Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא להזריק רודמין מצומד אקטין כדורי לתוך עוברים Drosophila ואת התמונה הרכבה מוט actin תוך גרעיני בעקבות עומס חום.
Abstract
מטרת פרוטוקול זה היא לדמיין מוטות אקטין תוך-גרעיניים המתכנסים בעוברים חיים של דרוזופילה מלנוגאסטר בעקבות עומס חום. מוטות אקטין הם סימן היכר של תגובת מתח Actin שמורה ובלתי ניתנת להכנעה (ASR) המלווה פתולוגיות אנושיות, כולל מחלה נוירודגנרטיבית. בעבר, הראינו כי ASR תורם כשלים morphogenesis וכדאיות מופחתת של פיתוח עוברים. פרוטוקול זה מאפשר את המשך המחקר של מנגנונים שבבסיס הרכבת מוט actin ו ASR במערכת מודל כי הוא מאוד נוח הדמיה, גנטיקה וביוכימיה. עוברים נאספים ומורכבים על כיסוי כדי להכין אותם להזרקה. אקטין כדורי מצומד רודמין (G-actinאדום)מדולל וטעון לתוך microneedle. זריקה אחת נעשית למרכזו של כל עובר. לאחר ההזרקה, העוברים הם דגירה בטמפרטורה גבוהה מוטות actin תוך גרעיניים הם דמיינו לאחר מכן על ידי מיקרוסקופיה confocal. התאוששות פלואורסצנטית לאחר ניסויים photobleaching (FRAP) ניתן לבצע על מוטות actin; ומבנים אחרים עשירים באקטין בציטופלסמה יכולים גם הם להדמיינו. אנו מוצאים כי G-actinאדום polymerizes כמו G-actin אנדוגני ואינו, בכוחות עצמו, להפריע להתפתחות העובר נורמלי. מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא כי יש לנקוט טיפול במהלך ההזרקה, כדי למנוע פגיעה חמורה בעובר. עם זאת, עם תרגול, הזרקת G-actinאדום לתוך עוברים Drosophila היא דרך מהירה ואמינה לדמיין מוטות actin והוא יכול לשמש בקלות עם זבובים של כל גנוטיפ או עם כניסתה של לחצים הסלולר אחרים, כולל היפוקסיה ומתח חמצוני.
Introduction
פרוטוקול זה מתאר כיצד להזריק G-actinאדום כדי לדמיין את ההרכבה של מוטות actin תוך גרעיני בעוברים לחוצים חום שעוברים תגובת מתח Actin בלתי ניתנת לערעור (ASR)1. פיתחנו פרוטוקול זה כדי לסייע במחקרים של ASR, אשר בעוברים מוביל מורפוגנזה משובשת וכדאיות מופחתת, ובסוגי תאים אנושיים בוגרים קשורה פתולוגיות כולל אי ספיקת כליות2, מיופתיות שרירים3, אלצהיימר ומחלת הנטינגטון4,5,6,7,8. זה ASR הוא המושרה על ידי לחצים תאיים רבים, כולל הלם חום9,10,11, מתח חמצוני4,6, סינתזת ATPמופחתת 12, ו האנטינטין חריג או אוליגומריזציה עמילואיד β4,5,6,7,9,13,14,15,16. סימן ההיכר של ASR הוא הרכבה של מוטות אקטין חריגים בציטופלסמה או בגרעין של תאים מושפעים, המונע על ידי היפראקטיביות הנגרמת על ידי מתח של חלבון אינטראקציה actin, Cofilin1,5,6,10. למרבה הצער, פערי ידע מרכזיים נשארים לגבי ASR. לדוגמה, הפונקציה של מוטות actin אינו ידוע. איננו מבינים מדוע מוטות נוצרים בציטופלסמה של סוגים מסוימים של תאים, אלא בגרעין של אחרים. כמו כן לא ברור אם ASR הוא מגן או לא מתאים עבור תאים או עוברים שעברו מתח. לבסוף, אנחנו עדיין לא יודעים את המנגנונים המפורטים שבבסיס היפראקטיביות Cofilin או הרכבה מוט actin. לפיכך, פרוטוקול זה מספק בדיקה מהירה ורב-תכליתית כדי לחקור את ASR על ידי הדמיה היווצרות מוט actin ודינמיקה במערכת ניסיונית ניתנת להפעלה מאוד של עובר זבוב הפירות החי.
הפרוטוקול כדי microinject G-actinאדום לתוך עוברים חיים Drosophila פותחה בתחילה כדי ללמוד את הדינמיקה של מבנים נורמליים cytoplasmic actin17 במהלך אירועי בניית רקמות. במחקרים אלה, מצאנו כיהזרקת אדום G-actin לא השפיעה לרעה על תהליכים התפתחותיים מוקדמים בעובר, כולל ציטוקינזיס או גסטריולציה17,18. לאחר מכן שינינו את הפרוטוקול, התאמת הטיפול בעוברוהזרקת אדום G-actin כדי לאפשר הדמיה של מוטות actin בחום עוברים ASR1. שיטות אחרות מלבדהזרקת אדום G-actin ניתן להשתמש כדי לדמיין actin בעוברים. שיטות אלה מסתמכות על ביטוי חלבונים פלואורסצנטיים (FPs) המתויגים לפעול או לתחומים של חלבונים מחייבים actin, כגון Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP, ו Moesin-GFP (נבדק בשנת19). עם זאת, באמצעות בדיקות FP אלה דורש זהירות כי הם יכולים לייצב או לשבש כמה מבנים actin, לא באותה מידה תווית כל מבני actin20, ובמקרה של actin-GFP, הם מוגזמים מאוד – בעייתי לניתוח של הרכבת מוט אשר לא רק תלוי מתח אלא גם actin ריכוז תלוי1. לכן, G-actinאדום הוא החללית המועדפת על מחקרי מוט בעוברים לעוף, ואת הגודל הגדול של העובר מאפשר הזרקה קלה שלה.
זרימת העבודה של פרוטוקול זה דומה לטכניקות microinjection מבוססות אחרות ששימשו להזרקת חלבונים, חומצות גרעין, תרופות, אינדיקטורים פלואורסצנטיים לתוך עוברי Drosophila 21,22,23,24,25,26,27. עם זאת, בעקבות microinjection של אדום G-actin כאן, עוברים נחשפים ללחץ חום קל כדי לגרום ASR והרכבה מוט actin תוך-גרעיני. עבור מעבדות עם גישה זבובים אסדת הזרקה, שיטה זו צריכה להיות מיושמת בקלות להתאמה עבור קווי לימוד ספציפיים לגבי ASR, כולל אינדוקציה שלה על ידי לחצים שונים או אפנון ברקעים גנטיים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת כוסות איסוף עוברים וצלחות אגר מיץ תפוחים
- חמישה ימים לפני ניסוי ההזרקה, לבנות28 או לרכוש לפחות שתי כוסות אוסף עוברים קטנים. הפוך טרי 60 מ"מ מיץ תפוחים צלחות אגר לשמש עם כוסות אוסף קטנות28. יש לאחסן צלחות בקופסאות פלסטיק מכוסות במגבות נייר לחות ב-4 מעלות צלזיוס.
הערה: כוסות איסוף עוברים קטנות, המאוכלסות במספרי זבובים כמתואר בשלב 1.3, יספקו מספרי עוברים מספיקים לכל ניסוי, תוך הקפדה על טיפול והזרקת עוברים תוך זמן קצר מספיק כדי לאפשר הדמיה של שלבים התפתחותיים מוקדמים. - צלחות מיץ תפוחים חמות עד 18 מעלות צלזיוס ומוסיפים טיפה של משחת שמרים למרכז הצלחת. משחת שמרים היא הדבק פשוט של שמרים פעילים ומים מזוקקים.
- כדי לקדם את הטלת הביצים הנדיבה ביותר, הקימו כוסות איסוף עם זבובים יומיים לפני הניסוי. מוסיפים לפחות 100 נקבות ו-50 זבובים זכרים ל כוסות האיסוף, ומעליהם צלחת מיץ תפוחים מוכנה(איור 1,שלב 1). בימים שלפני ניסוי ההזרקה לשנות את צלחות מיץ תפוחים לפחות פעמיים בכל יום, פעם בבוקר ופעם בערב.
הערה: תוצאות ההזרקה וההדמיה הטובות ביותר מתקבלות כאשר כוסות איסוף העובר נשמרות ב 18 °C (69 °F) עם אור 12 שעות על / מחזור כיבוי אור.
2. הכן פתרון מלאי עובד של אדום G-actin עבור microinjection
הערה: הכנה זו עושה רק 2 μL של 5 מ"ג / מ"ל עובד מלאי של G-actinאדום, כך שאם משתמשים אינם מורגלים טכניקת microinjection, זה יתרון לדלג לשלב 3 ולתרגל את microinjections עם מאגר pH ניטרלי כדי לשמר מלאי עבודה יקר. מלאי 10 מיקרוגרם של אדום G-actin מהספק ניתן לאחסן באריזתו המקורית בצנצנת 16 עוז העליון בורג עם ~ 500 גרם של יבוש ב 4 °C (6 °F) עד 6 חודשים.
- הכן פתרון מלאי G-buffer מראש: 5 mM Tris-HCl, 0.2 mM CaCl2, pH 8.0. מסננים ומאחסנים בטמפרטורת החדר.
- ביום של זריקות, להכין 1 מ"ל של פתרון עבודה G-buffer בצינור microcentrifuge כובע הצמד טרי על הקרח באמצעות מלאי G-buffer משלב 2.1, בתוספת הדברים הבאים בריכוזים הסופיים המצוין: 1 mM dithiothreitol (DTT) ו 0.2 mM ATP, pH 8.0.
הערה: נפח 1 מ"ל של פתרון עבודה G-buffer הוא יותר ממה שנדרש לניסוי אבל מפשט את ההכנה. עודף יכול להימחק לאחר הניסוי או שמשתמשים יכולים לצמצם בהתאם להעדפותיהם.- שמירה על 10 מיקרוגרם G-actin מלאיאדום על קרח, הראשון להוסיף 1 μL של מים מסוננים, מזוקקים לחלק העליון של טיפה ורודה של אדום G-actin בתוך הצינור.
- לאחר מכן, הוסף μL אחד של פתרון העבודה קר, טרי מוכן G-buffer משלב 2.2. Pipet למעלה ולמטה ~ 20 פעמים כדי לערבב היטב עם נפח פיפטה מוגדר 1 μL. מניית G-actinאדום יהיה עכשיו בדילול הסופי של 5 מ"ג / מ"ל.
- דגירה G-actinאדום מוכן במשך 30 דקות על קרח באין מפריע.
- צנטריפוגה G-actinאדום מוכן ב 16,000 x g במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס במיקרוצנטריפוגה כדי להסיר כל משקעים.
- בזהירות pipet 1.5 μL של supernatant לתוך צינור microcentrifuge כובע הצמד טרי על הקרח, הימנעות גלולה ורוד כהה.
- לאחסן את G-actinאדום supernatant מוכן על הקרח עד 6 שעות עד מוכן לטעון לתוך microneedle.
הערה: Microneedles ניתן למשוך מצינורות נימי מראש על מושך micropipette, ולאחר מכן מאוחסן בטמפרטורת החדר על רצועה של חימר דוגמנות בצלחת פטרי 100 x 20 מ"מ. פרמטרים מוצעים למשיכת מיקרונידל ניתן למצוא בספר הבישול פיפט29.
3. לאסוף עוברים ולהרכיב להזרקה
- אפשר זבובים להניח עוברים במשך 30 דקות על צלחות מיץ תפוחים עם משחת שמרים ב 18 מעלות צלזיוס.
- בעוד זבובים מניחים, מחממים מראש צלחת אגר מיץ תפוחים ללא משחת שמרים לטמפרטורת החדר, חותכים טריז מלבני של 4 ס"מ x 1 ס"מ של מיץ תפוחים אגר עם סכין גילוח, ומניחים על מגלשת זכוכית 25 מ"מ x 75 מ"מ.
- צלחת הקציר מהאוסף של 30 דקות ועוברים דקוריונטים על ידי שפיכת אקונומיקה טרייה, מדוללת 1:1 עם מים מזוקקים, על הצלחת ומסתחררת את הצלחת במשך דקה אחת, כמתוארב-28 (איור 1,שלב 2).
הערה: מותגים שונים של אקונומיקה נמכרים בריכוזים שונים. אקונומיקה המשמש כאן הוא 6% hypochlorite נתרן מהבקבוק והוא מדולל לריכוז הסופי של 3% hypochlorite נתרן. מותגי אקונומיקה אחרים בריכוזים מעט נמוכים יותר יעבדו טוב באותה מידה. - יוצקים את האקונומיקה והעוברים המופקרים לסל איסוף (מסננת תאים של 70 מיקרומטר) ושוטפים את הצלחת פעמיים במים מזוקקים מבקבוק גמירה, ומוסיפים את השטיפות האלה לסל האיסוף.
- שוטפים במרץ את העוברים המנוכרים בסל האיסוף במים מזוקקים עד שלא ניתן לראות גושי שמרים והסל אינו משאיר סימנים ורודים מאקונומיקה עודפת כאשר הם נמחקים על מגבת נייר.
- צלחת הקציר מהאוסף של 30 דקות ועוברים דקוריונטים על ידי שפיכת אקונומיקה טרייה, מדוללת 1:1 עם מים מזוקקים, על הצלחת ומסתחררת את הצלחת במשך דקה אחת, כמתוארב-28 (איור 1,שלב 2).
- באמצעות מברשת צבע עם זיפים מעומעמים במים מזוקקים, מעבירים עוברים דקוריונים ושטופים מסל האיסוף אל טריז מיץ התפוחים המוכן על מגלשת הזכוכית.
- השתמשו בזוג פינצטה עדינה או במחט מנתחת כדי לסדר עשרה עוברים בקו ישר לאורך הציר הארוך של טריז אגר המלבני(איור 1, שלב 3). מסדרים את העוברים ראש אל זנב, כך שהקוטב הקדמי שלהם פונה ימינה וצד הגב פונה אל החוקר (איור 1, שלב 3, מוגדל).
- חותכים 0.5 ס"מ מקצה קצה פיפטה P200 עם סכין גילוח וטובלים לתוך "דבק העובר" (המתואר ב-28). מצפים בנדיבות אזור ברוחב 5 מ"מ (איור 1, שלב 4)לאורך הקצה הארוך של כיסוי מלבני בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ, ומניחים לצד יבש ודבק כלפי מעלה. ייבוש ייקח ~ 30 s והוא שלם פעם את כל האזור מצופה דבק מופיע מט ולא רטוב או מבריק.
הערה: הכינו "דבק עובר" לפחות 48 שעות מראש. הוסף n-Heptane לרצועות של קלטת דו צדדית בבקבוקון נצנצים כמתואר ב28. - לאחר "דבק העובר" התייבש, בעדינות למקם את הצד דבק coverslip למטה על גבי השורה של עוברים מיושר על אגר, משאיר 2-3 מ"מ של רווח בין קצה הכיסוי לבין שורת העוברים.
הערה: הדבקת העוברים קרוב מדי לקצה הכיסוי עלולה להוביל לכך שהעוברים יתייבשו יותר מדי במהלך הניסוי. - הפוך את הכיסוי כך שהעוברים פונים כעת כלפי מעלה. הם צריכים להיתקע בשורה לאורך קצה אחד ארוך של הכיסוי, והאזור הגחוני שלהם פונה לקצה הקרוב ביותר של הכיסוי (איור 1,שלב 4, מוגדל).
- לייבש את העוברים על ידי הנחת כיסוי עם עוברים בעדינות על גבי 150 גרם של יבוש כחול טרי מאוחסן בצנצנת 16 עוז בורג העליון. בורג חזק על המכסה והדגירה למשך 8-10 דקות(איור 1, שלב 5).
- לאחר התייבשות, הסירו את הכיסוי מצנצנת הייבוש והקלטת כל צד קצר של הקליפה למגלשת מיקרוסקופ, צד העובר כלפי מעלה, עם שתי חתיכות 4 ס"מ2 של סרט הדבקה דו-צדדי, כך שכיסוי העובר יתאים לשלב ההזרקה (איור 1, שלב6).
- הוסיפו 2-3 טיפות שמן Halocarbon 27 עם פיפט פסטר כדי לכסות את העוברים המיושרים ולהגן עליהם מפני התייבשות נוספת(איור 1, שלב 6).
4. להזריק ולחמם עוברי מתח כדי לקדם היווצרות מוט actin
הערה: כל הזריקות נעשות בחדר מבוקר טמפרטורה ב 18 °C (60 °F).
- הכינו תאי דגירה לחים מצלחת פטרי מזכוכית בגודל של לפחות 100 מ"מ x 20 מ"מ ומרפדים את התא בפיתולים של מגבי רקמת מעבדה מעומעמים במים מזוקקים(איור 1,שלב 8). מחממים מראש את תאי הדגירה בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס או את טמפרטורת הדגירה הרצויה לפני הזרקת עוברים.
- פתח את שסתום זרימת האוויר עבור microinjector ולהדליק את microinjector (אוויר דחוס או אוויר הבית בלחץ של לפחות 90 psi מתאים).
- בעוד העוברים מתייבשים, טען לאחור את ה-G-actinRed supernatant שהוכן קודם לכן לתוך המיקרונידל באמצעות קצה מטעין מיקרו. הגדר את הפיפט כדי לצייר 1-1.5 μL.
הערה: בגלל הצמיגות של actin, טעינת כרכים לא יכול להיות מדויק וייתכן שיש מספיק actin עזב לטעון לפחות אחד עד שני microneedles יותר. ניתן להזריק עד 60 עוברים לכל מיקרונידל טעון אם המיקרונידל מכויל כראוי ואינו סתום במהלך הניסוי. - חבר את המיקרונידל למחזיק המחט והדק את הבורג. חבר את צינור האוויר למיקרו-יין וודא שהלחץ על הזרימה האחורית על המיקרונידל שווה ל-30 hPa.
- כייל את הגדרות microinjector לגרש בועה בקוטר 100 מיקרומטר של אדום G-actin (~ 500 pL) על מיקרומטר שקופית. לסובב את ידית הלחץ (500-1500 hPa) ואת ידית זמן הדופק הזרקה (0.1-0.5 s) על microinjector כדי לקבל את גודל הבועה הנכון. התאם הגדרות אלה בכל פעם שמיקרונידל חדש נטען כדי להסביר את השונות בצמיגות actin ובגודל קצה המיקרונידל.
הערה: אדום G-actin מוכן הוא צמיג וייתכן שיש אוויר בקצה microneedle כי צריך להיות מגורש לפני הזרקת עוברים. אם G-actinאדום אינו בקלות לגרש מקצה microneedle, בעדינות לשבור את קצה microneedle נגד קצה של מיקרומטר שקופית. - הנח את השקופית עם עוברים רכובים על במת המיקרוסקופ.
הערה: כל זריקה להגדיר יהיה שונה, כך החוקרים יצטרכו להתאים את שיטת ההזרקה שלהם בהתאם. כאן העוברים מועברים ביחס למיקרונידל נייח, מזריקים כל עובר על ידי הפעלת העובר לתוך המיקרונידל. - כוונן את שלב המיקרו-מניפולטור והתמקד במטרה 10x במיקרוסקופ האור כך שהעוברים יהיו גלויים. העוברים נמצאים במישור המוקד הנכון כאשר קווי המתאר של קרום הויטליין הם החדים ביותר והעובר נראה הגדול ביותר. בחר עוברים להזריק כי הם בשלב ההתפתחותי הנכון, כך שעד הדגירה שלאחר ההזרקה הושלמה, רוב המצמד מגיע לשלב ההתפתחותי הרצוי (למשל, להזריק עוברים בשלב 2-330 של Bownes על מנת לצפות מוטות ב cellization לאחר עומס חום ב 32 מעלות צלזיוס).
- השתמש בפקדי microneedle כדי להביא את המחט לאותו מישור מוקד כמו העוברים.
הערה: אם microneedle תופס על כריכה בעת הזזת הבמה או microneedle, אז microneedle קרוב מדי לשקופית והוא לא במישור המוקד הנכון. המיקרונידל צריך להיות מקביל לכיסוי, ולא בזווית משמעותית (איור 1, שלב 7). - הכנס את המיקרונידל לעובר כך שהוא יפגע בעובר באמצע אזור הגחון שלו, בעובר "קו המשווה". הזרקת טריגר עם דוושת כף הרגל או כפתור "הזרקה" כאשר קצה המיקרונידל נראה באמצע העובר (איור 1, שלב 7).
- להזריק את G-actinאדום פעם אחת לאט להסיר את microneedle. להזיז את הבמה ולחזור על כל עובר של השלב ההתפתחותי המתאים.
הערה: הרחבת העובר היא נורמלית כמו אדום G-actin מוזרק קצת ציטופלסמה עלולה לדלוף מתוך העובר. - לאחר שכל העוברים הוזרקו, הנח את המגלשה עם העוברים בתא הדגירה הלח המוכן וסגור את המכסה (איור 1, שלב 8). אם מנסים להשיג עוברים שמגיעים לתאליזציה, החום מדגיש את העוברים ב 32 מעלות צלזיוס במשך 60-75 דקות בתא הדגירה הלח.
הערה: זמני הדגירה מצוינים המאפשרים הדמיה של מוטות בהבאת עוברים הדגיש חום. זמן הדגירה יהיה ארוך יותר עבור עוברים שאינם בקרת מתח חום כי הפיתוח יהיה איטי יותר בטמפרטורה נמוכה יותר31. עוברי בקרה אלה יכולים להיות דגירה בתאים לחים בטמפרטורות כגון 18 °C (69 °F) או 25 °C (69 °F), בהתאם לעיצוב הניסוי הספציפי ואת השאלה שיש לשאול. זמן הדגירה המינימלי הדרוש עבור אדום G-actin להתפזר לאורך העובר הוא 30 דקות.
5. מוטות אקטין תמונה בחום עוברים הדגיש על ידי מיקרוסקופיה confocal
- בזמן שהעוברים לחוצים בחום, הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקאלי ובחר את ערוץ הלייזר 561 ננומטר.
- הזז את העדשה האובייקטיבית (מומלץ 25x, 40x או 63x) לעמדת העבודה.
- אם הדמיית חום הדגיש עוברים, ואז להגדיר את החממה שלב מחומם כדי להשיג טמפרטורה פנימית של 32 מעלות צלזיוס. מדחום נקודה וירה או אינפרא אדום יכול לשמש כדי לבדוק את הטמפרטורה ב או ליד המטרה.
- הסר את השקופית עם עוברים מוזרקים מתא הדגירה הלח לאחר השלמת הדגירה (איור 1, שלב 9).
- עבודה מהירה, בעדינות לחטט חתיכות קלטת דו צדדית ששימשו לדבוק כיסוי עם עוברים רכובים לשקופית (איור 1, שלב 9).
התראה: היה עדין במהלך שלבים אלה, שכן כיסויים יכולים להתנפץ בקלות אם מופעל כוח רב מדי. - תדביקו יחד שתי חתיכות באורך 2.5 ס"מ של סרט הדבקה דו-צדדי ותחתכו את הסרט לחצי לאורך כדי ליצור שתי רצועות, באורך 2.5 x 0.5 ס"מ(איור 1,שלב 10).
- מקל שני שלישים של האורך של כל רצועת קלטת על כריכה הראשונה, אגף כל צד של העוברים ב Halocarbon 27 שמן (איור 1,שלב 10, כתום),משאיר שליש רצועות קלטת תלוי מקצה הכיסוי הראשון שבו העוברים תקועים. השתמש בידיים כפפה והיזהר לא לגעת בעוברים במהלך שלב זה.
- מניחים בעדינות כיסוי מלבני שני על גבי רצועות הסרט כדי לכרוך את העוברים בין העטיפות(איור 1,שלב 10, כחול). יישר את הקצוות של 25 מ"מ אך שמור על היסט הקצוות של 50 מ"מ זה מזה ברוחב של 1 ס"מ.
הערה: המשטח המלא של ה-coverslip השני יהפוך למשטח ההדמיה החדש שיפנה לעדשה האובייקטיבית, לכן הקפידו לא לקבל טביעות אצבעות או שמן Halocarbon 27 על משטח הכיסוי השני . הקיזוז נחוץ כדי שניתן יהיר להוסיף שמן Halocarbon 27 נוסף כדי לטבול באופן שווה את העוברים. במידת הצורך, הוסיפו שמן Halocarbon 27 בתפר שבו שני הכיסויים נפגשים בחלק העליון של הכריך והוא יצפה את העוברים בפעולה נימית (ראו קווים מקווקווים באיור 1, שלב 10). - הקש בעדינות על אזורי הכיסוי שנמצאים ישירות על גבי רצועות הסרט עם הצד הקהה של razorblade כדי לקבל את הכיסוי לדבוק בקלטת.
- הופכים את כריך הכיסוי ומניחים על מגב רקמת מעבדה כדי לשמור על משטח ההדמיה נקי ולשאת למיקרוסקופ הקונפוקלי(איור 1, שלב 11). ודא שהקלטת דבוקה לחלוטין לשני החלקים לפני ההדמיה.
- ודא כי השלב מחומם הוא בטמפרטורה ואם באמצעות מיקרוסקופ הפוך, להוסיף נוזל טבילה על העדשה המטרה שנבחרה.
- הניחו את כריך ה-coverslip על הבמה בזהירות כדי להבטיח שמשטח ההדמיה החדש (2nd coverslip) הוא זה שנוגע בנוזל הטבילה(איור 1, שלב 11).
הערה: במידת הצורך, לדבוק כריך coverslip לבמה עם שתי חתיכות קטנות של סרט דו צדדי כדי למנוע תנועה מיותרת במהלך ההדמיה אם coverslips אינם מתאימים היטב בשלב מחומם. - התמקדו בעובר שנמצא בתווית (Bownes שלב 4a30) או בשלב ההתפתחותי הרצוי באמצעות אור משודר או פלואורסצנטיות.
- לאחר העובר הובא לפוקוס, לעבור למצב רכישת לייזר על מיקרוסקופ confocal ולהתאים כוח לייזר ורווח, גודל מסגרת, ריצוף, הגדרות הקרנה לפי הצורך.
- קח תמונות פני השטח דרך מישורי המוקד של הגרעינים של העובר כדי למצוא מוטות אקטין תוך-גרעיניים. מוטות אמורים להופיע בכיוונים מרובים כפסים בהירים או כנקודות בתוך הגרעינים הכהים יחסית(איור 2A, 2C).
6. ניסויי הדמיה אלטרנטיביים
- בצע FRAP כדי לחקור תחלופת actin לאורך מוטות actin תוך-גרעיניים או במבנים actin ציטופלסמי, כגון קצות תלמי קרום הפלזמה במהלך הסלולר.
- בתוכנת ההדמיה, בחר אזור מלבני סביב טיפים תלמים או מוטות actin שבו לרכוש את הניסוי.
- בחר אזור מרובע קטן של מרכז מוט actin בתוך אזור הרכישה המלבנית כדי להלבין. ודא כי קצות מוט actin גלויים ולא לקבל מולבן במהלך הניסוי כדי לאפשר מעקב מדויק של המוט בתוך הגרעין.
- הגדר את לייזר אקונומיקה כדי לחזור 50x ולהגדיר את כוח לייזר אקונומיקה למקסימום.
- בחר קורס זמן כדי לרכוש תמונות בכל שנייה עבור סך של עד 120 שניות במהירות מקסימלית של השתהות פיקסלים והגדר את הלייזר להלבין לאחר שתי השניות הראשונות של רכישת התמונה.
- לכמת את הנתונים כדי לקבוע את המחצית של התאוששות פלואורסצנטיות1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זרימת עבודה סכמטית של טיפול בעובר מתוארת באיור 1, ולוח זמנים לניסוי טיפוסי מוצג בטבלה 1. הערכה לתוצאה ניסיונית טובה היא שעל כל 10 עוברים שהוזרקו, לפחות מחצית מהעוברים שנצפו יהיו בשלב ההתפתחותי הנכון, לא ניזוקו, ויפגינו ASR חזק עם עומס חום ב 32 מעלות צלזיוס. ASR זה יתגלה על ידי הרכבה של מוטות אקטין תוך-גרעיניים כפי שמוצג בתמונת תצוגת פני השטח הייצוגית של עובר באיור 2A (לוח ימני). מוטות אקטין יופיעו במספר כיוונים (מקבילים או בניצב למישור ההדמיה) בתוך הגרעינים וניתן לדמיין באמצעות מספר מישורי מוקד. לשם השוואה, עוברי בקרה המודגרים ב-18°C לא יציגו מוטות אקטין(איור 2A, פאנל שמאלי). ניתן לכמת את אחוז הגרעינים המכילים מוטות, כפי שמודגם באיור 2B. בנוסף, ניתן לבצע ניסויי FRAP על מוטות (איור 2C). שיטת כימות מוצעת לנתוני FRAP מוזכרתב- 1 ודוגמה של עלילה לשחזור פלואורסצנטי עבור אזור מולבן לעומת לא מזוהם של מוט אקטין מוצגת באיור 2D.
אם עובר ניזוק קשות על ידי הזרקה או הופך יבש מדי במהלך הניסוי, אסינכרוניה מיטוטית עשויה להיות נצפית ותאיות ישובש. לפעמים, מוטות לא יכול להיות גלוי בגלל כישלון לקבל מספיק actin מוזרק לתוך העובר. אם זה קורה, ודא כי כמות G-actinאדום מוזרק הוא 500 pL (נמדד עם מיקרומטר בשלב 4.5) ולאשר כי כמות זו נשארת עקבית בין עוברים על ידי ביצוע הזרקת מבחן לתוך השמן שמסביב כדי לבדוק את גודל הבועההאדומה G-actin בין כל microinjection עובר. בנוסף, כדי להבטיח הדמיה מוט, לעבוד במהירות כדי להוסיף את coverslip ולהעביר את העוברים לשלב מיקרוסקופ מחומם ברגע שהם נלקחים מן התא לח בשלב 5.4, כמו הרכבת מוט הוא הפיך1 מוטות יכולים לפרק אם העוברים נשמרים בטמפרטורה פחות מ 32 מעלות צלזיוס במשך יותר מ 30 דקות.
איור 1: סקירה סכמטית של טיפול בעובר במהלך הניסוי. (1)זבובים בוגרים ב כוסות איסוף עוברים מניחים עוברים על צלחות אגר מיץ תפוחים. (2)העוברים הם dechorionated עם אקונומיקה 1:1: מים מזוקקים, נשפך לתוך סל אוסף, ונשטף ביסודיות עם מים מזוקקים כדי להסיר אקונומיקה ופסולת. (3)עוברים מועברים עם מכחול טריז מיץ תפוחים מלבני אגר על שקופית מסודרים על הצדדים שלהם, ראש אל זנב, עם אזור הגב מול קצה האגר. (4) אזור 5 x 50 מ"מ של כיסוי זכוכית (כתום) מצופה "דבק עובר" ולחוץ בעדינות על שורת העוברים מסודרים על האגר לדבוק אותם כיסוי. (5)הכיסוי עם עוברים הוא הפוך, כך העוברים עם הפנים כלפי מעלה. העוברים מיובשים בצנצנת עליונה של בורג. (6) מיד לאחר התייבשות, הכיסוי מודבק למגלשה, עוברים פונים כלפי מעלה, ועוברים מכוסים בשמן Halocarbon 27. (7) microneedle טעון בעבר עם אדום G-actin מוכן משמש כדי להפוך זריקה אחת למרכז אזור הגחון של כל עובר, עם מחט ממוקם במקביל coverslip. (8) לאחר ההזרקה, העוברים הם דגירה בתוך צלחת פטרי לח עם מגבים רקמת מעבדה לחה בטמפרטורת הבקרה (18 °C (18 °F) או עם עומס חום (32 °C (32 °F). (9) לאחר הדגירה, הכיסוי עם העוברים עליו מוסר מהמגלשה. (10)שתי חתיכות של סרט דו צדדי הם שכבות אחד על גבי השני, פרוסים לחצי לאורך, וממוקם משני צדי השמן המקיף את העוברים על כריכה הראשונה. כיסוי שני (כחול) ממוקם על גבי הראשון כדי ליצור משטח הדמיה חדש, לקזז כך שהוא משאיר פער עבור שמן נוסף להתווסף כדי לכסות את העוברים לפי הצורך. (11) אם הדמיה על מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, כריך כריכה הוא הפוך כך כיסוי השני פונה אל המטרה. ההדמיה נעשית בתא דגירה, ומוטות אקטין מוצגים על פני מספר מישורי מוקד של גרעיני כל עובר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאות מייצגות של מוטות אקטין בעוברים לחוצים בחום. (A)מוטות Actin אינם נראים בעובר כי היה דגירה בטמפרטורת הבקרה של 18 °C (לוח שמאל), אבל נראים בגרעינים של עובר שהיה לחוץ בחום ב 32 °C (לוח ימין). (B)כימות אחוז הגרעינים עם מוטות אקטין מניסוי מייצג. כל נקודה מייצגת עובר אחד שבו מוטות וגרעינים נספרו בכל האזור המצולם (n = 22 עוברים ב 18 °C (70 °F; n = 23 עוברים ב 32 °C (70 °F; מוטות שגיאה מראים סטיית תקן). מבחן t של סטודנט, עם שונות לא שוויונית, שימש לחישוב ערך p. (C)סדרת זמנים מייצגת מציגה FRAP על מוט אקטין. החלק של המוט שהולבין מצוין על ידי ראש חץ לבן. טרום אקונומיקה היא 2 s לפני שלב אקונומיקה. זמן = 0 s הוא צעד אקונומיקה, והתאוששות פלואורסצנטיות היה במעקב עד 60 s פוסט אקונומיקה. (D) עלילה מראה דינמיקת התאוששות עבור פלואורסצנטיות actin באזור מולבן של מוט, לעומת אזור unbleached באותו מוט. מוטות יציבים להפליא ו actin בתוכם אינו מחזור. לכן, לא נראה התאוששות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: זרימת עבודה ניסיונית עם לוח זמנים מוצע. לוח זמנים זה מסכם את הזמן הצפוי שיידרש להשלמת כל שלב בפרוטוקול.
| סדר | שלב | זמן נדרש עבור כל שלב | תיאור |
| 1 | 1.1 | 5 ימים מראש | הפוך כלובי איסוף עוברים. יוצקים צלחות אגר מיץ תפוחים. |
| 2 | 1.2-1.3 | יומיים מראש | להקים כלובי איסוף עם זבובים זכר ונקבה בוגרים. |
| 3 | 2.6 הערה | יום אחד מראש | משוך צינורות נימי לעשות microneedles. |
| 4 | 2.1-2.6 | שעה | הכינו את ג'י-אקטין. |
| 5 | 3.1 | 30 דקות | אפשר לזבובים להטיל ביצים. |
| 6 | 3.2-3.10 | 15-30 דקות | לאסוף, לעלות, לייבש עוברים. לכסות עוברים בשמן. |
| 7 | 4.1 | 30 דקות מראש | הכינו תאי דגירה לחים. |
| 8 | 4.2-4.4 | דקה 1 | טען מיקרונידל. |
| 9 | 4.5-4.10 | 10-20 דקות | כייל את גודל בועת G-actin ולהזריק עוברים. |
| 10 | 4.11 | 30 דקות-1+ שעות | דגירה /חום מתח עוברים. |
| 11 | 5.1-5.3 | שעה מראש | הפעל את שלב המיקרוסקופ והדגירה. |
| 12 | 5.4-5.10 | 5 דקות | עוברי סנדוויץ' בין כיסויים להדמיה. |
| 13 | 5.11-6.6 | 15 דקות-1+ שעות | מוטות אקטין תוך-גרעיניים של תמונה בעוברים. |
טבלה 2: הצעות לפתרון בעיות. טבלה זו מספקת הצעות לפתרון בעיות כדי לסייע בהשלמה המוצלחת של הפרוטוקול.
| בעיה פוטנציאלית | הצעות |
| זבובים לא מניחים מספיק עוברים. | הגדר את הגביע לפחות 5 ימים מראש (עיין בשלבים 1.1-1.3). לשנות צלחות 3x ליום לקראת הניסוי כדי לעודד הטלת ביצים. תן זבובים להניח עוברים במשך 1 שעות במקום 30 דקות. תארגן כוסות עם זבובים של מבוגרים צעירים. |
| אף ג'י-אקטין לא מגורש מהמיקרונידל. | הגדל את הגדרות הלחץ והזמן במיקרו-אינג'קטור. לשבור את קצה microneedle עוד יותר (עיין בשלב 4.5 הערה). מאז כפכפים גדולים לא יכול לנקות, לטעון מחט חדשה. |
| קשה לכייל גודל בועה קטן מספיק. | התאם את הגדרות הלחץ והזמן (עיין בשלב 4.5). מכיוון שפתיחת קצה המיקרונידל עשויה להיות גדולה מדי, טען מחט חדשה. |
| עוברים משחררים מהדבק על העטיפה במהלך ההזרקה. | התאם את עקביות "דבק העובר" עבור כיסויים עתידיים על-ידי הוספת קלטת דו-צדדית נוספת לפתרון ההפטן (עיין בשלב 3.5 הערה). |
| עוברים מתייבשים במהלך דגירה בטמפרטורה. | ודא כי השקופית היא רמה בתא הדגירה (עיין בשלב 4.11) וכי השמן אינו נוגע בשום דבר שעלול לפתיל אותו משם. מוסיפים טיפות נוספות של שמן לעוברים. הקטן את זמן הייבוש שלפני ההזרקה (עיין בשלב 3.8). |
| השמן אינו מכסה לחלוטין את העוברים בין הכיסוי הראשון לשני. | הוסף שמן נוסף באמצעות פעולה נימי לפער הקטן בין העטיפות (עיין בשלב 5.8 הערה). |
| מוטות אקטין תוך-גרעיניים אינם נראים בעוברים לחוצים בחום. | להזריק נפח גדול יותר של G-actin (עיין בשלב 4.5). ודא כי הטמפרטורה של הדגירה שלאחר ההזרקה (עיין בשלב 4.11) ותא ההדמיה הם 32 °C (עיין בשלב 5.3). |
| בועות גדולות של G-actin גלויים סביב אתר ההזרקה של עוברים. | להזריק נפח קטן יותר של G-actin (עיין בשלב 4.5). הגדל את זמן ייבוש העובר כדי לקדם שימור טוב יותר של actin מוזרק בתוך העובר (עיין בשלב 3.8). |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
משמעותה של שיטה זו היא שהיא משתמשת בפרוטוקול מבוסס היטב של microinjection בעוברים Drosophila 21,22,23,24,25,26,27 כדי לאפשר מחקר חדש לגבי ASR וליווי הרכבת מוט actin. היתרון העיקרי של הזרקת אדום G-actin לעוברים חיים הוא כי ASR ניתן ללמוד תחת מגוון רחב של הקשרים. עבור מחקרים עתידיים, הקשרים אלה עשויים לכלול הזרקת עוברים של גנוטיפים אחרים כחלק ממסך מוטציה או חשיפת עוברים מוזרקים לתנאי מתח שונים, כגון מתח חמצוני4,32. אמנם לא מתואר בפירוט כאן, טכניקה זו הזרקה ניתן לשנות גם להזריק חומצות גרעין, חלבונים אחרים, תרופות וצבעי מחוון (למשל, ראה21,22,23,24,32) כדי ללמוד את ASR. לפיכך, שיטה זו מציגה מספר גישות לזיהוי טווח הלחצים הגורמים ל- ASR, המאפיינים עוד יותר את התגובות התאיות במהלך ASR (למשל שינויים בפעילות המיטוכונדריה), וחשיפת מולקולות ומנגנונים חדשים שבבסיס הרכבת מוט האקטין התוך-גרעיני.
כמה שלבים קריטיים של הפרוטוקול כוללים את הדברים הבאים: בשלב 3.8, עוברים חייבים להיות מיובשים כראוי כדי להבטיח הזרקה מוצלחת ובריאות העובר הטובה ביותר. זמן התייבשות יהיה תלוי בטמפרטורת הסביבה והלחות של המעבדה, ולכן מומלץ לתרגל את ההרכבה, התייבשות, וזריקות עם מאגר pH ניטרלי הראשון כדי לקבוע פרמטר זה לטיפול העוברים. בשלב 4.5, הגדרות microneedle והזרקה חייב להיות מכוון כדי לאפשר הזרקה של מספיק G-actinאדום לתוך עוברים. אם מעט מדי G-actinאדום מוזרק לתוך העובר, מוטות actin לא ניתן לדמיין בקלות, שכן היווצרות של מוטות actin תלויה בריכוז של actinחינם 1. בנוסף, יהיה קשה לקבל תוצאות עקביות מניסויי FRAP אם אין מספיק G-actinאדום מוזרק, שכן עוצמת הפלואורסצנטיות לא יהיה גבוה מספיק כדי להתגבר על פלואורסצנטיות הרקע. לכן, חשוב לכייל את גודל הבועה בכל פעם מחט חדשה נטענת ומשמשת. G-actinאדום הוא צמיג נוטה לסתום בתוך microneedle. לפעמים, זה יכול להוביל להזרקת כמויות משתנות של G-actin לתוך העוברים. אם microneedle סתום ופינוי microneedle עם לחץ גבוה נכשל, ייתכן שיהיה צורך לנסות לשבור את קצה microneedle עוד יותר או אפילו טעינת microneedle חדש והזרקת קבוצה חדשה של עוברים. לבסוף, בשלב 4.11, עוברים חייבים להיות דגירה בטמפרטורה גבוהה עבור מספיק זמן עבור ASR להיות המושרה מוטות כדי ליצור1. הטמפרטורות של כל האינקובטורים צריכות להיות במעקב מתמיד, יש להגביל את הזמן להעברת עוברים מהחממה לאינקובטור, ויש להשתמש בשעון העצר לכל הדגירות. בעיות אפשריות אחרות מפורטות בטבלה 2 עם עצות נלוות לפתרון בעיות.
מגבלה מרכזית אחת של פרוטוקול זה היא כי יש לנקוט טיפול יוצא דופן כדי לשמור על בריאות העוברים במהלך זריקות, דגירות והדמיה. הפרוטוקול תוכנן כדי למקסם את בריאות העובר, ועם תרגול משמעותי, חוקר יכול להשלים את כל השלבים של הפרוטוקול עם התפתחות העובר מתקדם בשיעורים הצפויים לטמפרטורה31. מגבלה שנייה של הפרוטוקול היא הצורך באסדת microinjection, אשר יכול להיות יקר למדי והוא לא ציוד נפוץ עבור כל מעבדה לטוס. עם זאת, אם מעבדה סמוכה מצוידת להזריק עוברים אחרים (למשל, קסנופוס, זברהפיש, ו Caenorhabditis elegans) או תאים חסידיים, אסדת ההזרקה המשמשת מתאימה ככל הנראה לזריקות דרוסופילה. במקרה זה, רק את הצורה של המחט צריך להיות מותאם לעוברים Drosophila על פי ההנחיות של ספר הבישול פיפט29. לחלופין, יש כמה אפשרויות micoinjector פחות יקר בשוק (למשל, microinjectors אנלוגי), אשר יכול להפחית באופן משמעותי את העלות של הרכבת אסדת הזרקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים מודים בהכרת תודה על עבודתם של ליוליו ז'נג וזנגווי שו, שעזרו לחלוץ טכניקה זו במעבדת סוקאק, כמו גם חסן סד שעזר בניתוח. העבודה למחקר זה ממומנת על ידי מענק מ- NIH (R01 GM115111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24x50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
References
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
- Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
- Bamburg, J. R., et al.
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
- Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
- Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
- Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
- Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
- Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
- Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
- Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
- Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
- Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
- Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).
- Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).
- Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).
- Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
- Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
- Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).
