkeling van nieuwe therapieën.

De conventionele isolatiemethode voor microvesicles en exosomen op basis van ultracentrifugatie is echter uiterst tijdrovend en veroorzaakt aanzienlijk verlies en verontreiniging van het monster. Dit komt omdat het gaat om verschillende omslachtige pipetting en laadstappen en het weggooien van verschillende reagentia met herhaalde ultracentrifugatie5,6,10,11,12. Bovendien kan de hoge afschuifspanning veroorzaakt door ultracentrifugatie (~100.000 x g) de fysieke lyse van microvesicles en exosomen veroorzaken , wat een slechte herstelsnelheid oplevert (5−23%)6,13,14. Daarom moet een zeer efficiënte, onopvallende isolatietechniek voor microvesicles en exosomen worden ontwikkeld om schade en verlies te verminderen, waardoor hogere herstelsnelheden worden bereikt.

Een op origami-papier gebaseerd apparaat (Exo-PAD) is ontwikkeld voor een eenvoudigere, zachtere en zeer efficiënte isolatie van microvesicles en exosomen6. Het ontwerp van de Exo-PAD is een meervoudig papier met serieel verbonden monstergebieden die geleidelijk in diameter afnemen. De ionconcentratiepolarisatie (ICP) techniek, een nano-elektro-elektro-elektrokinetisch fenomeen dat geladen biomoleculen preconcentraeert, werd geïntegreerd met dit unieke ontwerp. Het gebruik van de Exo-PAD resulteerde in een vijfvoudige verrijking van de microvesicles en exosomen in specifieke lagen en hun isolatie door simpelweg het apparaat te ontvouwen. Dit artikel beschrijft de Exo-PAD in detail, van de algehele fabricage en werking van het apparaat tot de analyse van het gebruik ervan, om de methode te illustreren en representatieve resultaten weer te geven6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Fabricage van het apparaat

  1. Definieer de regio die op papier moet worden afgedrukt met behulp van printersoftware(Tabel met materialen).
    OPMERKING: Het ontwerp heeft 12 lagen met waspatroon waarin de diameters van de ronde monstergebieden geleidelijk worden verkleind van 5 mm tot 2 mm (figuur 1A).
  2. Druk hydrofobe was op de aangewezen gebieden aan beide zijden van het cellulosepapier(Tabel van materialen) af met behulp van een commerciële wasprinter (Tabel van materialen) ( figuur1B).
  3. Plaats het met was bedrukte papier in een laboratoriumoven voor 80 s bij 120 °C.
    LET OP: Met deze stap kan de was de binnenkant van het papier bereiken door een thermische reflow van de bedrukte was te bereiken. Met dit incubatieprotocol is de resolutie van het patroon ~2 mm. Dus, wees voorzichtig niet om patronen van minder dan 2 mm af te drukken. Anders worden de patronen geblokkeerd door de was.
  4. Snijd het met was bedrukte papier met een frees om afzonderlijke apparaten te maken (figuur 1C).
  5. Drop 5 μL en 2 μL permselective membraan (bijvoorbeeld Nafion; Materiaaltafel) op de monstergebieden in respectievelijk de meest linkse en meest rechtse lagen(figuur 1D).
  6. Plaats de lagen bedekt met het permselectieve membraan op een hete plaat op 70 °C gedurende 30 minuten om het permselectieve membraan oplosmiddel te verdampen.
  7. Verzegel het buitenste oppervlak van de gecoate laag naar de bufferoplossing met drukgevoelige tape, waardoor een klein gaatje overblijft.
  8. Vouw het geprinte individuele apparaat (d.w.z. Exo-PAD) heen en weer langs de witte lijnen.
    OPMERKING: Door het apparaat op te vouwen, worden alle monstergebieden convergent verbonden(figuur 1E). Dit convergente ontwerp richt zich op de elektrische veldlijnen wanneer de spanning wordt toegepast voor ICP, het bereiken van een intensievere preconcentratie van de microvesicles en exosomen.

2. Verrijking en ruimtelijke scherpstelling van microvesicles en exosomen door polarisatie van de ionenconcentratie

  1. Laad 15 μL van de microvesicle en exosoommonster (~3 x 1011 deeltjes/mL in 0,1x fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS] met 0,05% Tween 20) in de convergente monstergebieden door leiding te geven en wacht een paar seconden om volledige bevochtiging van alle monstergebieden te garanderen (figuur 1F).
  2. Plaats twee acrylkamers aan beide uiteinden van de Exo-PAD en klem de Exo-PAD stevig met kleine bindmiddelclips om ontvouwen te voorkomen(figuur 1G).
  3. Vul de kamers met 110 μL van 0,1x PBS en steek twee Ag/AgCl-elektroden in (figuur 1H).
  4. Breng 30 V gedurende 20 minuten aan op de elektroden met behulp van een stroom-voltagebronmeetsysteem(Tabel van materialen).
    OPMERKING: De toegepaste spanning genereert het ICP-fenomeen en concentreert daarom de microvesicles en exosomen op de lagen 8 en 9 van de Exo-PAD.

3. Isolatie van de verrijkte microvesicles en exosomen

  1. Scheid de gevouwen Exo-PAD van de acrylkamers en vouw het apparaat open om de verrijkte microvesicles en exosomen van de andere lagen te isoleren (figuur 1I).
  2. Punch uit de steekproef gebieden in de lagen 8 en 9, waar de microvesicles en exosomen zijn verrijkt, voor downstream-analyse (Figuur 1J).

4. Scanning elektronenmicroscopie analyse

  1. Bevestig de verrijkte microvesicles en exosomen door de geponste gebieden in 2,5% glutaraldehyde onder te dompelen in 0,1 M natriumcaanoodylaatbuffer voor 1 h en in 1% osmiumteroxide in 0,1 M natriumcaanolaat gedurende 1 uur.
    LET OP: Osmium tetroxide is zeer giftig en gevaarlijk chemisch. Omdat osmiumteroxide kunststoffen kan binnendringen, moet het in glas worden opgeslagen. Elke behandeling van osmium tetroxide moet worden uitgevoerd in een chemische rookkap met dubbele nitrilhandschoenen.
  2. Dehydrateren van de vaste microvesicles en exosomen met oplopende kwaliteiten van 200 bewijs ethanol (d.w.z. 50%, 70%, 90% en 100%) voor 30 min per stuk.
  3. Droog het monster chemisch door het 30 minuten in hexamethyldisilazane in een desiccator onder te dompelen.
    LET OP: Hexamethyldisilazane is een brandbare en vochtgevoelige chemische stof. Het moet worden opgeslagen in een droge en goed geventileerde ruimte uit de buurt van ontstekingsbronnen.
  4. Coat de volledig gedroogde microvesicles en exosomen met goud / palladium (~ 20 nm) via sputteren en vangen scanning elektronenmicroscopie (SEM) beelden.

5. Nanodeelvolganalyse

  1. Punch uit de steekproef gebieden in de lagen 6, 8 en 10 met behulp van een biopsie punch na 20 min van het apparaat operatie.
  2. Dompel elk uitgestakt gebied onder in bufferoplossing (0,1x PBS met 0,01% Tween 20).
  3. Vortex voor 10 min en centrifuge voor 30 s bij 6.000 rpm om de verrijkte microvesicles en exosomen opnieuw op te lichten.
  4. Verwijder de uitgeponst-out gebieden uit de oplossing en meet de concentratie van microvesicles en exosomen door middel van een nanoparticle tracking analysis (NTA) instrument(Table of Materials).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De bedrijfstijd moet worden geoptimaliseerd om de maximale herstelopbrengst van de verrijkte microvesicles en exosomen te bereiken. Onvoldoende tijd maakt onvoldoende migratie van de microvesicles en exosomen mogelijk, waardoor de verrijking afneemt, terwijl overmatige tijd de ruimtelijke scherpstelling verslechtert en dus de microvesicles en exosomen verspreidt. Zo kan door de tijdoptimalisatiestap de maximale preconcentratiefactor van microvesicles en exosomen en de uiteindelijke locatie waar microvesicles en exosomen het meest verrijkt zijn, worden geïdentificeerd. Om de uiteindelijke locatie van de microvesicles en exosomen te vinden, werd time-lapse migratie van fluorescerend gelabelde microvesikjes en exosomen waargenomen met een microscoop(figuur 2A) en werden de fluorescentieintensiteiten in alle monstergebieden gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software(figuur 2B). Vóór het verrijkingsproces(figuur 2A, 0 min) werden microvesicles en exosomen verspreid in alle monstergebieden met een geleidelijke afname van de intensiteit als gevolg van de lichte filterwerkingswerking van de papiermatrix (figuur 2B, 0 min). Na 10 min verwerking (Figuur 2A, 10 min), gemigreerd microvesicles en exosomen elektrokinetically en een onmiddellijke preconcentratieplug verscheen op laag 7. Verdere verwerking bereikte een grotere preconcentratie van microvesicles en exosomen. Toen de procestijd 20 min bedroeg, waren microvesicles en exosomen sterk gericht op de lagen 8 en 9(figuur 2A, 20 min) en vervijfvoudigd, op basis van de fluorescentieintensiteiten(figuur 2B, 20 min).

Na het voltooien van het preconcentratieproces werden de verrijkte microvesicles en exosomen geïsoleerd door het apparaat uit te vouwen en werd het monstergebied in laag 8 uitgesplitst voor verdere analyse. SEM-beelden werden verkregen om de integriteit van de verrijkte microvesicles en exosomen te onderzoeken. Zoals blijkt uit de SEM-beelden(figuur 3A),werden na het verrijkingsproces aanzienlijk meer niet-beschadigd microvesicles en exosomen waargenomen. Aan de hand van de verkregen SEM-beelden werd de grootteverdeling van de verrijkte microvesicles en exosomen geanalyseerd (figuur 3B), waarbij de exosomen en microvesicles werden onderscheiden op basis van een drempeldiameter van 200 nm. Met andere woorden, de grootte van exosomen varieerde van 95-195 nm met een gemiddelde diameter van 134 nm en die van de microvesicles van 214-377 nm met een gemiddelde diameter van 315 nm.

Vervolgens werd de werkelijke concentratie van de verrijkte microvesicles en exosomen op de monstergebieden in lagen 6, 8 en 10 geanalyseerd door NTA. Vóór verrijking was de concentratie ~2,24 x 1011 deeltjes/mL in laag 8(figuur 3C, laag 8). Na verrijking was de concentratie ~1,25 x 1012 deeltjes/mL in laag 8 (Figuur 3C, laag 8), wat aangeeft dat de microvesicles en exosomen vooraf waren geconcentreerd door een factor van ~ 5,58. Merkbare preconcentratie werd niet waargenomen op de andere lagen(figuur 3C, lagen 6 en 10). Samen tonen deze resultaten aan dat het voorgestelde papierapparaat microvesicles en exosomen ongeveer vervijfvoudigd kan verrijken.

De isolatie-efficiëntie van het apparaat werd als volgt geëvalueerd: Het monstervolume dat kan worden ondergebracht door laag 8 en 9 is ~2,2 μL op een totaal van 15 μL monstervolume in 10 lagen vanwege het vernauwingsontwerp van de Exo-PAD. Als we uitgaan van een ideaal geval waarin alle microvesicles en exosomen zijn voorgeconcentreerd op laag 8 en 9 en geen verloren gaan, dan is de ideale preconcentratie factor moet ~6.8 (15 μL/2.2 μL = ~ 6.8). De experimentele preconcentratiefactor verkregen door NTA (figuur 3c) was echter ~5,58, wat betekent dat een deel van 1,22 microvesicles en exosomen verloren ging door lysis of niet-specifieke binding aan de papiermatrix.
Equation 1
waarbij 2,24 x 1012 deeltjes/mL de initiële concentratie microvesicles en exosomen is. Uit deze berekening blijkt dat het verwachte verliespercentage van de Exo-PAD ongeveer 18% bedraagt; vandaar, de isolatie-efficiëntie is ongeveer 82%. Dit is een aanzienlijke verbetering ten opzichte van de slechte opbrengsten van ultracentrifugatie (5%-23%).

Figure 1
Figuur 1: Algemene Exo-PAD-procedures, van montage tot werking. (A) Softwareontwerp om het afdrukken van hydrofobe was op cellulosepapier te begeleiden. (B) Het met was bedrukte papier na incubatie in een oven voor 80 s bij 120 °C. (C) De afzonderlijke apparaten worden uitgesneden met behulp van een frees. (D) Permselectieve membraanoplossing wordt gedropt op de monstergebieden in de meest linkse en meest rechtse lagen enEhet oplosmiddel wordt gedurende 30 minuten op een kookplaat bij 70 °C verdampt. alle monstergebieden zijn dus convergent met elkaar verbonden. (F) In het monstergebied wordt een microvesicle en exosoommonster geladen. (G) Aan de uiteinden van het apparaat worden twee acrylkamers geplaatst en met kleine bindmiddelklemmen vastgezet. (H) De acrylkamers zijn gevuld met bufferoplossing en twee Ag/AgCl-elektroden worden ingebracht om een spanning van 30 V. (I) toe te passen Het apparaat wordt uitgeklapt om de voorgeïncentraeerde microvesicles en exosomen te isoleren. (J) De monstergebieden in de lagen 8 en 9 worden uitgestampt voor analyse. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Observatie van fluorescerende microvesicles en exosomen tijdens de werking van het apparaat en overeenkomstige fluorescentieintensiteiten. (A) Time-lapse-observatie van microvesicles en exosomen. Schaalbalk = 5 mm. Met 20 min verwerking waren de microvesicles en exosomen sterk gericht op lagen 8 en 9, waarzewerden verrijkt met ongeveer vijfvoudig. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie (n = 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Analyse van de verrijkte microvesicles en exosomen. aA) SEM-afbeeldingen die de integriteit van de verrijkte microvesicles en exosomen weergeven. Na de preconcentratie werden nog veel meer microvesicles en exosomen waargenomen6. Schaalbalk = 1 μm. (B) Grootteverdeling van de verrijkte microvesicles en exosomen. De exosoommaten waren 95−195 nm (gemiddelde diameter = 134 nm) en microvesicle maten waren 214−377 nm (gemiddelde diameter = 315 nm). cC) De werkelijke concentratie van de verrijkte microvesicles en exosomen die met NTA zijn geëvalueerd. Na verrijking vervijfvoudigde de concentratie microvesicles en exosomen, wat overeenkomt met fluorescentieresultaten6. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie (n = 3). Panelen A en C worden gereproduceerd met toestemming van Kim et al.6. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Microvesicles en exosomen die vooraf waren geconcentreerd en gericht op laag 8 werden gescheiden van het bovine serum albumine (BSA), dat in lagen 1-3 bleef. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hoewel de Exo-PAD met succes werd gebruikt voor de verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen, moeten verschillende kritieke punten zorgvuldig worden overwogen: 1) de incubatietijd en temperatuur van de oven tijdens de bereiding van het apparaat, 2) verwerkingstijd, 3) toepassing van spanning met verschillende laagnummers en diameters van het monstergebied, en 4) toepasselijkheid op klinische monsters.

De incubatietijd en temperatuur in het protocol zijn geoptimaliseerde omstandigheden om een betrouwbaar apparaat te fabriceren. Langere incubatietijden of een hogere temperatuur kunnen vervorming van het convergente ontwerp veroorzaken als gevolg van de overmatige reflow van de bedrukte was. Dit voorkomt de vorming van gerichte elektrische veldlijnen en verhoogt zo de migratieweerstand tijdens het elektrottische verrijkingsproces.

Verwerkingstijd is ook een factor om rekening mee te houden voor maximale verrijking en isolatie. Een verwerkingstijd van <20 min resulteert in minder preconcentratie omdat er niet voldoende tijd is om microvesicle en exosoom migratie mogelijk te maken. Aan de andere kant, een verwerkingstijd van >20 min verslechtert de focus efficiëntie en maakt dispersie van de verrijkte microvesicles en exosomen. Volgens deze test is 20 min de beste verwerkingstijd om maximale verrijking en isolatie van microvesicles en exosomen te bereiken.

De toegepaste spanning is een andere belangrijke factor om te overwegen. In dit protocol wordt, rekening houdend met het aantal lagen en de diameters van het monstergebied, 30 V gebruikt om stabiele preconcentratie en isolatie te bereiken. Wanneer in het apparaat een ICP-fenomeen wordt gegenereerd, kan het bedrijfsregime worden onderverdeeld in drie verschillende gebieden op basis van de toegepaste spanning: (1) ohmisch, (2) beperkend en (3) overbeperkende gebieden6,15,16. Voor stabiele preconcentratie en isolatie moet het apparaat worden gebruikt in het beperkende gebied, waar een ionenuitputtingszone wordt gegenereerd en microvesicles en exosomen stabiel vooraf geconcentreerd zijn. In deze experimentele setting komt het werkingsspanningsbereik (5−40 V) overeen met het beperkende gebied voor de Exo-PAD. Als de toegepaste spanning <5 V is, werkt het apparaat in het ohmische gebied, waar de elektrische stroom lineair toeneemt, wat aangeeft dat er geen ionenuitputtingsgebied wordt gegenereerd voor preconcentratie. Als de spanning echter >40 V is, wordt het ionenuitputtingsgebied vernietigd door sterke spanningsaangedreven elektroconvection, die preconcentratie destabiliseert. Gezien deze factoren werd vastgesteld dat 30 V de optimale spanning was om te gebruiken voor een apparaat met 12 lagen en een steekproefgebieddiameter van 2−5 mm. Laagnummers of diameters van het monstergebied kunnen worden verhoogd om het monstervolume te vergroten, maar deze factoren, evenals de bedrijfsspanning, moeten worden geoptimaliseerd om een stabiele verrijking van microvesicles en exosomen te bereiken.

De voorgestelde Exo-PAD kan worden gebruikt om microvesicles en exosomen te isoleren van verschillende klinische monsters, waaronder speeksel, urine, serum en plasma. Voor monsters met minder eiwit, zoals speeksel of urine, kunnen microvesicles en exosomen gemakkelijk worden geïsoleerd zonder grote veranderingen, omdat een kleine hoeveelheid eiwit in deze monsters zal worden gefilterd door niet-specifieke binding aan het papier. Bij het bedienen van het apparaat binnen het beperkende gebied hoeft alleen de toegepaste spanning in aanmerking te worden genomen, omdat de ionische sterkte van de monsters anders kan zijn. Voor eiwitrijke monsters, zoals serum of plasma, moet zowel de preconcentratie van microvesicles en exosomen als de scheiding daarvan van overvloedige eiwitten zorgvuldig worden overwogen. Ons recente experiment toont aan dat de scheiding van microvesicles en exosomen van eiwitten aanzienlijk wordt verbeterd wanneer carbonaatbuffer wordt gebruikt, omdat carbonaatbuffer resulteert in een hoger verschil in elektrische lading tussen microvesicles en exosomen en eiwitten als gevolg van het isolektriciteitspunt, wat resulteert in een betere scheidingsefficiëntie. Voor dit experiment werd een stof met overvloedige eiwitten naast microvesicles en exosomen nagebootst door gezuiverde microvesicles en exosomen gelabeld met FITC (Ex/Em: 490/520 nm) te mengen met BSA gelabeld met een andere fluorofof (Ex/Em: 590/617 nm) in 50 mM carbonaatbuffer (Tabel van materialen). Zoals blijkt uit aanvullende figuur 1,waren de meeste microvesicles en exosomen vooraf geconcentreerd op laag 8, zoals in figuur 2A en werden ze gescheiden van BSA, dat in lagen 1-3 bleef. Dit resultaat suggereert dat verrijking van een serum of plasmamonster een extra stap vereist om carbonaatbuffer aan het monster toe te voegen, en toont duidelijk aan dat de Exo-PAD microvesicles en exosomen kan zuiveren uit overvloedige eiwitten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door de National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A090840444. J. H. Lee werd in 2019 ondersteund door een onderzoeksbeurs van de Universiteit van Kwangwoon. Hyerin Kim werd ondersteund door het "Competency Development Program for Industry Specialists" van het Koreaanse ministerie van Handel, Industrie en Energie (MOTIE), beheerd door het Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (nr. P0002397, HRD programma voor industriële convergentie van draagbare slimme apparaten).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl electrodes A-M Systems, Inc. 531500 0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13101 BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer Sigma-Aldrich C3041-50CAP Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada) Corel Corporation Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870 Xerox Corporation Wax printer
Chromatography paper grade 1 Whatman 3001-861 Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards HansaBioMed Life Sciences, Ltd. HBM-F-PEP-100 Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter Keithley Instruments, Inc. Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution Sigma-Aldrich 31175-20-9 Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10 NanoSight Technology Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) Thermo Fisher Scientific 10010001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14, (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17, (21), 3558-3577 (2017).
  3. Simons, M., Raposo, G. Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21, (4), 575-581 (2009).
  4. Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34, (1), 11-30 (2019).
  5. Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).
  6. Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19, (23), 3917-3921 (2019).
  7. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200, (4), 373-383 (2013).
  8. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
  9. Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11, (7), 6968-6976 (2017).
  10. Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39, (15), 2029-2038 (2018).
  11. Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  12. Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18, (10), 3175 (2018).
  13. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, (1), 1-11 (2015).
  14. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  15. Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91, (16), 10744-10749 (2019).
  16. Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16, (5), 925-931 (2016).
Op papier gebaseerde preconcentratie en isolatie van microvesicles en exosomen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).More

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter