Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Mikrovezikül ve Ekzozomların Kağıt Bazlı Preconcentration ve İzolasyonları

doi: 10.3791/61292 Published: April 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Sunulan mikroveziküller ve ekzozomların etkili zenginleşmesi ve izolasyonu için kağıt tabanlı bir cihaz imal etmek için bir protokoldür.

Abstract

Mikroveziküller ve ekzozomlar hücre dışı ortama salınan ve vücutta dolaşan küçük membranöz veziküllerdir. DNA, mRNA, miRNA, proteinler ve lipidler gibi çeşitli ebeveyn hücre kaynaklı biyomoleküller içerdikleri için, bunların zenginleşmesi ve izolasyonu klinik uygulamalar için potansiyel biyobelirteçler olarak sömürülmeleri için kritik adımlardır. Ancak, konvansiyonel izolasyon yöntemleri (örn. ultrasantrifüj) mikrovezikülve ekzozomlarda önemli kayıp ve hasara neden olur. Bu yöntemler aynı zamanda aşırı santrifüj, yükleme ve reaktiflerin israfı birden çok tekrarlayan adımlar gerektirir. Bu makalede, basit bir şekilde mikroveziküllerin ve ekzozomların etkili bir şekilde zenginleştirilmesi ve izole edilmesi için tasarlanmış bir origami-kağıt tabanlı cihaz (Exo-PAD) imal etmek için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Yakınsak örnek alana sahip akordeon benzeri çok katlı katmanlardan oluşan Exo-PAD'in benzersiz tasarımı, iyon konsantrasyonu polarizasyon tekniği ile entegre edilerek mikroveziküllerin ve ekzozomların belirli katmanlarda beş kat zenginleştirilmesine olanak sağlar. Buna ek olarak, zenginleştirilmiş mikroveziküller ve ekzozomlar sadece Exo-PAD açArak izole edilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mikroveziküller ve ekzozomlar sırasıyla 0.2−1 μm ve 30−200 nm ölçülerinde küçük membran veziküllerdir. Onlar birkaç farklı hücre tipleri 1 tarafından hücre dışı ortama salgılanır1,2,3,4,5. Onlar DNA, mRNA, miRNA, proteinler ve lipidler alt kümeleri şeklinde ebeveyn hücre bilgileri içerir ve serum, plazma, idrar, beyin-omurilik sıvısı, amniyotik sıvı ve tükürük gibi çeşitli vücut sıvıları ile vücutta dolaşan6,7,8,9. Bu nedenle, mikroveziküllerin ve ekzozomların biyolojik sıvılardan verimli bir şekilde izole edilmesi ne kadar iyi olursa odalabilmek için, hastalığın tanı, prognoz ve gerçek zamanlı izleme ve yeni tedavi alanlarının geliştirilmesi alanlarında geniş fırsatlar sunabilmektedir.

Ancak, ultrasantrifüje dayalı mikroveziküller ve ekzozomlar için geleneksel izolasyon yöntemi son derece zaman alıcıdır ve numunenin önemli ölçüde kaybolmasına ve kirlenmesine neden olur. Birkaç hantal pipetleme ve yükleme adımları ve tekrarlanan ultracentrifugation,5,6,10,11,12ile çeşitli reaktiflerin atılması içerir olmasıdır.12 Ayrıca, ultracentrifugation tarafından indüklenen yüksek kesme stresi (~ 100.000 x g)mikrovezikülve ekzozomların fiziksel lysis neden olabilir, kötü iyileşme oranları verim (%5−23%)6,13,14. Bu nedenle, mikroveziküller ve ekzozomlar için son derece verimli, göze batmaz bir izolasyon tekniği geliştirilmeli, böylece daha yüksek iyileşme oranları elde edilmelidir.

Bir origami-kağıt tabanlı cihaz (Exo-PAD) mikroveziles ve ekzozomlar6basit, nazik ve yüksek verimli izolasyon için geliştirilmiştir. Exo-PAD'in tasarımı, seri olarak bağlı numune alanlarına sahip ve çapı giderek azalan çok katlı bir kağıttır. Yüklü biyomolekülleri önceden yoğunlaştıran nano-elektrokinetik bir fenomen olan iyon konsantrasyonu polarizasyon (ICP) tekniği bu eşsiz tasarımla bütünleşmiştir. Exo-PAD'in kullanılması, mikroveziküllerin ve ekzozomların belirli katmanlarda beş kat zenginleşmesine ve cihazın sadece açığa çıkarılarak izolasyonuna yol açtı. Bu makalede, exo-PAD ayrıntılı olarak açıklanır, genel cihaz imalatı ve operasyon kullanımının analizi, yöntemi göstermek ve temsili sonuçları göstermekiçin 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Cihaz imalatı

  1. Yazıcı yazılımı(Tablo Of Materials)kullanarak kağıda basılacak bölgeyi tanımlayın.
    NOT: Tasarım, dairesel numune alanlarının çaplarının kademeli olarak 5 mm'den 2 mm'ye kadar daraldığı 12 balmumu desenli katmana sahiptir(Şekil 1A).
  2. Selüloz kağıdın her iki tarafına belirlenen bölgelere hidrofobik balmumu yazdırın(Malzeme Tablosu) ticari balmumu yazıcı(Malzeme Tablosu)(Şekil 1B)kullanarak.
  3. Balmumu baskılı kağıdı 120 °C'de 80 s'lik bir laboratuvar fırınına yerleştirin.
    NOT: Bu adım, basılı balmumu termal bir yeniden akış elde ederek kağıdın içine ulaşmak için balmumu sağlar. Bu kuluçka protokolü ile desenin çözünürlüğü ~2 mm'dir. Böylece, 2 mm'den daha az desenler yazdırmamaya dikkat edin aksi takdirde desenler balmumu tarafından engellenir.
  4. Tek tek cihazlar yapmak için balmumu baskılı kağıdı bir kesici ile kesin(Şekil 1C).
  5. Damla 5 μL ve 2 μL permektif membran (örneğin, Nafion; Malzeme Tablosu) sırasıyla en sol ve en sağ katmanlarda örnek alanlara (Şekil 1D).
  6. Permselective membran çözücübuharlaştırmak için 30 dakika için 70 °C sıcak bir plaka üzerinde permselmembran membran ile kaplanmış katmanları yerleştirin.
  7. Tampon çözeltiye bakan kaplamalı tabakanın en dış yüzeyini basınca duyarlı bantla kapatın ve küçük bir delik bırakın.
  8. Yazdırılan tek tek cihazı (örn. Exo-PAD) beyaz çizgiler boyunca ileri geri katlayın.
    NOT: Cihazı katlayarak, tüm örnek alanlar yakınsamayla bağlanır (Şekil 1E). Bu yakınsak tasarım, Voltaj ICP için uygulandığında elektrik alan çizgilerini odaklayarak mikroveziküllerin ve ekzozomların daha yoğun bir ön konsantrasyonuna ulaşır.

2. Iyon konsantrasyonu polarizasyonu ile mikroveziküllerin ve ekzozomların zenginleştirilmesi ve mekansal odaklanması

  1. Mikrovezikül ve ekzozom numunesinin 15 μL'sini yükleyin (~3 x 1011 partikül/mL 0,1x fosfat tamponlu tuzlu tuzlu [PBS] ile %0,05 Ara 20) yakınsak numune alanlarına boru lama ile ve tüm numune alanlarının tam Olarak ıslatılmasını sağlamak için birkaç saniye bekleyin(Şekil 1F).
  2. Exo-PAD'in her iki ucuna iki akrilik oda yerleştirin ve exo-PAD'i küçük bağlayıcı klipslerle güvenli bir şekilde kenetleyin (Şekil 1G).
  3. Odaları 0,1x PBS'nin 110 μL'si ile doldurun ve iki Ag/AgCl elektrot takın(Şekil 1H).
  4. Akım gerilimi kaynak ölçüm sistemi(Malzeme Tablosu)kullanarak elektrotlara 20 dk için 30 V uygulayın.
    NOT: Uygulanan gerilim ICP fenomenini oluşturur ve bu nedenle Exo-PAD'in 8 ve 9.

3. Zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların izolasyonu

  1. Katlanmış Exo-PAD'i akrilik bölmelerden ayırın ve zenginleştirilmiş mikrovezikülleri ve ekzozomları diğer katmanlardan izole etmek için cihazı açın(Şekil 1I).
  2. Mikroveziküllerin ve ekzozomların zenginleştiği 8 ve9.

4. Taramalı elektron mikroskobu analizi

  1. Zenginleştirilmiş mikrovezikülleri ve ekzozomları, delikli alanları 0,1 M sodyum kacodylate tamponuna 0,1 M sodyum kacodylate tamponuna ve 0,1 M sodyum kacodylate de %1'de 1 saat eve batırarak düzeltin.
    DİkKAT: Osmiyum tetroksit son derece zehirli ve tehlikeli bir kimyasaldır. Osmiyum tetroksit plastiklere nüfuz edebileceği nden, camda saklanmalıdır. Osmiyum tetroksitin herhangi bir şekilde taşınması, çift nitril eldivenli kimyasal bir duman kaputunda yapılmalıdır.
  2. Sabit mikrovezikülleri ve ekzozomları 200 reis etanol (yani%50, %70, %90 ve %100) artan derecelerle susuz laştırın her biri 30 dakika.
  3. Kimyasal 30 dakika boyunca bir kurutucu içinde hexamethyldisilazane daldırma tarafından örnek kuru.
    DİkKAT: Hexamethyldisilazane yanıcı ve neme duyarlı bir kimyasaldır. Ateşleme kaynaklarından uzakta kuru ve iyi havalandırılan bir alanda saklanmalıdır.
  4. Tamamen kurutulmuş mikrovezikülleri ve ekzozomları altın/paladyum (~20 nm) ile kaplayın ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntülerini yakalayın.

5. Nanopartikül izleme analizi

  1. 20 dk cihaz çalışmasından sonra biyopsi yumruğu kullanarak 6, 8 ve 10 katmanlarındaki numune alanlarını delin.
  2. Her delikli alanı tampon çözeltiye daldırın (0,1x PBS %0,01 Ara 20 ile).
  3. Zenginleştirilmiş mikrovezikülleri ve ekzozomları yeniden askıya almak için 6.000 rpm'de 30 s'lik 10 dakika ve santrifüj için girdap.
  4. Çözeltiden delikli alanları çıkarın ve mikroveziküllerin ve ekzozomların konsantrasyonunun bir nanopartikül izleme analizi (NTA) cihazı(Malzeme Tablosu)ile ölçün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

İşlem süresi zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların maksimum geri kazanım verimini elde etmek için optimize edilmelidir. Yetersiz zaman mikroveziküllerin ve ekzozomların yeterli göçetmesine izin vermez, bu da zenginleştirmeyi azaltır, aşırı zaman ise uzamsal odaklamayı bozar ve dolayısıyla mikrovezikülleri ve ekzozomları dağıtır. Böylece, zaman optimizasyonu adımı ile mikroveziküllerin ve ekzozomların maksimum ön konsantrasyon faktörü ve mikroveziküllerin ve ekzozomların en zengin olduğu son yer tespit edilebilir. Mikroveziküllerin ve ekzozomların son yerini bulmak için floresan etiketli mikroveziküllerin ve ekzozomların hızlandırılmış göçü mikroskop(Şekil 2A)ile gözlendi ve tüm örneklem alanlarındaki floresan yoğunlukları ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü (Şekil 2B). Zenginleştirme işleminden önce(Şekil 2A, 0 dk), mikroveziküller ve ekzozomlar, kağıt matrisinin hafif filtreleme hareketi nedeniyle tüm numune alanlarında kademeli olarak azalmış olarak dağıtılmıştı(Şekil 2B, 0 dk). 10 dk işlemden sonra(Şekil 2A, 10 dk), mikroveziküller ve ekzozomlar elektrokinettik olarak göç etmiş ve 7. Daha fazla işlem mikroveziküller ve ekzozomların daha fazla önkonsantrasyon elde etti. İşlem süresi 20 dakikaya ulaştığında mikroveziküller ve ekzozomlar 8 ve 9'lu katlara(Şekil 2A, 20 dk) odaklanmış ve floresan yoğunluklarına göre beş kat zenginleştirilmiştir(Şekil 2B, 20 dk).

Konsantrasyon öncesi işlemi tamamladıktan sonra, zenginleştirilmiş mikroveziküller ve ekzozomlar cihaz açılarak izole edildi ve 8. Zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların bütünlüğünü araştırmak için SEM görüntüleri elde edilmiştir. SEM görüntülerinde(Şekil 3A)gösterildiği gibi, zenginleştirme işleminden sonra önemli ölçüde daha fazla hasarsız mikrovezikül ve ekzozom gözlenmiştir. Elde edilen SEM görüntüleri kullanılarak, zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların boyut dağılımı analiz edildi(Şekil 3B),ekzozomlar ve mikroveziküller 200 nm eşik çapına göre ayırt edildi. Başka bir deyişle, ekzozomların boyutu ortalama çapı 134 nm olan 95-195 nm ve ortalama çapı 315 nm olan 214-377 nm arasında değişmektedir.

Daha sonra, 6, 8 ve 10 katmanlarındaki örnek lem alanları üzerindeki zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların gerçek konsantrasyonu NTA tarafından analiz edildi. Zenginleştirmeden önce konsantrasyon ~ 2.24 x 1011 parçacıklar/mL katman 8(Şekil 3C, katman 8) idi. Zenginleştirmeden sonra, mikroveziküllerin ve ekzozomların ~5,58 faktörüyle önceden konsantre olduğunu gösteren , katman 8 'deFigure 3C~1.25 x 1012 partikül/mL idi. Diğer tabakalarda belirgin bir ön konsantrasyon gözlenmedi(Şekil 3C, katman 6 ve 10). Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar önerilen kağıt tabanlı cihaz mikrovezikülleri ve ekzozomları yaklaşık beş kat zenginleştirebileceğini göstermektedir.

Cihazın izolasyon verimliliği şu şekilde değerlendirilmiştir: Exo-PAD'in daralan tasarımı nedeniyle, 8 ve 9 katmanına göre barındırılabilen numune hacmi, 10 katmandaki toplam 15 μL numune hacminden ~2,2 μL'dir. Eğer tüm mikroveziküllerin ve ekzozomların katman 8 ve 9'da önceden konsantre olduğu ve hiçbirinin kaybedildiği ideal bir olgu varsayalım, o zaman ideal ön konsantrasyon faktörü ~6.8 (15 μL/2.2 μL = ~6.8) olmalıdır. Ancak, NTA(Şekil 3c)tarafından elde edilen deneysel ön konsantrasyon faktörü ~5.58 idi, bu da 1.22 mikrovezikülve ekzomların bir kısmının kizin veya kağıt matrisine nonspesifik bağlanma ile kaybedildiği anlamına gelir.
Equation 1
nerede 2.24 x 1012 parçacıklar /mL mikroveziküller ve ekzozomların ilk konsantrasyonudur. Bu hesaplamadan, Exo-PAD beklenen kayıp oranı yaklaşık% 18'dir; bu nedenle, izolasyon verimliliği yaklaşık% 82'dir. Bu, ultrasantrifüjün zayıf verimlerine (%5-%23) göre önemli bir gelişmedir.

Figure 1
Şekil 1: Montajdan işletmeye genel Exo-PAD yordamları. (A) Selüloz kağıt üzerinde hidrofobik balmumu baskı rehberlik etmek için yazılım tasarımı. (B) 120 °C'de 80 s fırında kuluçkadan sonra balmumu baskılı kağıt. (C) Tek tek cihazlar bir kesici kullanılarak kesilir. (D) Permsel membran çözeltisi en sol ve en sağ tabakalarda numune alanlarına bırakılır ve çözücü 70 °C'de 30 dk.(E) Baskılı Exo-PAD beyaz çizgiler boyunca ileri geri katlanır; tüm örnek alanlar böylece yakınsak bağlanır. (F) Numune alanına mikrovezikül ve ekzozom örneği yüklenir. (G) Cihazın ucuna iki akrilik bölme yerleştirilir ve küçük bağlayıcı klipslerle sabitlenir. (H) Akrilik bölmeler tampon çözeltisi ile doldurulur ve 30 V.(I)Cihaz önceden konsantre mikrovezikülleri ve ekzozomları izole etmek için cihaz açılır. (J) 8 ve 9. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Cihaz çalışması sırasında floresan olarak etiketlenmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların ve buna karşılık gelen floresan yoğunluklarının gözlemi. (A) Mikroveziküllerin ve ekzozomların hızlandırılmış gözlemi. Ölçek çubuğu = 5 mm. 20 dakika işleme ile, mikroveziküller ve ekzozomlar kuvvetle katmanları 8 ve 9, nerede (B) onlar yaklaşık beş kat ile zenginleştirilmiş oldu odaklanmıştır. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder (n = 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların analizi. (A) zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların bütünlüğünü gösteren SEM görüntüleri. Prekonsantrasyon dan sonra çok daha fazla mikrovezikül ve ekzozom gözlendi6. Ölçek çubuğu = 1 μm. (B) Zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların boyut dağılımı. Ekzozom boyutları 95−195 nm (ortalama çap = 134 nm) ve mikrovezikül boyutları 214−377 nm (ortalama çap = 315 nm) idi. (C) Zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların gerçek konsantrasyonu NTA kullanılarak değerlendirilir. Zenginleştirme den sonra, mikrovezikülve ekzozomların konsantrasyonu beş kat arttı, hangi floresansonuçlarıile tutarlı 6 . Hata çubukları standart sapmayı temsil eder (n = 3). Paneller A ve C Kim ve ark.6izni ile çoğaltılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Mikroveziküller ve ekzozomlar önceden konsantre ve katman 8 odaklanmış büyükbaş serum albumin (BSA), hangi katmanlar 1-3 kaldı ayrılmıştır. Please click here to download this file.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Exo-PAD mikroveziküllerin ve ekzozomların zenginleşmesi ve izolasyonu için başarılı bir şekilde kullanılmasına rağmen, birkaç kritik nokta dikkatle düşünülmelidir: 1) cihaz hazırlama sırasında fırın kuluçka süresi ve sıcaklığı, 2) işlem süresi, 3) değişen katman numaraları ve örnek alan çapları ile gerilim uygulaması ve 4) klinik numunelere uygulanabilirlik.

Protokolde verilen kuluçka süresi ve sıcaklığı, güvenilir bir cihaz imal etmek için optimize edilmiş koşullardır. Daha uzun kuluçka süreleri veya daha yüksek bir sıcaklık, baskılı balmumu aşırı yeniden akışı nedeniyle yakınsak tasarım bozulmasına neden olabilir. Bu, odaklanmış elektrik alan hatlarının oluşmasını engelleyecek ve böylece elektrokinetik zenginleştirme işlemi sırasında göç direncini artıracaktır.

İşlem süresi de maksimum zenginleştirme ve izolasyon için göz önünde bulundurulması gereken bir faktördür. İşlem süresi <20 dk daha az ön konsantrasyona neden olabilir çünkü mikrovezikül ve ekzozom göçüne izin vermek için yeterli zaman yoktur. Öte yandan, >20 dk'lık bir işlem süresi odaklama verimliliğini bozar ve zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların dağılmasını sağlar. Bu teste göre, 20 dk mikroveziküllerin ve ekzozomların maksimum zenginleşmesi ve izolasyonu için en iyi işlem süresidir.

Uygulanan gerilim göz önünde bulundurulması gereken bir diğer önemli faktördür. Bu protokolde, tabaka sayısı ve örnek alan çapları göz önünde bulundurularak, kararlı ön konsantrasyon ve izolasyon elde etmek için 30 V kullanılır. Cihazda bir ICP fenomeni oluşturulduğunda, işlem rejimi uygulanan gerilime göre üç ayrı bölgeye ayrılabilir: (1) ohmik, (2) sınırlayıcı ve (3) bölgeleriaşan bölgeler 6,15,16. Kararlı ön konsantrasyon ve izolasyon için cihaz, iyon tükenme zonunun oluşturulduğu ve mikroveziküllerin ve ekzozomların önceden konsantre edildiği sınırlayıcı bölgede çalıştırılmalıdır. Bu deneysel ayarda, çalışma gerilimaralığı (5−40 V) Exo-PAD için sınırlayıcı bölgeye karşılık gelir. Uygulanan gerilim <5 V ise, cihaz elektrik akımının doğrusal olarak arttığı ohmik bölgede çalışır ve ön konsantrasyon için iyon tükenme sazlığı olmadığını gösterir. Ancak, gerilim >40 V ise, iyon tükenme bölgesi, yoğun konsantrasyonu bozan güçlü voltaj tahrikli elektrokonveksiyon tarafından yok edilir. Bu faktörler göz önünde bulundurularak, 30 V'nin 12 katmanlı bir cihaz için en uygun voltaj olduğu ve örnek alan çapının 2−5 mm. Örnek hacmini büyütmek için katman numaraları veya örnek alan çaplarının artırılabildiği, ancak bu faktörlerin yanı sıra çalışma geriliminin de mikrovezikül ve ekzozomların istikrarlı bir şekilde zenginleşmesi için optimize edilmesi gerektiği belirlenmiştir.

Önerilen Exo-PAD tükürük, idrar, serum ve plazma gibi çeşitli klinik örneklerden mikrovezikülleri ve ekzozomları izole etmek için kullanılabilir. Tükürük veya idrar gibi daha az proteiniçeren numuneler için mikroveziküller ve ekzozomlar büyük değişiklikler olmadan kolayca izole edilebilir, çünkü bu numunelerde az miktarda protein kağıda spesifik olmayan bağlanma yoluyla filtrelenir. Cihazı sınırlayıcı bölge içinde çalıştırırken, numunelerin iyonik mukavemeti farklı olabileceğinden, yalnızca uygulanan gerilimin göz önünde bulundurulması gerekir. Serum veya plazma gibi protein açısından zengin örnekler için hem mikroveziküllerin ve ekzozomların ön konsantrasyonu hem de bol proteinden ayrılması dikkatle düşünülmelidir. Son denememiz, karbonat tamponu kullanıldığında mikroveziküllerin ve ekzozomların proteinlerden ayrılmasının önemli ölçüde iyileştiğini göstermektedir, çünkü karbonat tamponu izoelektrik nokta nedeniyle mikroveziküller ile ekzozomlar ile protein arasında daha yüksek elektrik yükü farkı ile sonuçlanmaktadır ve bu da daha iyi ayırma verimi sağlar. Bu deney için, mikroveziküller ve ekzozomlarla birlikte bol proteiniçeren bir madde, fitc (Ex/Em: 490/520 nm) ile etiketlenmiş saflaştırılmış mikroveziküller ve ekzozomların karıştırılarak farklı bir florofor (Ex/Em: 590/617 nm) ile etiketlenmiş olarak 50 mM karbonat tampon(Malzeme Tablosu)ile taklit edilmiştir. Ek Şekil 1'degösterildiği gibi, mikroveziküllerin ve ekzozomların çoğu Şekil 2A'da olduğu gibi 8. Bu sonuç, bir serum veya plazma örneğinden elde edilen zenginleştirmenin numuneye karbonat tamponu ekleyerek ek bir adım gerektirdiğini göstermektedir ve Exo-PAD'in bol proteinlerden mikrovezikülleri ve ekzozomları arındırabileceğini açıkça göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Kore Ulusal Araştırma Vakfı Grant NRF-2018R1D1A1A09084044 tarafından desteklenmiştir. J. H. Lee, 2019 yılında Kwangwoon Üniversitesi'nden bir araştırma bursu ile desteklenmiştir. Hyerin Kim, Kore Ticaret, Sanayi ve Enerji Bakanlığı'nın (MOTIE) Kore Teknoloji Geliştirme Enstitüsü (KIAT) tarafından işletilen "Endüstri Uzmanları için Yetkinlik Geliştirme Programı" tarafından desteklendi. P0002397, Giyilebilir Akıllı Cihazların Endüstriyel Yakınsaması için HRD programı).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl electrodes A-M Systems, Inc. 531500 0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13101 BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer Sigma-Aldrich C3041-50CAP Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada) Corel Corporation Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870 Xerox Corporation Wax printer
Chromatography paper grade 1 Whatman 3001-861 Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards HansaBioMed Life Sciences, Ltd. HBM-F-PEP-100 Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter Keithley Instruments, Inc. Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution Sigma-Aldrich 31175-20-9 Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10 NanoSight Technology Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) Thermo Fisher Scientific 10010001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14, (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17, (21), 3558-3577 (2017).
  3. Simons, M., Raposo, G. Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21, (4), 575-581 (2009).
  4. Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34, (1), 11-30 (2019).
  5. Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).
  6. Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19, (23), 3917-3921 (2019).
  7. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200, (4), 373-383 (2013).
  8. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
  9. Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11, (7), 6968-6976 (2017).
  10. Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39, (15), 2029-2038 (2018).
  11. Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  12. Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18, (10), 3175 (2018).
  13. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, (1), 1-11 (2015).
  14. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  15. Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91, (16), 10744-10749 (2019).
  16. Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16, (5), 925-931 (2016).
Mikrovezikül ve Ekzozomların Kağıt Bazlı Preconcentration ve İzolasyonları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).More

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter