Summary
El objetivo de este protocolo es inyectar actina globular conjugada con rhodamina en embriones de Drosophila y el conjunto de barras de actina intranuclear de imagen después del estrés térmico.
Abstract
El propósito de este protocolo es visualizar varillas de actina intranuclear que se ensamblan en embriones drosophila melanogaster vivos después del estrés térmico. Las barras actin son un sello distintivo de una respuesta al estrés actin (ASR) conservada e inducible que acompaña a las patologías humanas, incluida la enfermedad neurodegenerativa. Anteriormente, demostramos que el ASR contribuye a fallos de morfosis y a una menor viabilidad del desarrollo de embriones. Este protocolo permite el estudio continuo de los mecanismos subyacentes al montaje de varillas actin y el ASR en un sistema modelo que es altamente apto para la creación de imágenes, genética y bioquímica. Los embriones se recogen y montan en una cubierta para prepararlos para la inyección. La actina globulaular conjugada con rhodamina (G-actinrojo)se diluye y se carga en un microneedle. Se realiza una sola inyección en el centro de cada embrión. Después de la inyección, los embriones se incuban a temperatura elevada y las barras de actina intranuclear se visualizan mediante microscopía confocal. La recuperación de fluorescencia después de los experimentos de fotobleaching (FRAP) se puede realizar en las barras actin; y otras estructuras ricas en actina en el citoplasma también se pueden imaginar. Encontramos que G-actinRed polimeriza como G-actin endógeno y no interfiere, por sí solo, con el desarrollo normal de embriones. Una limitación de este protocolo es que se debe tener cuidado durante la inyección para evitar lesiones graves en el embrión. Sin embargo, con la práctica, inyectar G-actinrojo en embriones de Drosophila es una manera rápida y confiable de visualizar varillas de actina y se puede utilizar fácilmente con moscas de cualquier genotipo o con la introducción de otras tensiones celulares, incluyendo hipoxia y estrés oxidativo.
Introduction
Este protocolo describe cómo inyectar G-actinRojo para visualizar el montaje de barras de actina intranuclear en embriones estresados por calor que están siendo sometidos a una respuesta inducible a la tensión actin (ASR)1. Desarrollamos este protocolo para ayudar a los estudios del ASR, que en embriones conduce a morfosis interrumpida y viabilidad reducida, y en adultos los tipos de células humanas se asocian con patologías como insuficiencia renal2,miopías musculares3,y la enfermedad de Alzheimer y Huntington4,5,6,7,8. Este ASR es inducido por numerosas tensiones celulares, incluyendo choque de calor9,10,11,estrés oxidativo4,6,síntesis ATP reducida12,y huntingtina anormal u oligomerización amiloide β4,5,6,7,9,13,14,15,16. Un sello distintivo del ASR es el montaje de varillas de actina aberrantes en el citoplasma o núcleo de las células afectadas, que es impulsado por la hiperactivación inducida por el estrés de una proteína que interactúa con actina, Cofilina1,5,6,10. Lamentablemente, siguen existiendo lagunas clave en el conocimiento con respecto al ASR. Por ejemplo, se desconoce la función de las varillas actin. No entendemos por qué se forman varillas en el citoplasma de algunos tipos de células, pero el núcleo de otros. Tampoco está claro si el ASR es protector o maladaptivo para las células o embriones sometidos a estrés. Por último, todavía no conocemos los mecanismos detallados subyacentes a la hiperactivación de cofilina o el conjunto de varillas actin. Por lo tanto, este protocolo proporciona un ensayo rápido y versátil para sondear el ASR visualizando la formación de varillas actin y dinámicas en el sistema experimental altamente tractable del embrión de mosca de la fruta viva.
El protocolo para microinyecto G-actinRed en embriones drosophila vivos fue desarrollado inicialmente para estudiar la dinámica de las estructuras normales de actina citoplasmática17 durante eventos de construcción de tejidos. En esos estudios, encontramos que la inyecciónroja de G-actin no afectaba negativamente a los procesos de desarrollo tempranos en el embrión, incluida la citoquinasis o la gastrulación17,18. A continuación, modificamos el protocolo, adaptando el manejo del embrión y la inyección de G-actinrojo para permitir la toma de imágenes de barras de actina en embriones estresados por calor sometidos al ASR1. Otros métodos además de la inyección de G-actinrojo se pueden utilizar para visualizar actina en embriones. Estos métodos se basan en la expresión de proteínas fluorescentes (FPs) etiquetadas para actuar o a dominios de proteínas de unión a la actina, como Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP y Moesin-GFP (revisada en19). Sin embargo, el uso de estas sondas FP requiere precaución porque pueden estabilizar o interrumpir algunas estructuras de actina, no etiquetar por igual todas las estructuras de actina20, y en el caso de actin-GFP, son altamente sobreexpresados – problemático para el análisis del conjunto de varillas que no sólo depende del estrés, sino también actuar en la concentración dependiente1. Por lo tanto, G-actinRed es la sonda preferida para estudios de varilla en embriones de mosca, y el gran tamaño del embrión permite su fácil inyección.
El flujo de trabajo de este protocolo es similar a otras técnicas de microinjeción bien establecidas que se han utilizado para inyectar proteínas, ácidos nucleicos, fármacos e indicadores fluorescentes en embriones de Drosophila 21,22,23,24,25,26,27. Sin embargo, después de la microinyección de G-actinRed aquí, los embriones están expuestos a estrés por calor leve para inducir el ASR y el conjunto de varilla de actina intranuclear. Para laboratorios con acceso a moscas y un equipo de inyección, este método debe ser fácilmente implementable y adaptable para líneas de estudio específicas con respecto a la ASR, incluyendo su inducción por diferentes tensiones o modulación en distintos antecedentes genéticos.
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Protocol
1. Preparar tazas de recolección de embriones y placas de agar de jugo de manzana
- Cinco días antes del experimento de inyección, construir28 o adquirir al menos dos pequeñas tazas de recolección de embriones. Hacer platos de agar de jugo de manzana frescos de 60 mm para usar con pequeñas tazas de recolección28. Guarde los platos en cajas de plástico cubiertas con toallas de papel húmedas a 4 °C.
NOTA: Las pequeñas tazas de recolección de embriones, pobladas con números de mosca como se describe en el paso 1.3, proporcionarán un número suficiente de embriones por experimento, al tiempo que garantizarán que el manejo e inyección de embriones se pueda hacer en un corto tiempo suficiente para permitir la toma de imágenes de las etapas tempranas del desarrollo. - Caliente los platos de jugo de manzana a 18 °C y agregue un toque de pasta de levadura al centro del plato. La pasta de levadura es una pasta simple de levadura activa y agua destilada.
- Para promover la puesta de huevos más generosa, configure tazas de recolección con moscas 2 días antes del experimento. Agregue al menos 100 hembras y 50 moscas macho a las tazas de recolección, y cubra con un plato de jugo de manzana preparado(Figura 1,paso 1). En los días previos al experimento de inyección cambiar las placas de jugo de manzana al menos dos veces al día, una por la mañana y otra por la noche.
NOTA: Los mejores resultados de inyección e imágenes se obtienen cuando las tazas de recolección de embriones se mantienen a 18 °C con un ciclo de encendido/apagado ligero de 12 h.
2. Preparar una solución de stock de trabajo de G-actinRed para la microinjección
NOTA: Esta preparación sólo hace 2 μL de un stock de trabajo de 5 mg/ml de G-actinRojo,por lo que si los usuarios no están acostumbrados a la técnica de microinjección, es ventajoso saltar al paso 3 y practicar las microinyectos con un búfer de pH neutro para conservar un stock de trabajo precioso. El stock de 10 μg de G-actinRed del proveedor se puede almacenar en su embalaje original en un tarro superior de tornillo de 16 oz con ~500 g de desecante a 4 °C durante un máximo de 6 meses.
- Prepare una solución de stock de búfer G de antemano: Tris-HCl de 5 mM, CaCl2de 0,2 mM, pH 8,0. Filtre y almacene a temperatura ambiente.
- El día de las inyecciones, preparar 1 ml de una solución de trabajo G-buffer en un tubo de microcentrífuga de tapa de presión fresca sobre hielo utilizando el stock de amortiguador G del paso 2.1, complementado con lo siguiente en las concentraciones finales indicadas: 1 mM dithiothreitol (TDT) y 0,2 mM ATP, pH 8.0.
NOTA: El volumen de 1 ml de solución de trabajo de búfer G es más de lo necesario para un experimento, pero simplifica la preparación. El exceso se puede descartar después del experimento o los usuarios pueden reducir la escala según sus preferencias.- Manteniendo el caldorojo de 10 μg de actina G sobre hielo, primero agregue 1 μL de agua filtrada y destilada a la parte superior de la gota rosa de rojo G-actin dentro del tubo.
- A continuación, agregue 1 μL de la solución de trabajo de búfer G recién preparada del paso 2.2. Pipetear arriba y abajo ~ 20 veces para mezclar bien con el volumen de pipeta establecido en 1 μL. El stock G-actinRojo ahora estará en la dilución final de 5 mg/ml.
- Incubar el G-actinrojo preparado durante 30 minutos sobre hielo sin perturbar.
- Centrífuga la G-actinroja preparada a 16.000 x g durante 20 minutos a 4 °C en una microcentrífuga para eliminar cualquier precipitado.
- Pipetear cuidadosamente 1,5 μL del sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de tapa de presión fresca sobre hielo, evitando el pellet rosa oscuro.
- Guarde el sobrenadanterojo G-actin preparado sobre hielo durante un tiempo de hasta 6 h hasta que esté listo para cargarse en un microneedle.
NOTA: Los microagresivos se pueden extraer de tubos capilares con antelación en un extractor de micropipette, luego almacenarse a temperatura ambiente en una tira de arcilla de modelado en una placa Petri de 100 x 20 mm. Los parámetros sugeridos para el tracción de microneedle se pueden encontrar en el Pipette Cookbook29.
3. Recoger embriones y montar para inyección
- Deje que las moscas descansen embriones durante 30 minutos en placas de jugo de manzana con pasta de levadura a 18 °C.
- Mientras las moscas están tendida, precalentar un plato de agar de jugo de manzana sin pasta de levadura a temperatura ambiente, cortar una cuña rectangular de 4 cm x 1 cm de agar de jugo de manzana con una cuchilla de afeitar, y colocar en un tobogán de vidrio de 25 mm x 75 mm.
- Placa de cosecha de la colección de 30 minutos y embriones de deschorionato vertiendo lejía fresca, diluida 1:1 con agua destilada, en el plato y remolino de la placa durante 1 min, como se describe en28 (Figura 1,paso 2).
NOTA: Diferentes marcas de lejía se venden a diferentes concentraciones. La lejía utilizada aquí es 6% hipoclorito de sodio de la botella y se diluye a una concentración final de 3% hipoclorito de sodio. Otras marcas de lejía a concentraciones ligeramente más bajas funcionarán igual de bien. - Vierta la lejía y los embriones desconortados en una cesta de recolección (un colador de células de 70 μm) y enjuague el plato dos veces con agua destilada de una botella de chorro, añadiendo estos lavados a la cesta de recolección.
- Enjuague vigorosamente los embriones desoconsejados en la cesta de recogida con agua destilada hasta que no se visibles grupos de levaduras y la cesta no deje marcas rosas del exceso de lejía cuando se borre en una toalla de papel.
- Placa de cosecha de la colección de 30 minutos y embriones de deschorionato vertiendo lejía fresca, diluida 1:1 con agua destilada, en el plato y remolino de la placa durante 1 min, como se describe en28 (Figura 1,paso 2).
- Usando un pincel con cerdas humedecidas con agua destilada, transfiera embriones desoconsejados y lavados de la cesta de recolección a la cuña de agar de jugo de manzana preparada en el tobogán de vidrio.
- Utilice un par de pinzas de punta fina o una aguja de disección para organizar diez embriones en línea recta a lo largo del eje largo de la cuña de agar rectangular (Figura 1,paso 3). Organice los embriones cara a cara, de tal forma que su polo anterior esté mirando hacia la derecha y el lado dorsal esté frente al investigador(Figura 1,paso 3, magnificado).
- Corte 0,5 cm del final de una punta de pipeta P200 con una cuchilla de afeitar y sumérjase en el "pegamento embrionario" (descrito en28). Recubrir generosamente una región de 5 mm de ancho(Figura 1,paso 4)a lo largo del borde largo de una cubierta rectangular de 24 mm x 50 mm, y dejar secar, pegar hacia arriba. El secado tomará ~30 s y se completa una vez que toda la región recubierta de pegamento parezca mate en lugar de húmeda o brillante.
NOTA: Preparar "pegamento embrionario" con al menos 48 h de antelación. Añadir n-heptano a tiras de cinta a doble cara en un vial de centelleo como se describe en28. - Una vez que el "pegamento embrionario" se haya secado, coloque suavemente el lado del pegamento de la tapa en la parte superior de la fila de embriones alineados en el agar, dejando 2-3 mm de espacio entre el borde de la cubierta y la fila de embriones.
NOTA: Pegar los embriones demasiado cerca del borde de la mancha puede llevar a que los embriones se sequen demasiado durante el transcurso del experimento. - Voltea el control para que los embriones estén ahora mirando hacia arriba. Deben estar atascados en una línea a lo largo de un borde largo de la mancha de cubierta, y su región ventral mirando hacia el borde más cercano de la mancha(Figura 1,paso 4, magnificado).
- Desecar los embriones colocando el tapatío con embriones suavemente encima de 150 g de desecante azul fresco almacenado en un frasco superior de tornillo de 16 oz. Atornille firmemente la tapa e incuba durante 8-10 min(Figura 1,paso 5).
- Después de la desecación, retire el control de cubierta del frasco desecante y tape cada lado corto de la cubierta a un tobogán de microscopio, lado embrionario hacia arriba,con dos piezas de cinta de doble cara de 4 cm2 para que el cubrecones del embrión encaje en la etapa de inyección (Figura 1,paso 6).
- Añadir 2-3 gotas de aceite halocarbono 27 con una pipeta Pasteur para cubrir los embriones alineados y protegerlos de una mayor deshidratación(Figura 1,paso 6).
4. Inyecte y caliente embriones de estrés para promover la formación de varillas actin
NOTA: Todas las inyecciones se realizan en una habitación con temperatura controlada a 18 °C.
- Prepare cámaras de incubación húmedas de una placa de Petri de vidrio de al menos 100 mm x 20 mm de tamaño y forre la cámara con giros de limpiaparabrisas de tejido de laboratorio humedecidos con agua destilada(Figura 1,paso 8). Pre-calentar las cámaras de incubación a 32 °C o la temperatura de incubación deseada antes de inyectar embriones.
- Abra la válvula de flujo de aire para el microinyector y encienda el microinyector (el aire comprimido o el aire de la casa con una presión de al menos 90 psi es adecuado).
- Mientras que los embriones están desecando, retrocargue el sobrenadanterojo de G-actin previamente preparado en la microneedle usando una punta de microcargador. Ajuste la pipeta para que se elabore 1-1,5 μL.
NOTA: Debido a la viscosidad de la actina, los volúmenes de carga pueden no ser precisos y puede haber suficiente actina para cargar al menos uno a dos microneedles más. Se pueden inyectar hasta 60 embriones por microneedle cargado si el microagleo se calibra correctamente y no se obstruye durante el transcurso del experimento. - Coloque el microneedle en el soporte de la aguja y apriete el tornillo. Conecte el tubo de aire al microinyector y asegúrese de que la presión de flujo posterior en los equilibrios del microneedle a 30 hPa.
- Calibrar los ajustes del microinyector para expulsar una burbuja de 100 μm de diámetro de G-actinRojo (~500 pL) en un micrómetro deslizante. Gire la perilla de presión (500-1500 hPa) y la perilla de tiempo de pulso de inyección (0,1-0,5 s) en el microinyector para obtener el tamaño correcto de la burbuja. Ajuste estos ajustes cada vez que se cargue un nuevo microneedle para tener en cuenta la variabilidad en la viscosidad de actin y el tamaño de la punta del microneedle.
NOTA: Elrojo G-actin preparado es viscoso y puede haber aire en la punta del microneedle que debe ser expulsado antes de inyectar embriones. Si el G-actinRed no expulsa fácilmente de la punta del microneedle, rompa suavemente la punta del microneedle contra el borde del micrómetro deslizante. - Coloque la diapositiva con embriones montados en la etapa del microscopio.
NOTA: Cada inyección configurada será diferente, por lo que los investigadores tendrán que ajustar su método de inyección en consecuencia. Aquí los embriones se mueven con respecto a un microneedle estacionario, inyectando cada embrión ejecutando el embrión en el microneedle. - Ajuste la etapa del micromanipulador y enfoque del objetivo de 10x en el microscopio de luz para que los embriones sean visibles. Los embriones están en el plano focal correcto cuando los contornos de la membrana vitellina son más afilados y el embrión parece más grande. Elija embriones para inyectar que se encuentren en la etapa de desarrollo correcta, de modo que para cuando la incubación post-inyección esté completa, la mayor parte del embrague llegue a la etapa de desarrollo deseada (por ejemplo, inyectar embriones en la etapa 2-330 de Bownes con el fin de observar las varillas en la cellularización después del estrés térmico a 32 °C).
- Utilice los controles de microneedle para llevar la aguja al mismo plano focal que los embriones.
NOTA: Si el microneedle atrapa en la cubierta mientras mueve el escenario o el microneedle, entonces el microneedle está demasiado cerca de la diapositiva y no está en el plano focal correcto. El microneedle debe ser paralelo al deslizamiento de cubierta, y no en un ángulo significativo (Figura 1,paso 7). - Inserte el microneedle en el embrión para que golpee el embrión en medio de su región ventral, en el "ecuador" del embrión. Activar la inyección con el pedal o el botón "inyectar" cuando la punta del microneedle es visible dentro del centro del embrión (Figura 1,paso 7).
- Inyecte elrojo G-actin una vez y retire lentamente el microneedle. Mueva el escenario y repita para cada embrión de la etapa de desarrollo apropiada.
NOTA: La expansión del embrión es normal, ya que se inyecta elrojo G-actin y un poco de citoplasma puede filtrarse fuera del embrión. - Después de que todos los embriones hayan sido inyectados, coloque el tobogán con los embriones en la cámara de incubación húmeda preparada y cierre la tapa(Figura 1,paso 8). Si se trata de obtener embriones que alcanzan la celularización, el calor estresa los embriones a 32 °C durante 60-75 min en la cámara de incubación húmeda.
NOTA: Se observan tiempos de incubación que permiten la visualización de varillas en la celularización de embriones estresados por calor. El tiempo de incubación será más largo para los embriones que no controlan el estrés térmico porque el desarrollo será más lento a una temperatura más baja31. Estos embriones de control se pueden incubar en cámaras húmedas a temperaturas como 18 °C o 25 °C, dependiendo del diseño del experimento específico y de la pregunta que se haga. El tiempo mínimo de incubación necesario para que el G-actinRed se difunda por todo el embrión es de 30 min.
5. Imagen de varillas actin en embriones estresados por calor por microscopía confocal
- Mientras los embriones están siendo estresados por el calor, encienda el microscopio confocal y seleccione el canal láser de 561 nm.
- Mueva la lente objetivo (se recomienda 25x, 40x o 63x) a la posición de trabajo.
- Si las imágenes calientan embriones estresados, entonces establece la incubadora de etapas calentadas para alcanzar una temperatura interna de 32 °C. Se puede utilizar un termómetro de apuntar y disparar o infrarrojos para comprobar la temperatura en o cerca del objetivo.
- Retire el tobogán con embriones inyectados de la cámara de incubación húmeda una vez completada la incubación(Figura 1,paso 9).
- Trabajando rápidamente, saque suavemente las piezas de cinta de doble cara que se utilizaron para adherir el clip con embriones montados a la diapositiva(Figura 1,paso 9).
PRECAUCIÓN: Sea suave durante estos pasos, ya que los deslizamientos de cubierta pueden romperse fácilmente si se aplica demasiada fuerza. - Pegue dos piezas de 2,5 cm de largo de cinta a doble cara y corte la cinta por la mitad a lo largo para hacer dos tiras, de 2,5 x 0,5 cm de largo(Figura 1,paso 10).
- Pegue dos tercios de la longitud de cada tira de cinta en el primer cubrecoches, flanqueando cada lado de los embriones en aceite Halocarbon 27(Figura 1,paso 10, naranja),dejando un tercio de las tiras de cinta colgando del borde de la primera mancha donde los embriones están atascados. Utilice las manos enguantadas y tenga cuidado de no tocar los embriones durante este paso.
- Coloque suavemente un segundo tubo rectangular en la parte superior de las tiras de cinta para emparedar los embriones entre los tubos de cubierta(Figura 1,paso 10, azul). Alinee los bordes de 25 mm, pero mantenga el desplazamiento de los bordes de 50 mm entre sí por 1 cm de ancho.
NOTA: La superficie completa de este segundo coverslip se convertirá en la nueva superficie de imágenes que se enfrentará a la lente objetivo, así que tenga cuidado de no obtener huellas dactilares o aceite Halocarbon 27 en esta segunda superficie de deslizamiento de cubierta. El desplazamiento es necesario para que se pueda añadir aceite adicional de Halocarbon 27 para sumergir uniformemente los embriones. Si es necesario, agregue el aceite halocarbono 27 en la costura donde los dos cubrecoches se encuentran en la parte superior del sándwich y cubrirá los embriones por acción capilar (ver líneas discontinuas en la Figura 1,paso 10). - Toque suavemente en las áreas de la cubierta que están directamente en la parte superior de las tiras de cinta con el lado contundente de una navaja para conseguir que la tapadera se adhiera a la cinta.
- Voltee el sándwich de manchas y colóquelo en un limpiaparabrisas de tejido de laboratorio para mantener limpia la superficie de imágenes y llevarla al microscopio confocal(Figura 1,paso 11). Asegúrese de que la cinta esté completamente pegada a ambos puntos de cubierta antes de la toma de imágenes.
- Confirme que la etapa calentada está a temperatura y, si utiliza un microscopio invertido, agregue líquido de inmersión a la lente objetivo seleccionada.
- Coloque el sándwich de tubo de cubierta en el escenario cuidadosamente para asegurarse de que la nueva superficie de imágenes (2nd coverslip) es la que toca el líquido de inmersión(Figura 1,paso 11).
NOTA: Si es necesario, adhiera el sándwich de tapadera al escenario con dos pequeños trozos de cinta a doble cara para evitar movimientos innecesarios durante la toma de imágenes si los puntos de cubierta no encajan bien en la etapa calentada. - Concéntrate en un embrión que está en la celularización (Bownes etapa 4a30)o en la etapa de desarrollo deseada usando luz transmitida o fluorescencia.
- Una vez que un embrión ha sido puesto en el foco, cambie al modo de adquisición láser en el microscopio confocal y ajuste la potencia y ganancia del láser, el tamaño del marco, el mosaico y los ajustes de proyección según lo desee.
- Tome imágenes de vista superficial a través de los planos focales de los núcleos del embrión para encontrar barras de actina intranuclear. Las varillas deben aparecer en múltiples orientaciones como rayas brillantes o puntos dentro de los núcleos comparativamente oscuros (Figura 2A, 2C).
6. Experimentos alternativos de imágenes
- Realizar FRAP para investigar la rotación de actina a lo largo de la longitud de las varillas de actina intranuclear o en estructuras de actina citoplasmática, tales como las puntas de los surcos de membrana plasmática durante la cellularización.
- En el software de imágenes, elija una región rectangular alrededor de puntas de surco o varillas actin en las que adquirir el experimento.
- Elija una pequeña región cuadrada del centro de una barra de actin dentro de la región de adquisición rectangular para blanquear. Asegúrese de que las puntas de la varilla actin sean visibles y no se blanqueen durante el transcurso del experimento para permitir un seguimiento preciso de la varilla dentro del núcleo.
- Ajuste el láser de lejía para iterar 50x y ajuste la potencia del láser de la lejía al máximo.
- Elija un curso de tiempo para adquirir imágenes cada segundo para un total de hasta 120 s a la velocidad máxima de permanencia en píxeles y establezca el láser en lejía después de los dos primeros segundos de adquisición de imágenes.
- Cuantificar los datos para determinar el medio tiempo de recuperación de fluorescencia1.
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Representative Results
Un flujo de trabajo esquemático de manejo de embriones se representa en la Figura 1y se presenta un calendario para un experimento típico en la Tabla 1. Una estimación para un buen resultado experimental es que por cada 10 embriones inyectados, al menos la mitad de los embriones vistos estarán en la etapa de desarrollo correcta, sin daños, y exhibirán un ASR robusto con estrés térmico a 32 °C. Este ASR será evidenciado por el montaje de varillas de actina intranuclear como se muestra en la imagen representativa de vista superficial de un embrión en la Figura 2A (panel derecho). Las varillas actin aparecerán en varias orientaciones (paralelas o perpendiculares al plano de imágenes) dentro de los núcleos y se pueden tomar imágenes a través de varios planos focales. En comparación, los embriones de control incubados a 18 °C no mostrarán varillas actin(Figura 2A,panel izquierdo). El porcentaje de núcleos que contienen varillas se puede cuantificar, como se muestra en la Figura 2B. Además, se pueden realizar experimentos FRAP en varillas(Figura 2C). En la Figura 2Dse hace referencia a un método de cuantificación sugerido para los datos FRAP y se muestra un ejemplo de una gráfica de recuperación de fluorescencia para una región blanqueada frente a una región no manipulada de una varilla actin.
Si un embrión está gravemente dañado por inyección o se vuelve demasiado seco durante el experimento, se puede observar la asincrasia mitotica y se interrumpirá la celularización. A veces, es posible que las varillas no sean visibles debido a que no se inyecta suficiente actina en el embrión. Si esto sucede, asegúrese de que la cantidad de G-actinrojo inyectado es de 500 pL (medido con un micrómetro en el paso 4.5) y confirme que esta cantidad sigue siendo consistente entre embriones haciendo una inyección de prueba en el aceite circundante para comprobar el tamaño de la burbujaroja de G-actin entre cada microinyección embrionaria. Además, para garantizar la visualización de la varilla, trabaje rápidamente para añadir el control de cubiertas y mover los embriones a la etapa de microscopio calentado una vez que se toman de la cámara húmeda en el paso 5.4, ya que el montaje de la varilla es reversible1 y las varillas pueden desmontarse si los embriones se mantienen a una temperatura inferior a 32 °C durante más de 30 minutos.
Figura 1: Visión general esquemática del manejo de embriones durante el experimento. (1) Las moscas adultas en las tazas de recolección de embriones ponen embriones en las placas de agar de jugo de manzana. (2) Los embriones son desoconsejados con 1:1 lejía: agua destilada, vertida en una cesta de recolección y lavada a fondo con agua destilada para eliminar lejía y escombros. (3) Los embriones se transfieren con un pincel a una cuña de agar de jugo de manzana rectangular en un tobogán y dispuestos en sus lados, cara a cara, con región dorsal orientada al borde del agar. (4) Una región de 5 x 50 mm de un tubo de vidrio (naranja) está recubierta con "pegamento embrionario" y presionada suavemente sobre la fila de embriones dispuestos en el agar para adherirlos a la mancha. (5) Se invierte el encubridores con embriones para que los embriones se enfrenten. Los embriones se desecan en un frasco de tornillo. (6) Inmediatamente después de la desecación, la mancha de cubierta se pega a un tobogán, embriones mirando hacia arriba, y los embriones están cubiertos con aceite de Halocarbono 27. (7) Un microneedle previamente cargado conrojo G-actin preparado se utiliza para realizar una sola inyección en el centro de la región ventral de cada embrión, con aguja colocada paralela al deslizamiento de cubierta. (8) Después de la inyección, los embriones se incuban dentro de una placa De Petri humidificada con limpiaparabrisas de tejido de laboratorio húmedos a temperatura de control (18 °C) o con estrés por calor (32 °C). (9) Después de la incubación, el cubrebotas con los embriones en él se elimina de la diapositiva. (10) Dos trozos de cinta a doble cara están en capas uno encima del otro, cortados por la mitad a lo largo, y colocados a ambos lados del aceite que rodea a los embriones en el primer punto de cubierta. Un segundo coverlip (azul) se coloca en la parte superior de la primera para crear una nueva superficie de imágenes, offset para que deje un hueco para que se agregue más aceite para cubrir los embriones según sea necesario. (11) Si se toma imágenes en un microscopio confocal invertido, el sándwich de coverslip se invierte para que el segundo coverslip se enfrente al objetivo. Las imágenes se realizan en una cámara incubada, y las barras de actina se visualizan en varios planos focales de los núcleos de cada embrión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados representativos de las barras de actina en embriones estresados por el calor. (A) Las varillas actin no se ven en un embrión que fue incubado a una temperatura de control de 18 °C (panel izquierdo), pero se ven en los núcleos de un embrión que estaba estresado térmicamente a 32 °C (panel derecho). B) Cuantificación del porcentaje de núcleos con barras de actina de un experimento representativo. Cada punto representa un embrión donde se contaron varillas y núcleos en toda la región de imágenes (n = 22 embriones a 18 °C; n = 23 embriones a 32 °C; las barras de error muestran desviación estándar). La prueba t de un estudiante, con una variación desigual asumida, se utilizó para calcular el valor p. (C) Una serie temporal representativa muestra FRAP en una barra actin. La parte de la varilla que fue blanqueada está indicada por una punta de flecha blanca. La pre-lejía es de 2 s antes del paso de la lejía. Tiempo = 0 s es el paso de la lejía, y la recuperación de fluorescencia fue rastreada hasta 60 s después de la lejía. (D) Una parcela muestra dinámicas de recuperación para la fluorescencia actin en una región blanqueada de una varilla, en comparación con una región intachable en la misma varilla. Las varillas son notablemente estables y actuar dentro de ellas no tiene rotación. Por lo tanto, no se ve ninguna recuperación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Cuadro 1: Flujo de trabajo experimental con horario sugerido. Este calendario resume el tiempo previsto que se tardará en completar cada paso del protocolo.
| Orden | Paso | Tiempo necesario para cada paso | Descripción |
| 1 | 1.1 | 5 días de antelación | Hacer jaulas de recolección de embriones. Vierta los platos del agar de jugo de manzana. |
| 2 | 1.2-1.3 | 2 días de antelación | Instala jaulas de colección con moscas machos y hembras adultas. |
| 3 | Nota 2.6 | 1 día de antelación | Tire de tubos capilares para hacer microneedles. |
| 4 | 2.1-2.6 | 1 h | Prepara a G-actin. |
| 5 | 3.1 | 30 min | Deje que las moscas den huevos. |
| 6 | 3.2-3.10 | 15-30 min | Recoger, montar, desecar embriones. Cubra embriones con aceite. |
| 7 | 4.1 | 30 minutos de antelación | Preparar cámaras de incubación húmedas. |
| 8 | 4.2-4.4 | 1 min | Cargue microneedle. |
| 9 | 4.5-4.10 | 10-20 min | Calibrar el tamaño de la burbuja G-actin e inyectar embriones. |
| 10 | 4.11 | 30 min-1+ h | Incubar embriones de estrés térmico/ incubar. |
| 11 | 5.1-5.3 | 1 h de antelación | Encienda el microscopio y la etapa de incubación. |
| 12 | 5.4-5.10 | 5 min | Sandwich embriones entre coverslips para imágenes. |
| 13 | 5.11-6.6 | 15 min-1+ h | Imagen de barras de actina intranuclear en embriones. |
Tabla 2: Sugerencias de solución de problemas. Esta tabla proporciona sugerencias para solucionar problemas para ayudar a completar correctamente el protocolo.
| Problema potencial | Sugerencias |
| Las moscas no ponen suficientes embriones. | Configure la taza con al menos 5 días de antelación (consulte los pasos 1.1-1.3). Cambie las placas 3 veces al día antes del experimento para fomentar la puesta de huevos. Deje que las moscas dejen los embriones durante 1 h en lugar de 30 min. Prepara tazas con moscas adultas jóvenes. |
| Ninguna G-actin es expulsada de la microneedle. | Aumente la presión y la configuración de tiempo en el microinyector. Rompa aún más la punta del microneedle (consulte el paso 4.5 Nota). Dado que es posible que los obstrucciones importantes no se despejen, cargue una aguja nueva. |
| Difícil calibrar un tamaño de burbuja lo suficientemente pequeño. | Ajuste los ajustes de presión y hora (consulte el paso 4.5). Dado que la abertura de la punta del microneedle puede ser demasiado grande, cargue una aguja nueva. |
| Los embriones se liberan del pegamento en la cubierta durante la inyección. | Ajuste la consistencia del "pegamento embrionario" para futuros puntos de cubierta añadiendo más cinta de doble cara a la solución de heptano (consulte el paso 3.5 Nota). |
| Embriones se secan durante la incubación de temperatura. | Asegúrese de que la diapositiva esté nivelada en la cámara de incubación (consulte el paso 4.11) y de que el aceite no esté tocando nada que pueda desviarlo. Añadir gotas adicionales de aceite a los embriones. Disminuya el tiempo de desecación previa a la inyección (consulte el paso 3.8). |
| El aceite no cubre completamente los embriones entre la primera y la segunda mancha. | Añadir aceite adicional a través de la acción capilar a la pequeña brecha entre las cubiertas (consulte el paso 5.8 Nota). |
| Las varillas de actina intranuclear no son visibles en embriones estresados por el calor. | Inyecte un volumen mayor de G-actin (consulte el paso 4.5). Confirme que la temperatura tanto de la incubación posterior a la inyección (consulte el paso 4.11) como de la cámara de imágenes es de 32 °C (consulte el paso 5.3). |
| Grandes burbujas de G-actin son visibles alrededor del lugar de inyección de embriones. | Inyecte un volumen más pequeño de G-actin (consulte el paso 4.5). Aumentar el tiempo de desecación del embrión para promover una mejor retención de la actina inyectada dentro del embrión (consulte el paso 3.8). |
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Discussion
La importancia de este método es que utiliza el protocolo bien establecido de microinyección en embriones de Drosophila 21,22,23,24,25,26,27 para permitir nuevas investigaciones sobre el ASR y el conjunto de barras actin acompañantes. Una ventaja importante de inyectar G-actinRojo en embriones vivos es que el ASR se puede estudiar bajo una variedad de contextos. Para futuros estudios, estos contextos pueden incluir inyectar embriones de otros genotipos como parte de una pantalla mutante o exponer embriones inyectados a diferentes condiciones de estrés, como el estrés oxidativo4,32. Aunque no se describe en detalle aquí, esta técnica de inyección también se puede modificar para inyectar ácidos nucleicos, otras proteínas, fármacos y tintes indicadores (por ejemplo, ver21,22,23,24,32)para estudiar el ASR. Por lo tanto, este método presenta una serie de enfoques para identificar el rango de tensiones que inducen el ASR, caracterizando aún más las respuestas celulares durante el ASR (por ejemplo, cambios en la actividad mitocondrial), y descubriendo nuevas moléculas y mecanismos subyacentes al conjunto de barras de actina intranuclear.
Algunos pasos críticos del protocolo incluyen los siguientes: En el paso 3.8, los embriones deben desecados adecuadamente para garantizar una inyección exitosa y la mejor salud de los embriones. El tiempo de desecación dependerá de la temperatura ambiente y la humedad del laboratorio, por lo que se recomienda practicar primero el montaje, la desecación y las inyecciones con un búfer de pH neutro para establecer este parámetro para el manejo de los embriones. En el paso 4.5, los ajustes de microneedle e inyección deben ajustarse para permitir la inyección de suficiente G-actinRojo en embriones. Si se inyecta muy pocorojo G-actin en el embrión, las barras de actina pueden no visualizarse fácilmente, ya que la formación de varillas de actina depende de la concentración de actina libre1. Además, será difícil obtener resultados consistentes de los experimentos frap si no hay suficiente G-actinrojo inyectado, ya que la intensidad de fluorescencia no será lo suficientemente alta como para superar la fluorescencia de fondo. Por lo tanto, es importante calibrar el tamaño de la burbuja cada vez que se carga y utiliza una aguja nueva. G-actinRed es viscoso y tiende a obstruir dentro del microagleo. A veces, esto puede conducir a inyectar cantidades variables de G-actin en los embriones. Si el microagleo está obstruido y la limpieza del microagle con alta presión falla, puede ser necesario intentar romper la punta del microagleo aún más o incluso cargar un nuevo microagle e inyectar un nuevo conjunto de embriones. Por último, en el paso 4.11, los embriones deben ser incubados a temperatura elevada y durante el tiempo suficiente para que el ASR sea inducido y las varillas formen1. Las temperaturas de todas las incubadoras deben controlarse constantemente, el tiempo de transferencia de embriones de incubadora a incubadora debe ser limitado y se debe utilizar un temporizador para todas las incubaciones. Otros posibles problemas se enumeran en la Tabla 2 con consejos de solución de problemas que acompañan.
Una limitación importante de este protocolo es que se debe tener un cuidado excepcional para preservar la salud de los embriones durante las inyecciones, incubaciones e imágenes. El protocolo ha sido diseñado para maximizar la salud de los embriones, y con una práctica significativa, un investigador puede completar todos los pasos del protocolo con el desarrollo del embrión progresando a las tasas esperadas por temperatura31. Una segunda limitación del protocolo es la necesidad de un equipo de microinjección, que puede ser bastante caro y no es un equipo común para cada laboratorio de moscas. Sin embargo, si un laboratorio adyacente está equipado para inyectar otros embriones (por ejemplo, Xenopus,Pez Cebra y Caenorhabditis elegans)o células adherentes, el equipo de inyección utilizado es probablemente adecuado para inyecciones de Drosophila. En ese caso, sólo la forma de la aguja debe adaptarse para los embriones de Drosophila de acuerdo con las directrices del Pipette Cookbook29. Alternativamente, hay algunas opciones de micoinjector menos costosos en el mercado (por ejemplo, microinyectores analógicos), lo que puede reducir significativamente el costo de montar un equipo de inyección.
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Disclosures
No se declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores reconocen con gratitud el trabajo de Liuliu Zheng y Zenghui Xue, que ayudaron a ser pioneros en esta técnica en el laboratorio Sokac, así como de Hasan Seede, quien ayudó con el análisis. El trabajo para este estudio está financiado por una subvención de NIH (R01 GM115111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24x50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
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