Summary
يصف هذا البروتوكول الطرق المستخدمة لإعداد طيات صوتية للفئران للدراسة العصبية العضلية الهسكيميائية.
Abstract
الغرض من هذا البرنامج التعليمي هو وصف إعداد أضعاف الصوتية الفئران لدراسة الهستوكيميائية العصبية والعضلية. يحدد هذا البروتوكول إجراءات تشريح الحنجرة للفئران وتجميد الفلاش والتبريد للطيات الصوتية. تصف هذه الدراسة كيفية طيات صوتية بالتبريد في كل من الطائرات الطولية والمقطعية. الجدة من هذا البروتوكول هو تتبع الحنجرة أثناء عملية استئصال الشعر بالتبريد التي تضمن تحديد دقيق للعضلات الحنجرة الجوهرية ويقلل من فرصة فقدان الأنسجة. وتظهر الأرقام عملية البكاء التدريجية في كلا الطائرتين. تم استئصال 29 فأرا من الهيمي-لالحنجرة وتعقبها من ظهور غضروف الغدة الدرقية إلى ظهور القسم الأول الذي تضمن الحظيرة الصوتية الكاملة. تم تصور أضعاف الصوتية الكاملة لجميع الحيوانات في كلا الطائرتين. كان هناك تباين كبير في المسافة من مظهر غضروف الغدة الدرقية إلى ظهور أضعاف الصوتية الكاملة في كلا الطائرتين. لم يكن الوزن مرتبطا بعمق معالم الحنجرة ، مما يشير إلى أن التباين الفردي والعوامل الأخرى المتعلقة بإعداد الأنسجة قد تكون مسؤولة عن التباين العالي في ظهور المعالم أثناء القسمة. هذه الدراسة تفاصيل منهجية ويقدم البيانات المورفولوجية لإعداد حظيرة الفئران الصوتية للتحقيق العصبي العضلي الهسوشية. نظرا للتغير الفردي العالي ، يجب تتبع معالم الحنجرة عن كثب أثناء عملية استئصال الشعر لمنع فقدان الأنسجة والأنسجة. وسيساعد استخدام منهجية متسقة، بما في ذلك إعداد الأنسجة الكافية والوعي بالمعالم داخل حنجرة الفئران، في تحقيق نتائج متسقة عبر الدراسات ومساعدة الباحثين الجدد المهتمين باستخدام الحظيرة الصوتية للفئران كنموذج للتحقيق في الآليات العصبية العضلية الحنجرة.
Introduction
حنجرة الفئران هو نموذج راسخ للتحقيق في التكيف الهيكلي والوظيفي للحنجرة العصبية العضلية مع التنمية والشيخوخة والمرض والعوامل الدوائية1،2،3،4،5. اتساق الأساليب النسيجية أمر بالغ الأهمية لهذا الخط من العمل، كما أن هناك تعقيدات متعددة تشارك في إعداد العضلات وتحليلها، فضلا عن التحديات المرتبطة حجم الحنجرة، والشكل، وتضاريس العضلات مغلفة داخل الغضاريف الحنجرة1،6،7،8،9،10،11 . نظرا لصغر حجم عضلات الحنجرة الجوهرية للفئران ، فإن التضمين المنهجي والتجميد والتشخيص البردي أمر بالغ الأهمية لتحقيق نتائج متسقة ودقيقة. على سبيل المثال، عند تقسيم أضعاف صوت الفئران في الطائرة التاجية، تقع التقاطعات العصبية العضلية (NMJs) لأربعة من عضلات الحنجرة الجوهرية ضمن أقل من 1.8 مم من عمق الأنسجة11. لذلك ، فإن الرصد الدقيق لتشريح العضلات الحنجرة أثناء عملية استئصال الأعصاب أمر حتمي لتحديد القسم (المقاطع) ذات الاهتمام بدقة ومنع الإفراط في استئصال الأنسجة. يمكن أن يؤدي الإفراط في استئصال العضلات المستهدفة إلى تحديد غير دقيق لعدد وتضاريس NMJs11 أو يمكن أن يؤدي إلى تخفيضات إجمالية في حجم العينة إذا تم التخلص من العضلات المستهدفة بسبب ارتباك التوجه التاريخي12. كما يتم تطوير نماذج جديدة لدراسة العضلات الحنجرة والتكيفات الخاصة بهم، إجراءات التشغيل القياسية ضرورية لضمان النتائج دقيقة وموثوق بها، وقابلة للاستنساخ عبر الدراسات.
الهدف من هذه المقالة هو إعداد مفصل للطية الصوتية الفئران للتحليل الطولي والمقطعي الأمثل. يتم وصف الطرق التفصيلية المستخدمة بانتظام في مختبرنا لتحديد معالم العضلات المستهدفة أثناء عملية استئصال التبريد. على الرغم من استخدام أساليب مماثلة في العديد من المختبرات ، يتم توفير تفاصيل أكبر هنا مما هو عليه في الأدبيات لضمان تكرار موثوق ودقيق عند تنفيذه من قبل المحققين المبتدئين. الهدف من هذا البرنامج التعليمي هو توفير منهجية قياسية لتقييم الكيمياء المناعية (IHC) للطية الصوتية الفئران لتحسين الاتساق عبر المختبرات والتحقيقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت هذه الدراسة وفقا للجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه التابعة لكلية الطب بجامعة نيويورك.
1. تشريح حنجرة الفئران
- قتل الفئران وفقا للبروتوكول المعتمد مؤسسيا. حلق الرقبة البطنية من الفك السفلي إلى المانبوريوم ومسحة مع الكحول لمنع تلوث الفراء في عينات الأنسجة.
- تحت نطاق تشريح مع 10x التكبير استئصال الحنجرة بأكملها عن طريق إنشاء شق الرقبة خط الوسط مع مشرط حتى يتم الكشف عن القصبة الهوائية.
- فصل عضلات الحنجرة البطنية في خط الوسط لفضح الحنجرة باستخدام ملقط وتشريح مقص أو مشرط.
- قطع القصبة الهوائية caudal إلى حلقة القصبة الهوائية الثالثة وجعل rostral شق إلى العظام هيويد لاستئصال الحنجرة كله باستخدام مقص تشريح.
- إزالة أنسجة الحنجرة الخراجية (المريء والغدة الدرقية وعضلات الحنجرة الخراجية) من الحنجرة باستخدام أدوات التشذيب الدقيق (ملاقط ودبابيس وميكروسيسورس) تحت التكبير.
- مع microscissors، تقسيم الحنجرة ظهريا بين الاريتينويدات باستخدام خط الوسط بين عضلات cricoarytenoid الخلفي كمعلم. دبوس الجدران الجانبية للحنجرة لفضح طيات الصوتية ومن ثم تقسيم ventrally من خلال خط الوسط من غضروف الغدة الدرقية بين commissure الأمامي للطيات الصوتية مع microscissors (الشكل 1).
ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الخطوة اختيارية; يمكن تخطيها للحفاظ على الحنجرة كاملة. يسمح شفط الحنجرة بتقنيات متعددة لاحتواء المناعة باستخدام الجانبين الأيمن والأيساري لنفس الحنجرة بشكل منفصل. - شطف كل الحنجرة هيمي في محلول الفوسفات العازلة (PBS) ل ~ 10 ق وجافة بدقة مع ممسحة مهمة للحد من تشكيل الكريستال الجليد أثناء التجميد.
2. إصلاح و / أو فلاش تجميد الأنسجة الحنجرة
ملاحظة: التثبيت قد لا تكون مثالية لكافة بروتوكولات immunostaining. غالبا ما تكون أنسجة الحنجرة طازجة مجمدة بعد تشريحها مباشرة. تخطي الخطوة 2.1 إلى فلاش تجميد الأنسجة الحنجرة دون تثبيت.
- لإصلاح الهيمي-larynges وضع الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي مليئة 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المدارية في 70 دورة في الدقيقة. نقل الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي نظيف وشطف 3x لمدة 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني. ثم نقل إلى أنبوب الطرد المركزي نظيفة وتغمر في محلول السكروز 20٪ / 5٪ الجلسرين (~ 18 ساعة أو حتى يغرق الأنسجة) في 4 درجة مئوية.
تنبيه: الفورمالديهايد خطر ويجب استخدامه في غطاء الدخان جنبا إلى جنب مع معدات الحماية الشخصية المناسبة. - ضع جميع الهيمي-larynges في وضع موحد في قالب التبريد مليئة درجة حرارة القطع الأمثل (أكتوبر) مركب. لmilarynx، ضع الأنسجة مع السطح المتوسط من أضعاف الصوتية التي تواجه الجزء السفلي من cryomold والجانب الطولي للطية الصوتية موازية للحافة السفلى من افتتاح cryomold. لالحنجرة كله، ضع الأنسجة مع cricoarytenoids الخلفية التي تواجه الجزء السفلي من cryomold والجانب الطولي للطية الصوتية موازية للحافة السفلى من افتتاح cryomold.
ملاحظة: اتجاه الحنجرة متسقة داخل مركب أكتوبر أمر بالغ الأهمية ل cryosectioning من أضعاف الصوتية الفئران. بمجرد أن يتم تضمين اللبن وتجميده ، يجب إذابته لتغيير اتجاهه ، وبالتالي إدخال مخاطر تلف الأنسجة من دورات تجميد ذوبان الجليد المتعددة. - أنسجة التجميد الفلاشي باستخدام الأزوبينتان (2-ميثيل بوتان) المبردة في كوب من الصلب محاط بالنيتروجين السائل.
ملاحظة: تصل درجة الحرارة الاثيوبية إلى درجة الحرارة المثلى لتجميد الأنسجة عندما يبدأ الترسب الأبيض في التشكل على جانبي وأسفل الكأس13. يستخدم الإسوبينتان لأنه يحتوي على موصلية حرارية أعلى من النيتروجين السائل ، مما يساعد على منع تكسير كتلة الأنسجة أثناء التجميد السريع. للحصول على وصف أكثر تفصيلا للأنسجة المجمدة في OTC، راجع كومار وآخرون.13. - التفاف كل قالب في احباط prelabeled ووضعها في كيس التجميد الفردية لمنع الجفاف وتخزينها على الفور على الجليد الجاف حتى نقلها للتخزين في الثلاجة -80 درجة مئوية.
3. Cryosection الهيلاتريكس في طائرة مقطعية
- تعيين درجة حرارة الغرفة في cryostat إلى -20 درجة مئوية، والتي هي في منتصف نطاق درجة الحرارة (15−25 درجة مئوية) الموصى بها لقسم الأنسجة العضلية من قبل دليل الشركة المصنعة.
- تعيين سمك قسم cryostat إلى أقسام سميكة 10 ميكرومتر.
ملاحظة: لتحليل الألياف العضلية المقطعية، تعتبر المقاطع السميكة 10 ميكرومترات مثالية للسماح بالتلطيخ الكامل وكثافة التصوير القوية لألياف العضلات المسماة لتحليل كتابة الألياف14,15,16. قد تتطلب بعض البروتوكولات سمك مقطع مختلف اعتمادا على الأهداف العصبية والعضلية. - نقل الأنسجة إلى غرفة cryostat، إضافة طبقة موحدة من مركب أكتوبر على قرص عينة cryostat (تشاك)، ووضع كتلة الأنسجة المضمنة على رأس مركب أكتوبر على قرص العينة. للحصول على مقاطع عرضية من أضعاف الصوتية لتحليل الألياف العضلية الغدة الدرقية (TA) ، لصق العينة إلى تشاك بحيث الغضروف الغدة الدرقية البطني يواجه شفرة cryostat والغضاريف أريتينويد يواجه قرص العينة.
ملاحظة: من المهم ملاحظة أن هذه المعالم غير مرئية في هذه المرحلة، بسبب أن مركب OCT يصبح أبيض ومبهم عند تجميده. هذا النقص في الرؤية هو السبب في أنه من الأهمية بمكان ملاحظة اتجاه الهميلاتريكس خلال مرحلة تجميد الفلاش. - تقليم مركب أكتوبر عن طريق التقدم رأس العينة من قبل 100 ميكرومتر حتى الجزء البطني من غضروف الغدة الدرقية يظهر.
- ثم تقليم وتتبع 30 مقطع μm من بداية غضروف الغدة الدرقية حتى يتم الكشف عن البربريا الصفيحة, عضلات TA وسيطة, والعضلات TA الجانبية.
ملاحظة: يجب تتبع معالم الحنجرة والملاحظة منذ بداية غضروف الغدة الدرقية كل 100 ميكرومتر لضمان عدم انحراف زاوية المقطع. الشكل 2 يمثل مجموعتين من معالم الحنجرة في الطائرة المقطعية العرضية في التكبير 10x. - بمجرد الوصول إلى عضلة TA المستهدفة ، اجمع مقاطع على الشرائح المشحونة بشكل إيجابي عند 10 ميكرومتر.
- تخزين أقسام في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية للاحتفاظ الرطوبة حتى تكون جاهزة لتكون ملطخة.
ملاحظة: يمكن تخزين الأنسجة الثابتة في برنامج تلفزيوني لمدة تصل إلى أسبوع واحد اعتمادا على هدف IHC في حين يجب معالجة الأنسجة غير المثبتة على الفور.
4. Cryosection الهميلاتريكس في الطائرة الطولية
- مع غرفة cryostat تعيين مرة أخرى إلى -20 درجة مئوية، تغيير سمك القسم إلى 30 ميكرومتر.
ملاحظة: بالنسبة لتحليل NMJ، يمكن استخدام سمك الأنسجة بين 30−60 ميكرومتر لالتقاط العديد من NMJs كاملة داخل عضلات الحنجرة دون تجزئة إما محطة الأعصاب أو لوحة النهاية الحركية11,12,17. - للحصول على أقسام طيات صوتية طولية لتحليل NMJ لعضلات TA ، قم بلصق العينات على تشاك بحيث يتم توجيه epiglottis نحو شفرة cryostat ويواجه التجويف القصبي لأسفل نحو قرص العينة.
- تقليم مركب أكتوبر عن طريق التقدم رأس العينة من قبل 100 ميكرومتر حتى يظهر غضروف الغدة الدرقية.
- تقليم وتتبع أقسام من 30 ميكرومتر من بداية الغدة الدرقية حتى يتم الكشف عن البربريا الصفيحة والانقسامات الوسيطة والظرية من عضلة TA.
ملاحظة: يوصى بخمس مجموعات من معالم الحنجرة في الطائرة الطولية لتتبع تطور عمق الأنسجة نحو عضلة TA المستهدفة. الشكل 3 يمثل معالم الحنجرة في الطائرة الطولية في التكبير 10x. - بمجرد الوصول إلى عضلة TA المستهدفة ، اجمع المقاطع على الشرائح المشحونة بشكل إيجابي عند 30 ميكرومتر.
- تخزين أقسام في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية للاحتفاظ الرطوبة حتى تكون جاهزة لتكون ملطخة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكانت النتائج التمثيلية جزءا من تحقيق جار في آثار التمارين الصوتية على الجهاز العصبي العضلي الحنجري. تم وزن وقتل تسعة وعشرين من الذكور فيشر 344/brown النرويج الفئران (12 9 أشهر من العمر، 17 24 شهرا) مع استنشاق ثاني أكسيد الكربون تليها استئصال الصدر الثنائية.
اتبعت الإجراءات البروتوكول المحدد لتسمية NMJs وحجم الألياف من عضلات TA الجانبية والوسطية. تم تتبع المسافة بين معالم الحنجرة في كل من الطائرات الطولية والمقطعية باستخدام عضلات الحنجرة والغضاريف المحيطة بها لتحديد التقدم أثناء عملية استئصال التبريد (الجدول 1). بدأ التتبع في أول ظهور لغضاريف الغدة الدرقية في كلا المستويين الاتجاهين. يوضح الشكل 2 ظهور معالم الحنجرة أثناء عملية الاستئصال العرضي للأعصاب بترتيب زمني مع ظهور الغدة الدرقية (الشكل 2a، b) قبل ظهور عضلة TA الوسطى و لبروبريا الصفيحة (الشكل 2c، د). يوضح الشكل 3 ظهور معالم الحنجرة أثناء عملية الاستئصال الرأسي الطولي بترتيب زمني مع ظهور عضلة الار (الشكل 3a, b) قبل ظهور عضلة TA الوسطى (الشكل 3c, d) و إلى البربريا الصفيحة (الشكل 3e,f).
في كلا المستويين الاتجاهي، تباينت المسافات بين المعالم بشكل كبير للحيوانات الفردية.
وكان للوزن والحنجرة مظاهر بارزة علاقات ضعيفة إلى معتدلة للفئران الصغيرة وارتباطات ضعيفة للفئران المسنين (الجدول 2 والجدول 3). كانت المسافات بين المعالم داخل كل طائرة مترابطة بشكل معتدل إلى قوي لكلا الفئتين العمريتين ، ولكنها كانت مرتبطة بشكل ضعيف بين طائرتي التشريح. لذلك، لا يمكن حساب التباين في المظهر التاريخي بالوزن أو الاختلافات الفردية في حجم الحنجرة.
الشكل 1: حنجرة الفئران مقسمة بشكل ظهري بين غضروف الأرينويد (ArC).
الجانب الأيمن من الحنجرة الهيمي مشروح مع معالم في المستوى الطولي (LZ1-LZ5) المقابلة للمعالم الطولية الخمسة في الجدول 1. الجانب الأيسر من الحنجرة هيمي مشروح مع معالم في الطائرة المقطعية العرضية (CZ1 و CZ2) التي تتوافق مع بداية العضلات TA الجانبية وكامل المقطع العرضي من أضعاف الصوتية على التوالي. VF = أضعاف الصوتية، CrC = غضروف cricoid، AlC = غضروف الألار، وT1 = الحلقة القصبية الأولى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقطعان عرضيان مصوران عند تكبير 10x في برايتفيلد (يمين) وفي قناة 488 الفلورية (يسار) بعد الاحتواء المناعي للرقمين لتحديد ألياف العضلات.
المقاطع (من أعلى إلى أسفل) تظهر التقدم أثناء cryosectioning في الترتيب الزمني مع الغدة الدرقية (أ، ب) التي تظهر قبل العضلات TA الوسطي وإلى بروبريا الصفيحة من أضعاف الصوتية (ج، د). ThC = غضروف الغدة الدرقية، LTA = الغدة الدرقية الجانبية، و MTA = الغدة الدرقية الوسيطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ثلاثة أقسام طولية مصورة عند تكبير 10x في برايتفيلد (يمين) وفي قناة 488 الفلورية (يسار) بعد النتواء المناعي للتقاطعات العصبية العضلية.
المقاطع (من أعلى إلى أسفل) تظهر التقدم أثناء cryosectioning في الترتيب الزمني مع العضلات اللار (أ،ب) التي تظهر قبل العضلات TA الوسطي (ج،د) وإلى بروبريا الصفيحة (ه، و) من أضعاف الصوتية. AlC = غضروف الار، ThC = غضروف الغدة الدرقية، ArC = غضروف أريتينويد، LTA = الغدة الدرقية الجانبية، MTA = الغدة الدرقية الوسيطة، وSCA = cricoarytenoid متفوقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| معالم طولية | المتوسط (الانحراف المعياري) في ميكرومتر | المدى في ميكرومتر | |
| 1. ظهرت جميع الغضاريف الرئيسية الثلاثة (الغدة الدرقية ، ألار ، الاريتينويد) مع ظهور ألياف العضلات | 1,591 (665) | 350–2,800 | |
| 2. ظهرت العضلات cricoarytenoid العليا (SCA)، ألار cricoarytenoid (ACA)، والثيرواريتينويد الجانبي (LTA) | 2,344 (591) | 91–3,500 | |
| 3. ACA وLTA العضلات امتدت تماما دون تجزئة | 2,631 (532) | 1505–3,640 | |
| 4. الغضروف Arytenoid الموسع، اختفى ACA، ظهرت العضلات الغدة الدرقية الوسيطة (MTA) | 2,948 (606) | 1765–4,305 | |
| 5. الهدف كامل المقطع أضعاف الصوتية: LTA و MTA العضلات تمتد تماما دون تجزئة وظهرت propria lamina | 3,131 (542) | 2205–4410 | |
| المعالم المقطعية العرضية | |||
| 1. ظهرت عضلة LTA | 303 (138) | 110–690 | |
| 2. ظهرت عضلة MTA وكان ~ 50٪ من حجم LTA مع بروبريا lamina واضحة وأشار ظهارة. | 482 (167) | 210–850 | |
الجدول 1: المسافات في μm من أول ظهور غضروف الغدة الدرقية إلى كل معلم الحنجرة أثناء cryosectioning (ن = 29).
| وكاله الفضاء الكنديه | طولي | |||||||
| LTA | MTA | الغضاريف | ألار/SCA | LTA | MTA | ليره لبنانيه | ||
| وكاله الفضاء الكنديه | LTA | 1 | ||||||
| MTA | 0.88 | 1 | ||||||
| طولي | الغضاريف | 0.42 | 0.42 | 1 | ||||
| ألار/SCA | 0.57 | 0.47 | 0.77 | 1 | ||||
| LTA | 0.59 | 0.47 | 0.71 | 0.98 | 1 | |||
| MTA | 0.53 | 0.39 | 0.72 | 0.97 | 0.98 | 1 | ||
| ليره لبنانيه | 0.53 | 0.41 | 0.76 | 0.96 | 0.97 | 0.99 | 1 | |
| ثقل | -0.55 | -0.35 | 0.08 | -0.45 | -0.46 | -0.46 | -0.41 | |
الجدول 2: نتائج ارتباط بيرسون بين الوزن وعمق معالم الحنجرة في القطاع العرضي (CSA) والطائرات الطولية للفئران الذكور الصغار. LTA = الغدة الدرقية الجانبية، MTA = الغدة الدرقية الوسيطة، SCA = cricoarytenoid متفوقة، وLP = لامينا بروبريا.
| وكاله الفضاء الكنديه | طولي | |||||||
| LTA | MTA | الغضاريف | ألار/SCA | LTA | MTA | ليره لبنانيه | ||
| وكاله الفضاء الكنديه | LTA | 1 | ||||||
| MTA | 0.9 | 1 | ||||||
| طولي | الغضاريف | 0.21 | 0.33 | 1 | ||||
| ألار/SCA | 0.05 | 0.07 | 0.73 | 1 | ||||
| LTA | -0.06 | -0.04 | 0.64 | 0.96 | 1 | |||
| MTA | -0.02 | -0.02 | 0.6 | 0.79 | 0.84 | 1 | ||
| ليره لبنانيه | -0.17 | -0.15 | 0.52 | 0.76 | 0.85 | 0.91 | 1 | |
| ثقل | 0.23 | 0.13 | -0.24 | -0.07 | -0.15 | -0.15 | -0.3 | |
الجدول 3: نتائج ارتباط بيرسون بين الوزن وعمق معالم الحنجرة في القطاع العرضي (CSA) والطائرات الطولية للفئران الذكور القديمة. LTA = الغدة الدرقية الجانبية، MTA = الغدة الدرقية الوسيطة، SCA = cricoarytenoid متفوقة، وLP = لامينا بروبريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إعداد طيات الفئران الصوتية للتحليل العصبي العضلي يمكن أن تقدم مع تحديات مختلفة. ليس فقط عضلات الحنجرة صغيرة ومحاطة الغضاريف، مما يجعل من الصعب استخراج العضلات المستهدفة مباشرة، تم العثور على تباين كبير أيضا بين الحيوانات في عمق المعالم التشريحية الحنجرة. بالنسبة للعضلات بروتوكول مستوى المقطع العرضي، ظهرت مقاطع طي صوتية كاملة بين 21−85 قسما (10 ميكرومتر لكل مقطع) بعد الظهور الأولي لغضاريف الغدة الدرقية البطنية، وهو أقل قليلا من الأقسام 63-126 (35 ميكرومتر لكل قسم) في المستوى الطولي لبروتوكولات تحليل NMJ (الجدول 1).
لوحظ التباين في المسافات بين معالم الحنجرة على الرغم من التضمين الموحد وتوجيه وتقطيل الأنسجة لكل نوع من أنواع البروتوكول. وعلاوة على ذلك، لم تكن الاختلافات في وزن الجسم مسؤولة عن التباين في النطاقات الواسعة من عمق الأنسجة من مجموعة واحدة من معالم الحنجرة إلى المجموعة التالية. قد يكون هذا التباين في المسافة بين معالم الحنجرة بسبب الاختلافات الفردية في تشريح الحنجرة عبر الحيوانات ، أو اختلافات صغيرة في اتجاه الحنجرة في cryomold داخل مركب OCT في وقت التشريح ، أو كيف تم وضع العينات على قرص العينة داخل cryostat عند المقطع (أي كمية مركب OCT الموضوع على قرص العينة قبل التركيب أو الاختلافات الطفيفة في زاوية التنسيب).
مع فهم أن هذه الاختلافات الطفيفة في إعداد العينة يمكن أن تؤدي إلى تباين كبير في عمق معالم الأنسجة الحنجرة ، فمن الأهمية بمكان أن يكون لدى المحققين المبتدئين خريطة مرجعية للعمل منها. يمكن لبروتوكولات الدراسة المحددة التي تحدد طرق تحديد العضلات (العضلات) ذات الاهتمام ومنع مزالق البروتوكول - مثل تلك المبينة في هذه الوثيقة - تحسين القابلية للاستنساخ ومنع فقدان الأنسجة غير المرغوب فيها.
على الرغم من أن هذه الدراسة ركزت على عضلة TA, هذه المنهجية ينطبق على عضلات الحنجرة الجوهرية الأخرى كذلك. على سبيل المثال، تقسيم في الطائرة أضعاف الصوتية الطولية تسفر عن أقسام الألياف العضلية الطولية من الار، TA الجانبية، TA وسيطة، cricoarytenoid الجانبية، والعضلات cricoarytenoid متفوقة، والشرائح العرضية من العضلات cricoarytenoid الخلفي. تقسيم في الطائرة أضعاف الصوتية المقطعية تسفر عن المقاطع العرضية من الار, TA الجانبية, TA وسيطة, cricoarytenoid الجانبية, cricoarytenoid متفوقة, وعضلات الغدة الدرقية, فضلا عن أقسام طولية من العضلات cricoarytenoid الخلفي. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن هذه الدراسة لم تشمل الفئران الإناث ، لا يتوقع وجود اختلافات بين الفئران الذكور والإناث في مظهر معلم الحنجرة لأن الازدواج الجنسي داخل حنجرة الفئران محدد العضلات ولا يرتبط بتشريح إطار الحنجرة16،18.
يمكن أن يجعل التباين في المسافة بين معالم الحنجرة عملية حفظ التبريد أضعاف الفئران الصوتية صعبة على المحققين المبتدئين. أظهرت هذه الدراسة أنه على الرغم من الاتساق في كيفية تجميد الحنجرة الجرذ، جزءا لا يتجزأ، و cryosectioned، والمسافة بين معالم الحنجرة تختلف اختلافا كبيرا. وزن الحيوان لم يفسر هذا التغير. توفر هذه الدراسة إجراءات مفصلة مع الصور المرتبطة بها حول كيفية إعداد أنسجة عضلة الحنجرة بشكل مناسب وتحديد معالم الحنجرة للتحقيق النسيجي العصبي العضلي للطية الصوتية للفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث من خلال منح F31DC017053-01A1 (Lenell، PI) وK23DC014517 (جونسون، PI) من المعهد الوطني للصمم واضطرابات الاتصال الأخرى للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. |
References
- Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), Pt 1 579-586 (2002).
- Suzuki, T., et al. Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).
- Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration. Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).
- Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context. Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).
- Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval. Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).
- Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats. Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).
- Ciucci, M. R., et al. Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats. Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).
- Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease. Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).
- Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats. American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).
- Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats. Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).
- Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function. Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).
- Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).
- McMullen, C. A., et al. Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).
- Lenell, C., Johnson, A. M. Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat. Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats. Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).
