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Neuroscience

Neuromuscular विश्लेषण के लिए चूहा मुखर गुना की तैयारी

Published: May 15, 2020 doi: 10.3791/61327
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1NYU Voice Center, Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, New York University School of Medicine, 2Communicative Sciences and Disorders, New York University

Summary

यह प्रोटोकॉल हिस्टोकेमिकल न्यूरोमस्कुलर अध्ययन के लिए चूहे के मुखर सिलवटों को तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों का वर्णन करता है।

Abstract

इस ट्यूटोरियल का उद्देश्य हिस्टोकेमिकल न्यूरोमस्कुलर अध्ययन के लिए चूहे मुखर गुना की तैयारी का वर्णन करना है। यह प्रोटोकॉल चूहे स्वरयंत्र विच्छेदन, फ्लैश-फ्रीजिंग, और मुखर सिलवटों के क्रायोसेक्शनिंग के लिए प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है। यह अध्ययन वर्णन करता है कि अनुदैर्ध्य और क्रॉस-अनुभागीय विमानों दोनों में मुखर सिलवटों को कैसे क्रायोसेक्शन किया जाए। इस प्रोटोकॉल की एक नवीनता क्रायोसेक्शनिंग के दौरान स्वरयंत्र ट्रैकिंग है जो आंतरिक स्वरयंत्र की मांसपेशियों की सटीक पहचान सुनिश्चित करती है और ऊतक हानि की संभावना को कम करती है। आंकड़े दोनों विमानों में प्रगतिशील क्रायोसेक्शनिंग को प्रदर्शित करते हैं। उन्नीस चूहे हेमी-लैरींज को क्रायोसेक्शन किया गया था और थायरॉयड उपास्थि के उद्भव से पहले खंड की उपस्थिति तक ट्रैक किया गया था जिसमें पूर्ण मुखर गुना शामिल था। पूर्ण मुखर तह दोनों विमानों में सभी जानवरों के लिए कल्पना की गई थी। थायरॉयड उपास्थि की उपस्थिति से दूरी में दोनों विमानों में पूर्ण मुखर तह की उपस्थिति में उच्च परिवर्तनशीलता थी। वजन स्वरयंत्र स्थलों की गहराई से संबंधित नहीं था, यह सुझाव देते हुए कि व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता और ऊतक की तैयारी से संबंधित अन्य कारक सेक्शनिंग के दौरान स्थलों की उपस्थिति में उच्च परिवर्तनशीलता के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं। यह अध्ययन एक पद्धति का विवरण देता है और हिस्टोकेमिकल न्यूरोमस्कुलर जांच के लिए चूहे के मुखर गुना को तैयार करने के लिए रूपात्मक डेटा प्रस्तुत करता है। उच्च व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के कारण, क्रायोसेक्शनिंग के दौरान स्वरयंत्र स्थलों को बारीकी से ट्रैक किया जाना चाहिए ताकि ओवरसेक्शनिंग ऊतक और ऊतक हानि को रोका जा सके। एक सुसंगत पद्धति का उपयोग, जिसमें पर्याप्त ऊतक तैयारी और चूहे के स्वरयंत्र के भीतर स्थलों की जागरूकता शामिल है, अध्ययनों में लगातार परिणामों के साथ सहायता करेगा और स्वरयंत्र न्यूरोमस्कुलर तंत्र की जांच करने के लिए एक मॉडल के रूप में चूहे के मुखर गुना का उपयोग करने में रुचि रखने वाले नए शोधकर्ताओं की सहायता करेगा।

Introduction

चूहा स्वरयंत्र एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है जो विकास, उम्र बढ़ने, बीमारी और औषधीय एजेंटों के लिए संरचनात्मक और कार्यात्मक न्यूरोमस्कुलर स्वरयंत्र अनुकूलन की जांच करने के लिए है1,2,3,4,5। हिस्टोलॉजिकल विधियों की स्थिरता काम की इस पंक्ति के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि मांसपेशियों की तैयारी और विश्लेषण में कई पेचीदगियां शामिल हैं, साथ ही साथ स्वरयंत्र के उपास्थि के भीतर encapsulated मांसपेशियों के स्वरयंत्र आकार, आकार और स्थलाकृति से जुड़ी चुनौतियां हैं1,6,7,8,9,10,11 . चूहे के आंतरिक स्वरयंत्र की मांसपेशियों के छोटे आकार के कारण, व्यवस्थित एम्बेडिंग, ठंड, और क्रायोसेक्शनिंग सुसंगत और सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। उदाहरण के लिए, कोरोनल विमान में चूहे के मुखर गुना को विभाजित करते समय, आंतरिक स्वरयंत्र मांसपेशियों में से चार के न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) ऊतक गहराई के 1.8 मिमी से कम के भीतर स्थित होते हैं। इसलिए, क्रायोसेक्शनिंग के दौरान स्वरयंत्र मांसपेशी शरीर रचना विज्ञान की सटीक निगरानी ब्याज के अनुभाग (ओं) की सटीक पहचान करने और ऊतक के ओवरसेक्शनिंग को रोकने के लिए आवश्यक है। लक्ष्य मांसपेशी के oversectioning संख्या और NMJs11 की स्थलाकृति की गलत पहचान में परिणाम कर सकते हैं या नमूना आकार में समग्र कटौती में परिणाम कर सकते हैं यदि लक्ष्य मांसपेशी मील का पत्थर अभिविन्यास confusion12 के कारण छोड़ दिया जाता है. जैसा कि स्वरयंत्र की मांसपेशियों के अध्ययन के लिए उपन्यास मॉडल और उनके संबंधित अनुकूलन विकसित किए जाते हैं, मानक संचालन प्रक्रियाएं यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं कि परिणाम अध्ययनों में सटीक, विश्वसनीय और पुनरुत्पादक हैं।

इस लेख का उद्देश्य इष्टतम अनुदैर्ध्य और क्रॉस-अनुभागीय विश्लेषण के लिए चूहे मुखर गुना की तैयारी का विस्तार करना है। हमारी प्रयोगशाला में नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले विस्तृत तरीकों को क्रायोसेक्शनिंग के दौरान लक्षित मांसपेशियों के स्थलों की पहचान करने के लिए वर्णित किया गया है। यद्यपि कई प्रयोगशालाओं में इसी तरह के तरीकों का उपयोग किया जाता है, लेकिन नौसिखिए जांचकर्ताओं द्वारा लागू किए जाने पर विश्वसनीय और सटीक प्रतिकृति सुनिश्चित करने के लिए साहित्य की तुलना में यहां अधिक विस्तार प्रदान किया जाता है। इस ट्यूटोरियल का लक्ष्य प्रयोगशालाओं और जांच में स्थिरता में सुधार करने के लिए चूहे मुखर गुना के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) मूल्यांकन के लिए एक मानक पद्धति प्रदान करना है।

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Protocol

यह अध्ययन न्यूयॉर्क यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुपालन में किया गया था।

1. विच्छेदन चूहा स्वरयंत्र

  1. संस्थागत रूप से अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार चूहे को Euthanize करें। ऊतक के नमूनों में फर संदूषण को रोकने के लिए अल्कोहल के साथ मैंडिबल से मैनुब्रियम और स्वैब तक वेंट्रल गर्दन को शेव करें।
  2. 10x आवर्धन के साथ एक विच्छेदन दायरे के तहत श्वासनली उजागर होने तक एक स्केलपेल के साथ एक मिडलाइन गर्दन चीरा बनाकर पूरे स्वरयंत्र को एक्साइज करता है।
  3. संदंश और विच्छेदन कैंची या स्केलपेल का उपयोग करके स्वरयंत्र को उजागर करने के लिए मध्यरेखा पर वेंट्रल बाह्य स्वरयंत्र की मांसपेशियों को अलग करें।
  4. श्वासनली को तीसरे श्वासनली की अंगूठी में काट लें और विच्छेदन कैंची का उपयोग करके पूरे स्वरयंत्र को एक्साइज करने के लिए हाइओइड हड्डी के लिए एक चीरा रोस्ट्रल बनाएं।
  5. आवर्धन के तहत माइक्रोडिसेक्शन टूल (चिमटी, पिन, और माइक्रोसिस्सर) का उपयोग करके स्वरयंत्र से बाहरी स्वरयंत्र ऊतकों (एसोफैगस, थायरॉयड ग्रंथि, और बाह्य स्वरयंत्र की मांसपेशियों) को हटा दें।
  6. microscissors के साथ, एक मील का पत्थर के रूप में पश्च cricoarytenoid मांसपेशियों के बीच मध्य रेखा का उपयोग कर arytenoids के बीच स्वरयंत्र पृष्ठीय रूप से bisect. स्वरयंत्र की पार्श्व दीवारों को पिन करने के लिए मुखर सिलवटों को बेनकाब करने के लिए और फिर माइक्रोसिस्सर्स (चित्रा 1) के साथ मुखर सिलवटों के पूर्वकाल commissure के बीच थायरॉयड उपास्थि की मध्य रेखा के माध्यम से ventrally bisect।
    नोट:: यह चरण वैकल्पिक हो सकता है; इसे स्वरयंत्र को पूरा रखने के लिए छोड़ा जा सकता है। स्वरयंत्र का द्विभाजन एक ही स्वरयंत्र के दाएं और बाएं किनारों का अलग-अलग उपयोग करके कई इम्यूनोस्टेनिंग तकनीकों की अनुमति देता है।
  7. ~ 10 s के लिए फॉस्फेट बफ़र्ड समाधान (पीबीएस) में प्रत्येक हेमी-स्वरयंत्र को कुल्ला करें और ठंड के दौरान बर्फ क्रिस्टल गठन को कम करने के लिए एक कार्य वाइपर के साथ नाजुक रूप से सूखा हो।

2. फिक्स और / या फ्लैश फ्रीज स्वरयंत्र ऊतक

नोट: निर्धारण सभी immunostaining प्रोटोकॉल के लिए आदर्श नहीं हो सकता है। अक्सर स्वरयंत्र ऊतक विच्छेदन के तुरंत बाद फ्लैश-जमे हुए ताजा होते हैं। चरण 2.1 को फ़्लैश-फ्रीज स्वरयंत्र ऊतक के लिए फिक्सेशन के बिना छोड़ दें।

  1. हेमी-लैरींज को ठीक करने के लिए 70 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 4% फॉर्मेल्डिहाइड से भरे सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ऊतकों को रखें। एक साफ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए ऊतकों को स्थानांतरित करें और पीबीएस में 20 मिनट के लिए 3x कुल्ला करें। फिर एक साफ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20% सुक्रोज / 5% ग्लिसरॉल समाधान (~ 18 एच या ऊतक सिंक तक) में डूब जाएं।
    सावधानी: Formaldehyde खतरनाक है और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के साथ एक धुएं हुड में इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  2. इष्टतम काटने के तापमान (OCT) यौगिक से भरे क्रायो-मोल्ड में एक समान स्थिति में सभी हेमी-लैरींज रखें। एक hemilarynx के लिए, क्रायोमोल्ड के नीचे का सामना करने वाले मुखर गुना की औसत दर्जे की सतह के साथ ऊतक को रखें और क्रायोमोल्ड उद्घाटन के निचले किनारे के समानांतर मुखर गुना के अनुदैर्ध्य पहलू का सामना करें। पूरे स्वरयंत्र के लिए, क्रायोमोल्ड के निचले हिस्से का सामना करने वाले पीछे के क्रिकोएरीटेनोइड्स के साथ ऊतक को रखें और क्रायोमोल्ड उद्घाटन के निचले किनारे के समानांतर मुखर गुना के अनुदैर्ध्य पहलू का सामना करें।
    नोट: OCT यौगिक के भीतर लगातार स्वरयंत्र अभिविन्यास चूहे मुखर गुना के cryosectioning के लिए महत्वपूर्ण है। एक बार जब हेमिलरिंक्स एम्बेडेड और जमे हुए हो जाता है, तो इसे अपने अभिविन्यास को बदलने के लिए पिघलाया जाना चाहिए, जिससे कई पिघलने-फ्रीज चक्रों से ऊतक क्षति के जोखिम ों को पेश किया जा सके।
  3. तरल नाइट्रोजन से घिरे स्टील बीकर में आइसोपेन्टेन (2-मिथाइलब्यूटेन) का उपयोग करके फ्लैश-फ्रीज ऊतकों को ठंडा किया जाता है।
    नोट: आइसोपेन्टेन ऊतक ठंड के लिए इष्टतम तापमान तक पहुंचता है जब सफेद अवक्षेप बीकर 13 के किनारों और नीचे बनना शुरू हो जाते हैं। आइसोपेन्टेन का उपयोग इसलिए किया जाता है क्योंकि इसमें तरल नाइट्रोजन की तुलना में उच्च तापीय चालकता होती है, जो तेजी से ठंड के दौरान ऊतक ब्लॉक के क्रैकिंग को रोकने में मदद करती है। OTC में ठंड ऊतक के अधिक विस्तृत विवरण के लिए कुमार एट अल.13 देखें।
  4. निर्जलीकरण को रोकने के लिए प्रत्येक मोल्ड को प्रीलेबल पन्नी में लपेटें और एक व्यक्तिगत फ्रीजर बैग में रखें और तुरंत सूखी बर्फ पर स्टोर करें जब तक कि -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में भंडारण के लिए स्थानांतरित न हो जाए।

3. क्रायोसेक्शन हेमिलरीनक्स में क्रॉस-अनुभागीय विमान

  1. क्रायोस्टेट में कक्ष का तापमान -20 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, जो निर्माता के मैनुअल द्वारा मांसपेशियों के ऊतकों के विभाजन के लिए अनुशंसित तापमान सीमा (15-25 डिग्री सेल्सियस) के बीच में है।
  2. क्रायोस्टेट अनुभाग मोटाई को 10 μm मोटे वर्गों पर सेट करें।
    नोट: मांसपेशी फाइबर क्रॉस-अनुभागीय विश्लेषण के लिए, 10 μm मोटी अनुभागों फाइबर टाइपिंग विश्लेषण 14,15,16 के लिए लेबल मांसपेशी फाइबर की पूर्ण धुंधला और मजबूत इमेजिंग तीव्रता के लिए अनुमति देने के लिए इष्टतम हैं। कुछ प्रोटोकॉल को न्यूरोमस्कुलर लक्ष्यों के आधार पर विभिन्न अनुभाग मोटाई की आवश्यकता हो सकती है।
  3. क्रायोस्टेट कक्ष में ऊतकों को स्थानांतरित करें, क्रायोस्टेट नमूना डिस्क (चक) पर ओसीटी यौगिक की एक समान परत जोड़ें, और नमूना डिस्क पर ओसीटी यौगिक के शीर्ष पर एम्बेडेड ऊतक ब्लॉक रखें। थायरीटेनोइड (टीए) मांसपेशी फाइबर विश्लेषण के लिए मुखर गुना के क्रॉस-सेक्शन प्राप्त करने के लिए, नमूने को चक पर चिपकाएं ताकि वेंट्रल थायरॉयड उपास्थि क्रायोस्टेट ब्लेड का सामना करे और एरिटेनोइड उपास्थि नमूना डिस्क का सामना करे।
    नोट: यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ये स्थल इस स्तर पर दिखाई नहीं दे रहे हैं, क्योंकि ओसीटी यौगिक जमे हुए होने पर सफेद और अपारदर्शी हो जाता है। दृश्यता की यह कमी यही कारण है कि फ्लैश फ्रीजिंग चरण के दौरान हेमिलरीनक्स के अभिविन्यास को नोट करना महत्वपूर्ण है।
  4. थायराइड उपास्थि के वेंट्रल भाग के प्रकट होने तक नमूना सिर को 100 μm तक आगे बढ़ाकर OCT यौगिक ट्रिम करें।
  5. फिर ट्रिम और थायराइड उपास्थि की शुरुआत से 30 μm वर्गों को ट्रैक जब तक लामिना propria, औसत दर्जे का टीए मांसपेशियों, और पार्श्व टीए मांसपेशियों को उजागर कर रहे हैं.
    नोट: स्वरयंत्र स्थलों को ट्रैक किया जाना चाहिए और थायरॉयड उपास्थि की शुरुआत से हर 100 μm पर ध्यान दिया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सेक्शनिंग का कोण तिरछा नहीं है। चित्रा 2 10x आवर्धन पर क्रॉस-अनुभागीय विमान में स्वरयंत्र स्थलों के दो सेटों का प्रतिनिधित्व करता है।
  6. एक बार लक्ष्य टीए मांसपेशी तक पहुंचने के बाद, 10 μm पर सकारात्मक रूप से चार्ज की गई स्लाइड पर अनुभागों को इकट्ठा करें।
  7. नमी को बनाए रखने के लिए पीबीएस में अनुभागों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि वे दाग के लिए तैयार न हों।
    नोट: निश्चित ऊतक को आईएचसी लक्ष्य के आधार पर एक सप्ताह तक पीबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है जबकि अनफिक्स्ड ऊतक को तुरंत संसाधित किया जाना चाहिए।

4. अनुदैर्ध्य विमान में क्रायोसेक्शन हेमिलरीनक्स

  1. क्रायोस्टेट कक्ष के साथ फिर से -20 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, अनुभाग की मोटाई को 30 μm में बदलें।
    नोट: NMJ विश्लेषण के लिए, 30−60 μm के बीच एक ऊतक मोटाई का उपयोग तंत्रिका टर्मिनल या मोटर एंडप्लेट 11,12,17 के विखंडन के बिना स्वरयंत्र की मांसपेशियों के भीतर कई पूर्ण NMJs को कैप्चर करने के लिए किया जा सकता है।
  2. टीए मांसपेशी के एनएमजे विश्लेषण के लिए अनुदैर्ध्य मुखर गुना वर्गों को प्राप्त करने के लिए, नमूनों को चक पर चिपकाएं ताकि एपिग्लोटिस क्रायोस्टेट ब्लेड की ओर उन्मुख हो और श्वासनली लुमेन नमूना डिस्क की ओर नीचे का सामना करे।
  3. थायराइड उपास्थि दिखाई देने तक नमूना सिर को 100 μm तक आगे बढ़ाकर OCT यौगिक को ट्रिम करें।
  4. ट्रिम और थायराइड की शुरुआत से 30 μm के वर्गों को ट्रैक जब तक लामिना propria और औसत दर्जे का और टीए मांसपेशी के पार्श्व विभाजन उजागर कर रहे हैं.
    नोट: अनुदैर्ध्य विमान में स्वरयंत्र स्थलों के पांच सेट लक्ष्य टीए मांसपेशी की ओर ऊतक गहराई प्रगति को ट्रैक करने की सिफारिश की जाती है। चित्रा 3 10x आवर्धन पर अनुदैर्ध्य विमान में स्वरयंत्र स्थलों का प्रतिनिधित्व करता है।
  5. एक बार लक्ष्य टीए मांसपेशी तक पहुंचने के बाद, 30 μm पर सकारात्मक रूप से चार्ज स्लाइड पर अनुभागों को इकट्ठा करें।
  6. नमी को बनाए रखने के लिए पीबीएस में अनुभागों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि वे दाग के लिए तैयार न हों।

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Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम स्वरयंत्र न्यूरोमस्कुलर सिस्टम पर मुखर व्यायाम के प्रभावों की चल रही जांच का हिस्सा थे। उन्नीस नर फिशर 344 / भूरे रंग के नॉर्वे चूहों (12 9 महीने के, 17 24 महीने के) को सीओ 2 इनहेलेशन के साथ तौला गया और euthanized किया गया, जिसके बाद एक द्विपक्षीय थोराकोटॉमी हुई।

प्रक्रियाओं ने एनएमजे और पार्श्व और औसत दर्जे के टीए मांसपेशियों के फाइबर आकार को लेबल करने के लिए उल्लिखित प्रोटोकॉल का पालन किया। स्वरयंत्र स्थलों के बीच की दूरी को क्रायोसेक्शनिंग के दौरान प्रगति निर्धारित करने के लिए स्वरयंत्र की मांसपेशियों और आसपास के उपास्थि का उपयोग करके अनुदैर्ध्य और क्रॉस-अनुभागीय दोनों विमानों में ट्रैक किया गया था (तालिका 1)। ट्रैकिंग दोनों दिशात्मक विमानों में थायरॉयड उपास्थि की पहली उपस्थिति में शुरू हुई। चित्रा 2 थायराइड (चित्रा 2ए, बी) के साथ अस्थायी क्रम में क्रॉस-अनुभागीय क्रायोसेक्शनिंग के दौरान स्वरयंत्र स्थलों की उपस्थिति को दर्शाता है, जो औसत दर्जे की टीए मांसपेशी से पहले और लामिना प्रोपरिया (चित्रा 2 सी, डी) से पहले दिखाई देता है। चित्रा 3 अनुदैर्ध्य क्रायोसेक्शनिंग के दौरान लैरेन्जियल लैंडमार्क की उपस्थिति को दर्शाता है, जिसमें एलार मांसपेशी (चित्रा 3 ए, बी) के साथ अस्थायी क्रम में औसत दर्जे की टीए मांसपेशी (चित्रा 3 सी, डी) और लैमिना प्रोपरिया (चित्रा 3ई, एफ) से पहले दिखाई देता है।

दोनों दिशात्मक विमानों में, स्थलों के बीच की दूरी व्यक्तिगत जानवरों के लिए बहुत भिन्न होती है।

वजन और स्वरयंत्र मील का पत्थर दिखावे में युवा चूहों के लिए कमजोर से मध्यम सहसंबंध और वृद्ध चूहों के लिए कमजोर सहसंबंध थे (तालिका 2 और तालिका 3)। प्रत्येक विमान के भीतर स्थलों के बीच की दूरी दोनों आयु समूहों के लिए दृढ़ता से सहसंबद्ध थी, लेकिन दो विच्छेदन विमानों के बीच कमजोर रूप से सहसंबद्ध थी। इसलिए, लैंडमार्क उपस्थिति में परिवर्तनशीलता वजन या स्वरयंत्र आकार में व्यक्तिगत भिन्नताओं के लिए जिम्मेदार नहीं हो सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: एक चूहा स्वरयंत्र पृष्ठीय रूप से एरिटेनोइड उपास्थि (एआरसी) के बीच विभाजित होता है।
हेमी-स्वरयंत्र के दाईं ओर अनुदैर्ध्य विमान (LZ1-LZ5) में स्थलों के साथ एनोटेट किया गया है जो तालिका 1 में पांच अनुदैर्ध्य स्थलों के अनुरूप है। हेमी-स्वरयंत्र के बाईं ओर क्रॉस-सेक्शनल प्लेन (CZ1 और CZ2) में लैंडमार्क के साथ एनोटेट किया गया है जो क्रमशः पार्श्व टीए मांसपेशी की शुरुआत और मुखर गुना के पूर्ण क्रॉस-सेक्शन के अनुरूप है। VF = मुखर गुना, CrC = cricoid उपास्थि, AlC = alar उपास्थि, और T1 = पहली श्वासनली की अंगूठी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: दो क्रॉस-सेक्शन ब्राइटफील्ड (दाएं) में 10x आवर्धन पर और फ्लोरोसेंट 488 चैनल (बाएं) में मांसपेशियों के तंतुओं को रेखांकित करने के लिए लैमिनिन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के बाद चित्रित किए गए हैं।
अनुभागों (ऊपर से नीचे तक) थायरॉयड (ए, बी) के साथ अस्थायी क्रम में क्रायोसेक्शनिंग के दौरान प्रगति दिखाते हैं, जो औसत दर्जे के टीए मांसपेशी से पहले और मुखर गुना (सी, डी) के लामिना प्रोपरिया के लिए दिखाई देते हैं। ThC = थायराइड उपास्थि, LTA = पार्श्व thyroarytenoid, और MTA = औसत दर्जे का thyroarytenoid. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: तीन अनुदैर्ध्य वर्गों ब्राइटफील्ड (दाएं) में 10x आवर्धन पर और फ्लोरोसेंट 488 चैनल (बाएं) में न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के लिए immunostaining के बाद चित्रित किया गया।
अनुभागों (ऊपर से नीचे तक) एलार मांसपेशी (ए, बी) के साथ अस्थायी क्रम में क्रायोसेक्शनिंग के दौरान प्रगति दिखाते हैं, जो औसत दर्जे की टीए मांसपेशी (सी, डी) से पहले और मुखर गुना के लामिना प्रोपरिया (ई, एफ) से पहले दिखाई देते हैं। AlC = alar उपास्थि, ThC = थायराइड उपास्थि, ArC = arytenoid उपास्थि, LTA = पार्श्व thyroarytenoid, MTA = औसत दर्जे का थायरीटेनोइड, और एससीए = बेहतर cricoarytenoid। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुदैर्ध्य स्थलों μm में माध्य (मानक विचलन) μm में सीमा
1. सभी तीन प्रमुख उपास्थि (थायरॉयड, अलार, arytenoid) मांसपेशियों के तंतुओं के उद्भव के साथ दिखाई दिया 1,591 (665) 350–2,800
2. सुपीरियर cricoarytenoid (एससीए), alar cricoarytenoid (एसीए), और पार्श्व thyroarytenoid (एलटीए) मांसपेशियों दिखाई दिया 2,344 (591) 91–3,500
3. एसीए और एलटीए मांसपेशियों विखंडन के बिना पूरी तरह से विस्तारित 2,631 (532) 1505–3,640
4. Arytenoid उपास्थि बढ़े हुए, एसीए गायब हो गया, औसत दर्जे का थायरोरिएटिनोइड (एमटीए) मांसपेशी उभरा 2,948 (606) 1765–4,305
5. लक्ष्य पूर्ण मुखर गुना अनुभाग: एलटीए और एमटीए मांसपेशियों विखंडन और लामिना propria के बिना पूरी तरह से विस्तारित उभरा 3,131 (542) 2205–4410
क्रॉस-अनुभागीय स्थलों
1. एलटीए मांसपेशी दिखाई दिया 303 (138) 110–690
2. एमटीए मांसपेशी दिखाई दिया और स्पष्ट लामिना propria और उपकला के साथ एलटीए आकार का ~ 50% नोट किया गया था. 482 (167) 210–850

तालिका 1: क्रायोसेक्शनिंग के दौरान प्रत्येक स्वरयंत्र मील के पत्थर के लिए थायरॉयड उपास्थि की पहली उपस्थिति से μm में दूरी (एन = 29)।

CSA अनुदैर्घ्य
LTA MTA उपास्थि अलार/एससीए LTA MTA LP
CSA LTA 1
MTA 0.88 1
अनुदैर्घ्य उपास्थि 0.42 0.42 1
अलार/एससीए 0.57 0.47 0.77 1
LTA 0.59 0.47 0.71 0.98 1
MTA 0.53 0.39 0.72 0.97 0.98 1
LP 0.53 0.41 0.76 0.96 0.97 0.99 1
वजन -0.55 -0.35 0.08 -0.45 -0.46 -0.46 -0.41

तालिका 2: वजन और क्रॉस-अनुभागीय (सीएसए) और युवा नर चूहों के लिए अनुदैर्ध्य विमानों में स्वरयंत्र स्थलों की गहराई के बीच पियर्सन सहसंबंध के परिणाम। LTA = पार्श्व thyroarytenoid, MTA = औसत दर्जे का thyroarytenoid, एससीए = बेहतर cricoarytenoid, और LP = लामिना प्रोपरिया।

CSA अनुदैर्घ्य
LTA MTA उपास्थि अलार/एससीए LTA MTA LP
CSA LTA 1
MTA 0.9 1
अनुदैर्घ्य उपास्थि 0.21 0.33 1
अलार/एससीए 0.05 0.07 0.73 1
LTA -0.06 -0.04 0.64 0.96 1
MTA -0.02 -0.02 0.6 0.79 0.84 1
LP -0.17 -0.15 0.52 0.76 0.85 0.91 1
वजन 0.23 0.13 -0.24 -0.07 -0.15 -0.15 -0.3

तालिका 3: पुराने नर चूहों के लिए क्रॉस-सेक्शनल (सीएसए) और अनुदैर्ध्य विमानों में वजन और स्वरयंत्र स्थलों की गहराई के बीच पियर्सन सहसंबंध के परिणाम। LTA = पार्श्व thyroarytenoid, MTA = औसत दर्जे का thyroarytenoid, एससीए = बेहतर cricoarytenoid, और LP = लामिना प्रोपरिया।

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Discussion

न्यूरोमस्कुलर विश्लेषण के लिए चूहे मुखर सिलवटों की तैयारी विभिन्न चुनौतियों के साथ पेश कर सकते हैं। न केवल स्वरयंत्र की मांसपेशियां छोटी होती हैं और उपास्थि से घिरी होती हैं, जिससे सीधे लक्ष्य मांसपेशियों को निकालना मुश्किल हो जाता है, स्वरयंत्र शारीरिक स्थलों की गहराई में जानवरों के बीच उच्च परिवर्तनशीलता भी पाई गई थी। मांसपेशियों के लिए क्रॉस-सेक्शन प्लेन प्रोटोकॉल, वेंट्रल थायरॉयड उपास्थि की प्रारंभिक उपस्थिति के बाद 21-85 वर्गों (10 μm प्रति अनुभाग) के बीच पूर्ण मुखर गुना अनुभाग दिखाई दिए, जो एनएमजे विश्लेषण प्रोटोकॉल (तालिका 1) के लिए अनुदैर्ध्य विमान में 63-126 वर्गों (35 μm प्रति अनुभाग) की तुलना में काफी कम है।

परिवर्तनशीलता को प्रत्येक प्रकार के प्रोटोकॉल के लिए ऊतकों के समान एम्बेडिंग, ओरिएंटिंग और सेक्शनिंग के बावजूद स्वरयंत्र स्थलों के बीच की दूरी में नोट किया गया था। इसके अलावा, शरीर के वजन में अंतर स्वरयंत्र स्थलों के एक सेट से अगले तक ऊतक की गहराई की विस्तृत श्रृंखलाओं में परिवर्तनशीलता के लिए जिम्मेदार नहीं था। स्वरयंत्र स्थलों के बीच की दूरी में यह परिवर्तनशीलता जानवरों में स्वरयंत्र शरीर रचना विज्ञान में व्यक्तिगत अंतर के कारण हो सकती है, विच्छेदन के समय ओसीटी यौगिक के भीतर क्रायोमोल्ड में लैरींज के अभिविन्यास में छोटे अंतर, या कैसे नमूनों को क्रायोस्टेट के भीतर नमूना डिस्क पर रखा गया था जब सेक्शनिंग (यानी, प्लेसमेंट के कोण में बढ़ते या मामूली अंतर से पहले नमूना डिस्क पर रखे गए ओसीटी यौगिक की मात्रा)।

एक समझ के साथ कि नमूना तैयारी में इन मामूली अंतरों से स्वरयंत्र ऊतक स्थलों की गहराई में पर्याप्त परिवर्तनशीलता हो सकती है, यह महत्वपूर्ण है कि नौसिखिए जांचकर्ताओं के पास एक संदर्भ मानचित्र है जिसमें से काम करना है। ब्याज की मांसपेशियों (ओं) की पहचान करने और प्रोटोकॉल नुकसान को रोकने के तरीकों को परिभाषित करने वाले उल्लिखित अध्ययन प्रोटोकॉल- जैसे कि इस दस्तावेज़ में उल्लिखित- पुनरुत्पादन में सुधार कर सकते हैं और अवांछित ऊतक हानि को रोक सकते हैं।

यद्यपि यह अध्ययन टीए मांसपेशी पर केंद्रित है, यह पद्धति अन्य आंतरिक स्वरयंत्र की मांसपेशियों के लिए भी लागू होती है। उदाहरण के लिए, अनुदैर्ध्य मुखर गुना विमान में विभाजित करने से एलार, पार्श्व टीए, औसत दर्जे का टीए, पार्श्व क्रिकोएरीटेनोइड, और बेहतर क्रिकोएरीटेनोइड मांसपेशियों के अनुदैर्ध्य मांसपेशी फाइबर वर्गों, और पीछे के क्रिकोएरिएटिनोइड मांसपेशियों के क्रॉस-सेक्शन उत्पन्न होते हैं। क्रॉस-अनुभागीय मुखर गुना विमान में सेक्शनिंग से एलार, पार्श्व टीए, औसत दर्जे का टीए, पार्श्व क्रिकोएरीटेनॉयड, बेहतर क्रिकोएरीटेनोइड, और क्रिकोथायराइड मांसपेशियों के साथ-साथ पश्चवर्ती क्रिकोएरीटिनोइड मांसपेशियों के अनुदैर्ध्य वर्गों के क्रॉस-सेक्शन उत्पन्न होते हैं। इसके अतिरिक्त, हालांकि इस अध्ययन में मादा चूहों को शामिल नहीं किया गया था, स्वरयंत्र मील का पत्थर उपस्थिति में नर और मादा चूहों के बीच अंतर की उम्मीद नहीं की जाती है क्योंकि चूहे के स्वरयंत्र के भीतर यौन द्विरूपता मांसपेशियों के विशिष्ट है और स्वरयंत्र ढांचे के शरीर रचना विज्ञान से संबंधित नहीं है16,18।

स्वरयंत्र स्थलों के बीच की दूरी में परिवर्तनशीलता नौसिखिए जांचकर्ताओं के लिए चूहे के मुखर गुना को क्रायोसेक्शनिंग करना मुश्किल बना सकती है। इस अध्ययन से पता चला है कि चूहे के स्वरयंत्र कैसे जमे हुए, एम्बेडेड और क्रायोसेक्शन किए गए थे, इसमें स्थिरता के बावजूद, स्वरयंत्र स्थलों के बीच की दूरी बहुत भिन्न थी; पशु वजन इस परिवर्तनशीलता के लिए खाता नहीं था। यह अध्ययन संबंधित छवियों के साथ विस्तृत प्रक्रियाएं प्रदान करता है कि कैसे उचित रूप से स्वरयंत्र मांसपेशियों के ऊतकों को तैयार किया जाए और चूहे के मुखर गुना की न्यूरोमस्कुलर हिस्टोलॉजिकल जांच के लिए स्वरयंत्र स्थलों की पहचान की जाए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को अनुदान F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) और K23DC014517 (जॉनसन, पीआई) द्वारा समर्थित किया गया था राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के बहरापन और अन्य संचार विकारों पर राष्ट्रीय संस्थान से।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane Certified Fisher Chemical 35514
Aluminum Foil Fisherbrand 1213101
Cryo Tongs SS Thermo Scientific 11679123
Cryostat Leica Biosystems CM3050
Cryostat blades C.L. Sturkey D554X50 22-210-045
Disposable Base Molds 15mm x 15mm Thermo Scientific 41-741
Disposable Underpads Medline 23-666-062
Dissection kit Thermo Scientific 9996969
DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190136
Frozen Section Medium Fisher Healthcare 23-730-571
Ice Bucket Bel-Art 11999054
Immunostain Moisture Chamber Ted Pella Inc NC9425474
Needle holders Assi ASSI.B148
Non-Woven Sponges, 4 Ply Quick Medical 9023
Orbital shaker Troemner 02-217-987
Pap pen
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar 50-00-0
Premium Microcentrifuge Tubes Fisherbrand 5408129
Specimen Storage Bags Fisherbrand 19240093
Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL Polar Ware 114231B
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Task wiper Kimberly-Clark Professional™ 34155 06666A
Timer Fisherbrand 2261840
Vannas Pattern Scissors Assi ASSI.SAS15RV
NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.

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References

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तंत्रिका विज्ञान मुद्दा 159 चूहा मुखर गुना histology मुखर गुना स्वरयंत्र thyroarytenoid मांसपेशी आवाज
Neuromuscular विश्लेषण के लिए चूहा मुखर गुना की तैयारी
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Lenell, C., Shembel, A. C., Johnson, … More

Lenell, C., Shembel, A. C., Johnson, A. M. Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses. J. Vis. Exp. (159), e61327, doi:10.3791/61327 (2020).

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