Summary
该协议描述了用于准备大鼠声带以进行组织化学神经肌肉研究的方法。
Abstract
本教程的目的是描述用于组织化学神经肌肉研究的大鼠声带的准备工作。该协议概述了大鼠喉部解剖，闪光冷冻和声带冷冻切除术的程序。本研究描述了如何在纵向和横截面上冷冻切除声带。该协议的新颖之处在于冷冻切除过程中的喉部跟踪，可确保准确识别内在喉部肌肉并减少组织丢失的机会。数字显示了两个平面的渐进式冷冻切除。对29只大鼠半喉部进行了冷冻切除术，并从甲状腺软骨的出现到包括整个声带的第一部分的外观进行了跟踪。两个平面上所有动物的完整声带都可视化了。从甲状腺软骨的外观到两个平面上的完整声带的距离存在很高的变异性。体重与喉部标志物的深度无关，这表明个体变异性以及与组织准备相关的其他因素可能是切片过程中标志物外观高变异性的原因。本研究详细介绍了一种方法，并提供了用于准备大鼠声带以进行组织化学神经肌肉检查的形态学数据。由于个体变异性高，在冷冻切除过程中应密切跟踪喉部标志物，以防止过度切除组织和组织丢失。使用一致的方法，包括足够的组织准备和对大鼠喉内标志物的认识，将有助于在研究中获得一致的结果，并帮助有兴趣使用大鼠声带作为模型的新研究人员研究喉神经肌肉机制。
Introduction
大鼠喉是一个成熟的模型，用于研究结构和功能神经肌肉喉对发育，衰老，疾病和药理药物的适应性1，2，3，4，5。组织学方法的一致性对于这项工作至关重要，因为肌肉制备和分析涉及多种复杂性，以及与喉软骨内封装的肌肉的喉部大小，形状和形貌相关的挑战1，6，7，8，9，10，11.由于大鼠内在喉部肌肉的尺寸很小，系统地嵌入，冷冻和冷冻切除对于获得一致和准确的结果至关重要。例如，当在冠状平面上切割大鼠声带时，四个内在喉肌的神经肌肉接头（NMJ）位于组织深度小于1.8 mm以内11。因此，在冷冻切除过程中精确监测喉部肌肉解剖结构对于准确识别感兴趣的部分并防止组织过度切除至关重要。目标肌肉的过度切除可能导致 NMJs11 的数量和形貌识别不准确，或者如果目标肌肉由于特征性方向混淆而被丢弃，则可能导致样本量总体减少12。随着喉部肌肉研究及其各自适应性的新模型的开发，标准操作程序对于确保结果在研究中精确，可靠和可重复至关重要。
本文的目的是详细准备大鼠声带，以实现最佳纵向和横截面分析。描述了我们实验室中经常使用的详细方法，以在冷冻切除过程中识别目标肌肉标志物。虽然在几个实验室中使用了类似的方法，但这里提供了比文献中更多的细节，以确保新手研究人员实施时可靠和准确的复制。本教程的目标是为大鼠声带的免疫组织化学（IHC）评估提供标准方法，以提高实验室和研究的一致性。
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Protocol
本研究是根据纽约大学医学院机构动物护理和使用委员会进行的。
1. 解剖大鼠喉部
- 根据机构批准的协议对大鼠实施安乐死。将腹颈部从下颌骨剃到手洗，并用酒精拭子擦拭，以防止组织标本中的毛皮污染。
- 在具有10倍放大倍率的解剖镜下，通过用手术刀创建中线颈部切口来切除整个喉部，直到气管暴露。
- 将腹侧外侧喉肌分开，使用镊子和解剖剪刀或手术刀暴露喉部。
- 将气管尾部切开到第三气管环，并在舌骨上做一个切口，用解剖剪刀切除整个喉部。
- 使用显微切割工具（镊子、销和微剪刀）从喉部取出外源性喉组织（食道、甲状腺和外源性喉肌）。
- 使用微剪刀，使用后腱肌之间的中线作为标志，将喉背侧的肛门一分为二。用微剪刀将喉部的侧壁固定以暴露声带，然后通过声带前部之间的甲状腺软骨中线将腹侧一分为二（图1）。
注意：此步骤可以是可选的;可以跳过它以保持喉部完整。喉部的两切允许通过分别使用同一喉部的右侧和左侧来进行多种免疫染色技术。 - 在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中冲洗每个半喉部约10秒，并用任务刮水器轻轻干燥，以减少冷冻过程中的冰晶形成。
2. 固定和/或快速冷冻喉组织
注意：固定可能不适用于所有免疫染色方案。喉组织通常在解剖后立即被快速冷冻。跳过步骤2.1，无需固定即可快速冷冻喉部组织。
- 为了固定半喉，将组织置于装有4%甲醛的PBS离心管中，室温下在70rpm的轨道振荡器上1小时。将组织转移到干净的离心管中，并在PBS中冲洗3次20分钟。然后转移到干净的离心管中，并在4°C下浸没在20%蔗糖/ 5%甘油溶液中（约18小时或直到组织下沉）。
注意：甲醛是危险的，应与适当的个人防护设备一起在通风橱中使用。 - 将所有半喉部均匀放置到充满最佳切割温度（OCT）化合物的冷冻模具中。对于半边，将声带内侧表面面向冷冻器底部的组织放置，并将声带的纵向面平行于冷冻器开口的下边缘。对于整个喉部，将后侧胪骨的组织朝向冷冻膜的底部，并且声带的纵向面平行于冷冻孔的下边缘。
注意：OCT化合物内一致的喉部方向对于大鼠声带的冷冻切除至关重要。一旦包埋并冷冻了半边，就必须解冻以改变其方向，从而引入多次解冻-冷冻循环导致组织损伤的风险。 - 使用异戊烷（2-甲基丁烷）在被液氮包围的钢制烧杯中冷却的闪冻组织。
注：当烧杯的侧面和底部开始形成白色沉淀物时，异戊烷达到组织冷冻的最佳温度13。使用异戊烷是因为它具有比液氮更高的导热性，这有助于防止组织块在快速冷冻过程中开裂。有关OTC中冷冻组织的更详细说明，请参阅Kumar等人13。 - 将每个模具包裹在预先标记的箔中，并放入单独的冷冻袋中以防止脱水，并立即储存在干冰上，直到转移到-80°C的冰箱中储存。
3. 横截面上的冷冻切除术
- 将低温恒温器中的腔室温度设置为-20°C，该温度介于制造商手册推荐用于肌肉组织切片的温度范围（15-25°C）的中间。
- 将低温恒温器截面厚度设置为 10 μm 厚截面。
注意：对于肌肉纤维横截面分析，10μm厚的切片是最佳的，可以对标记的肌肉纤维进行完整的染色和强大的成像强度，以进行纤维分型分析14，15，16。某些方案可能需要不同的切片厚度，具体取决于神经肌肉靶标。 - 将组织转移到低温恒温器室，在低温恒温器标本盘（卡盘）上加入一层均匀的OCT化合物，并将嵌入的组织块放在标本盘上的OCT化合物的顶部。要获得用于甲状腺样动脉 （TA） 肌纤维分析的声带横截面，请将标本贴在卡盘上，使腹侧甲状腺软骨面向低温恒温器叶片，而类肾上腺软骨面向标本盘。
注意：重要的是要注意，这些地标在此阶段是不可见的，因为OCT化合物在冷冻时会变白和不透明。这种可见性的缺乏是为什么在闪光冻结阶段注意下颌的方向至关重要的原因。 - 通过将标本头部推进100μm直到甲状腺软骨的腹侧部分出现来修剪OCT化合物。
- 然后修剪并跟踪从甲状腺软骨开始的30μm切片，直到固有层，内侧TA肌肉和外侧TA肌肉暴露。
注意：从甲状腺软骨开始，每100μm一次，应跟踪并注意喉部标志，以确保切片的角度不倾斜。 图2 表示横截面上以10倍放大倍率下的两组喉部特征。 - 一旦达到目标TA肌肉，在10μm处收集带正电荷的载玻片上的切片。
- 将切片储存在4°C的PBS中以保持水分，直到它们准备好染色。
注意：固定组织可以在PBS中储存长达一周，具体取决于IHC靶标，而未固定的组织应立即处理。
4. 纵平面冷冻切除术
- 将低温恒温器室再次设置为-20°C，将截面厚度更改为30μm。
注意：对于 NMJ 分析，30−60 μm 的组织厚度可用于捕获喉肌内的几个完整的 NMJ，而不会碎裂神经末梢或运动终板11，12，17。 - 为了获得用于TA肌肉NMJ分析的纵向声带切片，请将标本贴在卡盘上，使会厌朝向低温恒温器叶片，气管腔朝下朝向标本盘。
- 通过将标本头部向前推进100μm直到甲状腺软骨出现来修剪OCT化合物。
- 修剪和跟踪从甲状腺发病到TA肌肉的内侧和外侧分裂暴露的30μm切片。
注意：建议在纵平面上使用五组喉部标志，以跟踪组织向目标TA肌的深度进展。 图3 显示了纵平面上10倍放大镜下的喉部特征。 - 一旦达到目标TA肌肉，在30μm处收集带正电荷的载玻片上的切片。
- 将切片储存在4°C的PBS中以保持水分，直到它们准备好染色。
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Representative Results
代表性的结果是正在进行的声乐运动对喉神经肌肉系统影响的研究的一部分。对29只雄性Fischer 344/棕色挪威大鼠（12只9个月大，17只24个月大）进行称重和安乐死，吸入CO2 ，然后进行双侧开胸术。
这些程序遵循概述的协议来标记外侧和内侧TA肌肉的NMJ和纤维大小。使用喉部肌肉和周围软骨在纵向和横截面中跟踪喉标志物之间的距离，以确定冷冻切除术期间的进展（表1）。跟踪在甲状腺软骨在两个方向平面上首次出现时开始。 图2 显示了横截面冷冻切除术期间喉标志物的出现，甲状腺（图2a，b）出现在内侧TA肌和固有层之前（图2c，d）。 图3 显示了纵向冷冻切除期间喉标志物以时间顺序出现，其中鼻翼肌（图3a，b）出现在内侧TA肌（图3c，d）和固有层（图3e，f）之前。
在两个方向平面上，单个动物的地标之间的距离差异很大。
年轻大鼠的体重和喉部标志性表现具有弱至中度的相关性，而老年大鼠的相关性较弱（表2 和 表3）。对于两个年龄组，每个平面内地标之间的距离具有中度至强相关性，但两个解剖平面之间的相关性较弱。因此，地标性外观的变异性不能通过体重或喉部大小的个体变化来解释。
图1：大鼠喉背侧一分为二，位于类芳烯类软骨（ArC）之间。
半喉右侧用纵平面（LZ1-LZ5）中的地标注释，对应于 表1中的五个纵向标志。半喉左侧在横截面（CZ1 和 CZ2）中标注有标记，分别对应于外侧 TA 肌的开始和声带的整个横截面。VF = 声带，CrC = 环状软骨，AlC = 胫骨软骨，T1 = 第一气管环。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：在对层粘连蛋白进行免疫染色后，在明场（右）和荧光488通道（左）中以10倍放大倍率成像的两个横截面，以勾勒肌肉纤维。
这些部分（从上到下）显示冷冻切除术期间按时间顺序的进展，甲状腺（a，b）出现在内侧TA肌和声带的固有层（c，d）之前。ThC = 甲状腺软骨，LTA = 外侧甲状腺样动脉，MTA = 内侧甲状腺样动脉。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：在对神经肌肉接头进行免疫染色后，在明场（右）和荧光488通道（左）中以10倍放大倍率成像的三个纵向切片。
这些部分（从上到下）显示冷冻切除术期间按时间顺序的进展，其中鼻翼肌（a，b）出现在内侧TA肌（c，d）之前，并出现在声带的固有层（e，f）之前。AlC = 甲状软骨，ThC = 甲状腺软骨，ArC = 类芳烯类软骨，LTA = 外侧甲状腺样肌，MTA = 内侧甲状腺素，SCA = 上类环状动脉。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 纵向地标 | 均值（标准偏差）（以 μm 为单位） | 范围（μm） | |
| 1.所有三个主要软骨（甲状腺，鼻翼，类肾上腺素）都随着肌肉纤维的出现而出现 | 1,591 (665) | 350–2,800 | |
| 2. 出现上颌骨样肌 （SCA）、鼻翼环状肌 （ACA） 和外侧甲状腺样肌 （LTA） | 2,344 (591) | 91–3,500 | |
| 3. ACA和LTA肌肉完全伸展，无碎裂 | 2,631 (532) | 1505–3,640 | |
| 4.类芳氨酸软骨增大，ACA消失，内侧甲状腺素（MTA）肌出现 | 2,948 (606) | 1765–4,305 | |
| 5.目标全声带部分：LTA和MTA肌肉完全伸展，无碎片化，出现固有层 | 3,131 (542) | 2205–4410 | |
| 横截面地标 | |||
| 1. LTA肌肉出现 | 303 (138) | 110–690 | |
| 2.出现MTA肌肉，约为LTA大小的50%，并注意到明显的固有层和上皮。 | 482 (167) | 210–850 | |
表1：冷冻切除术期间从甲状腺软骨首次出现到每个喉部标志的距离（以μm为单位）（n = 29）。
| 断续器 | 纵的 | |||||||
| 断续器 | 断续器 | 软骨 | 阿拉尔/爱生雅 | 断续器 | 断续器 | 断续器 | ||
| 断续器 | 断续器 | 1 | ||||||
| 断续器 | 0.88 | 1 | ||||||
| 纵的 | 软骨 | 0.42 | 0.42 | 1 | ||||
| 阿拉尔/爱生雅 | 0.57 | 0.47 | 0.77 | 1 | ||||
| 断续器 | 0.59 | 0.47 | 0.71 | 0.98 | 1 | |||
| 断续器 | 0.53 | 0.39 | 0.72 | 0.97 | 0.98 | 1 | ||
| 断续器 | 0.53 | 0.41 | 0.76 | 0.96 | 0.97 | 0.99 | 1 | |
| 重量 | -0.55 | -0.35 | 0.08 | -0.45 | -0.46 | -0.46 | -0.41 | |
表2：年轻雄性大鼠横截面（CSA）和纵平面中体重与喉部标志物深度之间的Pearson相关性结果。 LTA = 外侧甲状腺样肌，MTA = 内侧甲状腺样肌，SCA = 上类甲状腺，LP = 固有层。
| 断续器 | 纵的 | |||||||
| 断续器 | 断续器 | 软骨 | 阿拉尔/爱生雅 | 断续器 | 断续器 | 断续器 | ||
| 断续器 | 断续器 | 1 | ||||||
| 断续器 | 0.9 | 1 | ||||||
| 纵的 | 软骨 | 0.21 | 0.33 | 1 | ||||
| 阿拉尔/爱生雅 | 0.05 | 0.07 | 0.73 | 1 | ||||
| 断续器 | -0.06 | -0.04 | 0.64 | 0.96 | 1 | |||
| 断续器 | -0.02 | -0.02 | 0.6 | 0.79 | 0.84 | 1 | ||
| 断续器 | -0.17 | -0.15 | 0.52 | 0.76 | 0.85 | 0.91 | 1 | |
| 重量 | 0.23 | 0.13 | -0.24 | -0.07 | -0.15 | -0.15 | -0.3 | |
表3：老年雄性大鼠横截面（CSA）和纵平面中体重与喉部标志物深度之间的Pearson相关性结果。 LTA = 外侧甲状腺样肌，MTA = 内侧甲状腺样肌，SCA = 上类甲状腺，LP = 固有层。
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Discussion
准备用于神经肌肉分析的大鼠声带可能会带来各种挑战。喉部肌肉不仅小且被软骨包围，从而难以直接提取目标肌肉，而且在喉部解剖学标志物的深度上还发现了动物之间的高变异性。对于肌肉横截面方案，在腹侧甲状腺软骨最初出现后，完整的声带切片出现在21-85个切片（每节10μm）之间，这比NMJ分析方案纵平面中的63-126个截面（每节35μm）要少得多（表1）。
尽管每种方案的组织嵌入，定向和切片均匀，但喉标志物之间的距离仍存在变异性。此外，体重的差异没有解释从一组喉标志物到下一组喉标志物的组织深度范围的变异性。喉部标志物之间距离的这种差异可能是由于动物之间喉部解剖结构的个体差异，解剖时OCT化合物内冷冻剂中喉部方向的微小差异，或者切片时如何将标本放置在低温恒温器内的标本盘上（即，安装前放置在标本盘上的OCT化合物量或放置角度的微小差异）。
认识到标本制备中的这些微小差异会导致喉组织标志物深度的实质性差异，因此新手研究人员必须有一个参考地图来工作。概述的研究方案定义了识别感兴趣的肌肉和防止方案陷阱的方法 - 例如本文档中概述的那些 - 可以提高可重复性并防止不必要的组织损失。
虽然这项研究的重点是TA肌肉，但这种方法也适用于其他内在喉肌。例如，在纵向声带平面上进行切片可产生鼻翼、外侧 TA、内侧 TA、外侧膈肌和上膈肌的纵向肌纤维切片，以及后侧腱肌的横截面。在横截面声带平面上进行剖面可产生鼻翼、外侧 TA、内侧蝽蚣肌、上胭脂肌和胫骨肌的横截面，以及后胫骨肌的纵向截面。此外，尽管本研究不包括雌性大鼠，但雄性和雌性大鼠在喉部标志性外观方面的差异预计不会，因为大鼠喉部内的性二态性是肌肉特异性的，与喉骨框架解剖学无关16，18。
喉部标志物之间距离的变异性可能使新手研究者难以冷冻切除大鼠声带。该研究表明，尽管大鼠喉部的冷冻，嵌入和冷冻切除方式一致，但喉部标志物之间的距离差异很大;动物体重没有解释这种变异性。本研究提供了详细的程序和相关图像，说明如何适当地制备喉部肌肉组织，并确定喉部标志物，以进行大鼠声带的神经肌肉组织学研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了美国国立卫生研究院国家耳聋和其他沟通障碍研究所的F31DC017053-01A1（Lenell，PI）和K23DC014517（Johnson，PI）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. |
References
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