Summary
このプロトコルは、検査用神経筋研究のためのラットの声の折り目を準備するために使用される方法を記述します。
Abstract
このチュートリアルの目的は、神経筋の研究のためのラットの声の折り目の準備を説明することです。このプロトコルは、ラット喉頭解剖、フラッシュ凍結、および声帯の凍結切断の手順を概説する。本研究では、縦方向および断面面の両方で声を折るクライオセクションの方法を説明する。このプロトコルの目新しさは、本質的な喉頭筋の正確な同定を保証し、組織喪失の可能性を低減する、凍結切断中の喉頭追跡である。図は、両方の平面の進行性の凍結切断を示しています。29匹のラットヘミ喉頭は、甲状腺軟骨の出現から、完全な声の折り目を含む最初のセクションの出現まで、凍結切断され、追跡された。完全なボーカルフォールドは、両方の平面のすべての動物のために視覚化されました。甲状腺軟骨の出現から両方の平面におけるフルボーカルフォールドの出現までの距離には、高いばらつきがあった。体重は喉頭のランドマークの深さと相関しておらず、個々の変動性および組織製剤に関連する他の要因が、断面化中のランドマークの出現における高い変動性を引き起たす可能性があることを示唆した。本研究は、方法論を詳述し、組織化学的神経筋の調査のためにラットの声の折り目を準備するための形態学的データを提示する。個人の変動性が高いため、喉頭のランドマークは、組織および組織の損失を切除することを防ぐために、凍結切断中に密接に追跡する必要があります。ラット喉頭内のランドマークの適切な組織準備と意識を含む一貫した方法論の使用は、研究全体で一貫した結果を支援し、喉頭神経筋メカニズムを調査するためのモデルとしてラットボーカルフォールドを使用することに興味を持つ新しい研究者を支援します。
Introduction
ラット喉頭は、発達、老化、疾患および薬理学的薬剤1,2,3,4,5に対する構造的および機能的な神経筋喉頭適応を調査するための確立されたモデルである。組織学的方法の一貫性は、筋肉の準備と分析に関与する複数の複雑さだけでなく、喉頭軟骨内にカプセル化された筋肉の喉頭の大きさ、形状、および地形に関連する課題があるので、この作業ラインに不可欠です1,6,7,8,9,10,11 .ラットの本来の喉頭筋のサイズが小さいため、系統的埋め込み、凍結、および凍結切断は、一貫した正確な結果を達成するために重要です。例えば、ラットの声帯をコロナ平面で切り離すとき、4つの内在性喉頭筋の神経筋接合(NJ)は、組織深度11の1.8mm未満以内に位置する。したがって、凍結切断中の喉頭筋解剖学の正確なモニタリングは、対象のセクションを正確に特定し、組織の過剰切除を防ぐことが不可欠です。ターゲット筋肉の過大な切断は、NMJs11の数と地形の不正確な識別をもたらすか、または目標筋肉がランドマークの向きの混乱のために廃棄された場合、サンプルサイズの全体的な減少をもたらす可能性があります12。喉頭筋の研究とそれぞれの適応の新しいモデルが開発される中で、結果が正確で信頼性が高く、研究全体で再現可能であることを保証するためには、標準的な手術手順が不可欠です。
本稿の目的は、最適な縦断および断面分析のためのラットの声の折り目の調製を詳述することです。当研究室で定期的に使用される詳細な方法は、凍結切断中に標的筋のランドマークを同定するために記述されています。同様の方法は複数の研究室で使用されていますが、初心者の研究者によって実装された場合に信頼性と正確なレプリケーションを確実にするために、文献よりも詳細な情報が提供されています。このチュートリアルの目的は、検査室と調査の一貫性を向上させるために、ラットの声帯の免疫組織化学(IHC)評価のための標準的な方法論を提供することです。
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Protocol
この研究は、ニューヨーク大学医学部の施設動物ケア・使用委員会に従って行われました。
1. ラット喉頭を解剖する
- 制度的に承認されたプロトコルに従ってラットを安楽死させる。組織標本の毛皮の汚染を防ぐために、下顎からマニュリウムに腹側の首を剃り、アルコールで綿棒を剃ります。
- 10倍の拡大率を持つ解剖スコープの下で、気管が露出するまでメスで中線の首の切開を作成することによって喉頭全体を切除する。
- 中線で腹側外線喉頭筋を分離し、鉗子と解剖ハサミまたはメスを使用して喉頭を露出させます。
- 気管尾骨を第3気管リングに切断し、舌骨に切開ロストラルを作り、切除ハサミを使って喉頭全体を切除する。
- 拡大縮小の下で、マイクロディスセクションツール(ピンセット、ピン、ピン、マイクロシザー)を使用して喉頭から外因性喉頭組織(食道、甲状腺、外回喉頭筋)を取り除きます。
- マイクロシザーでは、後部コラリテノイド筋肉の間の正中線をランドマークとして使用して、喉頭をarytenoidの間にドーセリーします。喉頭の横壁をピンで留め、声帯を露出させ、次いでマイクロシザーで声の前部のコミュシャの間の甲状腺軟骨の正中線を通って腹孔を二分する(図1)。
注: この手順はオプションです。喉頭全体を保つためにスキップすることができます。喉頭の二角切除は、同じ喉頭の左右の側面を別々に使用することにより、複数の免疫染色技術を可能にする。 - 各ヘミ喉頭をリン酸緩衝溶液(PBS)で~10秒にリンスし、凍結中の氷晶形成を低減する作業ワイパーで繊細に乾燥させます。
2. 喉頭組織の固定および/またはフラッシュフリーズ
注: 固定は、すべての免疫染色プロトコルに最適とはいえない場合があります。多くの場合、喉頭組織は、解剖直後に新鮮なフラッシュ冷凍である。ステップ 2.1 をスキップして、固定せずに喉頭組織をフラッシュフリーズします。
- ヘミ喉頭を固定するために、PBSで4%ホルムアルデヒドを充填した遠心管に組織を配置し、70rpmで軌道シェーカー上の室温で1時間置く。ティッシュをきれいな遠心管に移し、PBSで20分間3倍洗いします。その後、クリーン遠心管に移し、4°Cで20%スクロース/5%グリセロール溶液(約18時間または組織が沈むまで)に沈水する。
注意:ホルムアルデヒドは危険であり、適切な個人用保護具と一緒にヒュームフードで使用する必要があります。 - すべてのヘミ喉頭を均一な位置に配置し、最適な切削温度(OCT)化合物で満たされたクライオモールドに入れます。ヘミラNXの場合は、声帯の内側の表面がクリオマールの底に面し、声楽の縦方向の側面がクリオマール開口部の下端と平行に配置されます。喉頭全体の場合、クリオマールの底に向かって後部クリコアリテノイドと、声楽の縦方向の側面を、クリオマール開口部の下端と平行に配置します。
注:OCTコンパウンド内の一貫した喉頭配は、ラットの声帯の凍結切断に重要です。ヘミヤNXが埋め込まれ凍結されると、その向きを変更するために解凍する必要があり、それによって、複数の融解凍結サイクルによる組織損傷のリスクを導入する。 - 液体窒素に囲まれたスチールビーカーで冷やされたイセペンタン(2-メチルブタン)を用いたフラッシュフリーズ組織。
注:白い沈殿物がビーカー13の側面および底部に形成され始めると、isopentaneは組織凍結のための最適な温度に達する。イセペタンは液体窒素よりも熱伝導率が高いため使用され、急速凍結時の組織ブロックの割れを防ぐのに役立ちます。OTCにおける凍結組織のより詳細な説明については、クマールら13を参照してください。 - 各金型を事前にラベル付けされたホイルで包み、脱水を防ぐために個々の冷凍袋に入れ、-80°C冷凍庫に保管するために移されるまですぐにドライアイスに保管します。
3. 断面面におけるクライオセクションヘミヤクス
- クライオスタットのチャンバー温度を-20 °Cに設定し、メーカーのマニュアルで筋肉組織の切断に推奨される温度範囲(15-25 °C)の真ん中にあります。
- クライオスタットセクションの厚さを10μmの厚いセクションに設定します。
注:筋線維断字解析では、10 μmの厚い断面が最適で、繊維タイピング解析用のラベル付き筋繊維の完全な染色と堅牢なイメージング強度を可能にします14,15,16。いくつかのプロトコルは、神経筋の標的に応じて異なるセクション厚さを必要とするかもしれない。 - 凍結スタットチャンバーに組織を移し、凍結スタット標本ディスク(チャック)にOCT化合物の均一な層を追加し、組み込まれた組織ブロックをOCT化合物の上に置きます。チロイルテノイド(TA)筋線維解析のために声帯の断面を得るために、腹側甲状腺軟骨がクライオスタットブレードに面し、アリテノイド軟骨が検体円盤に面するように、試料をチャックに貼り付ける。
注: これらのランドマークは、OCT コンパウンドが凍結すると白色になり不透明になるため、この段階では表示されないことに注意してください。この視界の欠如は、フラッシュ凍結段階でヘミラリクスの向きに注意することが重要である理由です。 - 甲状腺軟骨の腹側部分が現れるまで、検体頭部を100μm進めることによりOCT化合物をトリムする。
- 次に、甲状腺軟骨の発症から、層状のプロプリア、内側TA筋肉、および横TA筋肉が露出するまでの30μmの切片をトリムして追跡します。
注:喉頭のランドマークは、断面の角度が斜めではないことを確認するために、100 μmごとに甲状腺軟骨の発症から追跡および注意する必要があります。 図2 は、10倍の倍率で断面面の喉頭ランドマークの2つのセットを表しています。 - ターゲットTA筋肉に到達したら、10μmで正に帯電したスライドのセクションを収集します。
- 4°CでPBSにセクションを保管し、汚れる準備ができるまで水分を保持します。
注:固定組織はIHCターゲットに応じて1週間までPBSに保存できますが、固定されていない組織は直ちに処理する必要があります。
4. 縦方向の平面におけるクライオセクションヘミナクス
- クライオスタットチャンバーを再び-20°Cに設定して、断面の厚さを30μmに変更します。
注:NMJ分析では、30-60 μmの間の組織厚を使用して、神経末端またはモータエンドプレート11,12,17の断片化を伴わずに喉頭筋内の複数の完全なNmJをキャプチャすることができます。 - TA筋肉のNMJ分析のための縦方向の声帯セクションを得るために、喉頭蓋がクライオスタットブレードに向き、気管腔が検体ディスクに向かって下向きになるように、試料をチャックに貼り付ける。
- 甲状腺軟骨が現れるまで、検体頭部を100μm進めてOCT化合物をトリミングします。
- TA筋の層および内側の部分および内側の分裂が露出するまで、甲状腺の発症から30μmのトリムおよびトラックセクション。
注:縦方向の平面の喉頭のランドマークの5つのセットは、ターゲットTA筋肉に向かって組織の深さの進行を追跡することをお勧めします。 図3 は、10倍の倍率で縦方向の面における喉頭のランドマークを表しています。 - ターゲットTA筋肉に到達したら、30μmで正に帯電したスライドのセクションを収集します。
- 4°CでPBSにセクションを保管し、汚れる準備ができるまで水分を保持します。
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Representative Results
代表的な結果は、喉頭神経筋系における声の運動の影響に関する継続的な調査の一環であった。29匹の雄フィッシャー344/褐色ノルウェーラット(生後12匹、24ヶ月齢12匹)を計量し、CO2 吸入で安楽死させ、続いて両側性乳房離脱手術を行った。
手順は、NmJと側面および内側TA筋肉の繊維サイズにラベルを付けるために概説されたプロトコルに従った。喉頭のランドマーク間の距離は、喉頭筋と周囲の軟骨を使用して縦方向および断面の両方で追跡され、凍結切断中の進行を決定した(表1)。追跡は、両方の指向性面で甲状腺軟骨の最初の出現で開始されました。図2は、TA筋肉の内側と層状に現れる甲状腺(図2a、b)との時間的順序での断面の極性の断面の目印の出現を示す(図2c,d)。図3は、中央TA筋(図3c,d)と層状筋(図3e,f)の前に現れるAlar筋肉(図3a,b)との時間的順序における縦方向の凍結切断中の喉頭のランドマークの出現を示す(図3e,f)。
両方の方向面では、ランドマーク間の距離は個々の動物のために大きく異なっていました。
体重および喉頭のランドマークの出現は、若いラットの相関が弱く、加齢ラットの相関が弱い(表2 および 表3)。各平面内のランドマーク間の距離は、両方の年齢層で適度から強く相関していたが、2つの解剖面間の相関は弱かった。したがって、ランドマークの外観の変動は、喉頭の大きさの体重または個々の変動によって考慮することができませんでした。
図1:アリュテノイド軟骨(ArC)の間で二重に分離されたラット喉頭を表す。
ヘミ喉頭の右側には、 表1の5つの縦方向のランドマークに対応する縦方向の平面(LZ1-LZ5)のランドマークが付いています。ヘミ喉頭の左側には、それぞれ声の折り目の横TA筋肉と完全な断面の始まりに対応する断面面(CZ1およびCZ2)のランドマークが付いています。VF = 声帯、CrC = クリコイド軟骨、AlC = アラー軟骨、T1 = 第1気管環。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:2つの断面は、明視野(右)および蛍光488チャネル(左)で、ラミニンが筋線維を輪郭に概説するための免疫染色に続いて10倍の倍率で画像化された。
セクション(上から下)は、甲状腺(a,b)が内側TA筋肉の前に現れ、声帯の層状(c,d)に対する経時的な順序での凍結切断中の進行を示す。ThC=甲状腺軟骨、LTA=横胸腺、およびMTA=中性チロオイテノイド。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:神経筋接合部の免疫染色に続く、明視野(右)および蛍光488チャネル(左)における10倍の拡大で画像化された3つの縦断面。
セクション(上から下)は、心TA筋肉(c,d)の前に現れるアーラル筋肉(a,b)と声帯の層筋(e,f)に対する時間的な順序での凍結切断中の進行を示す。AlC=アラー軟骨、ThC=甲状腺軟骨、ArC=アロイテノイド軟骨、LTA=横胸腺、MTA=中胞性胸膜、およびSCA=優れた胆管状。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 縦方向のランドマーク | μmの平均(標準偏差) | μmの範囲 | |
| 1. 全3大軟骨(甲状腺、アラー、アリテノイド)が現れ、筋線維の出現が見られました。 | 1,591 (665) | 350–2,800 | |
| 2. 上方のコラリテノイド (SCA), Alar cricoarytenoid (ACA), および横胸腺 (LTA) 筋肉が登場しました | 2,344 (591) | 91–3,500 | |
| 3. ACAとLTAの筋肉は、断片化することなく完全に拡張 | 2,631 (532) | 1505–3,640 | |
| 4. 軟骨の軟骨の肥大化、ACA消失、中膜チロオイテノイド(MTA)筋が出現 | 2,948 (606) | 1765–4,305 | |
| 5.ターゲットフルボーカルフォールドセクション:LTAとMTAの筋肉は完全に断片化なしで拡張され、ラミナプロプリアが出現しました | 3,131 (542) | 2205–4410 | |
| 断面ランドマーク | |||
| 1. LTA筋が現れた | 303 (138) | 110–690 | |
| 2. MTA筋肉が出現し、明瞭な層状のプロプリアと上皮が記載されたLTAサイズの約50%であった。 | 482 (167) | 210–850 | |
表1:甲状腺軟骨の最初の出現から、凍結切断中の各喉頭ランドマークまでの距離(n=29)。
| CSA | 経度の | |||||||
| LTA | MTA | 軟骨 | アラー/SCA | LTA | MTA | LP | ||
| CSA | LTA | 1 | ||||||
| MTA | 0.88 | 1 | ||||||
| 経度の | 軟骨 | 0.42 | 0.42 | 1 | ||||
| アラー/SCA | 0.57 | 0.47 | 0.77 | 1 | ||||
| LTA | 0.59 | 0.47 | 0.71 | 0.98 | 1 | |||
| MTA | 0.53 | 0.39 | 0.72 | 0.97 | 0.98 | 1 | ||
| LP | 0.53 | 0.41 | 0.76 | 0.96 | 0.97 | 0.99 | 1 | |
| 重量 | -0.55 | -0.35 | 0.08 | -0.45 | -0.46 | -0.46 | -0.41 | |
表2:若い雄ラットの断面(CSA)および縦方向の平面における体重と喉頭のランドマークの深さとのピアソン相関の結果。 LTA=横胸腺、MTA=中性チロオイテノイド、SCA=優れたコラアリテノイド、およびLP=層状プロプリア。
| CSA | 経度の | |||||||
| LTA | MTA | 軟骨 | アラー/SCA | LTA | MTA | LP | ||
| CSA | LTA | 1 | ||||||
| MTA | 0.9 | 1 | ||||||
| 経度の | 軟骨 | 0.21 | 0.33 | 1 | ||||
| アラー/SCA | 0.05 | 0.07 | 0.73 | 1 | ||||
| LTA | -0.06 | -0.04 | 0.64 | 0.96 | 1 | |||
| MTA | -0.02 | -0.02 | 0.6 | 0.79 | 0.84 | 1 | ||
| LP | -0.17 | -0.15 | 0.52 | 0.76 | 0.85 | 0.91 | 1 | |
| 重量 | 0.23 | 0.13 | -0.24 | -0.07 | -0.15 | -0.15 | -0.3 | |
表3:断面(CSA)における体重と喉頭の深さと古い雄ラットの縦方向の面とのピアソン相関の結果。 LTA=横胸腺、MTA=中性チロオイテノイド、SCA=優れたコラアリテノイド、およびLP=層状プロプリア。
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Discussion
神経筋解析のためのラットの声帯を準備すると、様々な課題を提示することができます。喉頭筋は軟骨に囲まれ小さいだけでなく、標的筋を直接抽出することが困難となり、喉頭解剖学的ランドマークの深部に動物間に高いばらつきも見られた。筋肉の断面平面プロトコルの場合、完全な声の折り目のセクションは、腹側甲状腺軟骨の最初の出現後に21-85セクション(1セクションあたり10 μm)の間に現れました。
各種類のプロトコルの組織の均一な埋め込み、配向、および断面にもかかわらず、喉頭のランドマーク間の距離に変動性が指摘された。さらに、体重の違いは、喉頭ランドマークの1セットから次のセットまでの組織深さの広い範囲の変動を考慮していなかった。喉頭のランドマーク間のこの距離の変動は、動物間の喉頭解剖学の個人差、解剖時のOCT化合物内のクリオマール内の喉頭の配向の小さな違い、または断面時に検体円盤に標本を配置した方法(すなわち、離れ取りまたは配置の差の差の前に検体に置かれたOCT化合物の量)に起因する可能性がある。
検体調製のこれらのわずかな違いは、喉頭組織のランドマークの深さの大きなばらつきにつながる可能性があることを理解して、初心者の研究者が作業する参照マップを持つことは重要です。このドキュメントで説明しているような、目的の筋肉を特定し、プロトコルの落とし穴を防ぐ方法を定義する概要を示した研究プロトコルは、再現性を向上させ、不要な組織の損失を防ぐことができます。
この研究はTA筋肉に焦点を当てたが, この方法論は、同様に他の固有の喉頭筋に適用されます。.例えば、縦方向の声帯面での断面は、アラーの縦方向筋線維部、横方向TA、内側TA、内側のクリコアリテノイド筋肉、および後方クリコチテノイド筋の断面をもたらす。断面の声帯面での断面は、大臼歯、横方向TA、内側TA、横錐体、上方のクリカリテノイド、およびコリコ甲状腺筋、ならびに後部クリコアリテノイド筋の縦断面をもたらす。さらに、この研究には雌ラットは含まれなかったが、ラット喉頭内の性的二型性は筋肉特異的であり、喉頭フレームワーク解剖学に関連していないため、喉頭の目印出現における雄と雌のラットの違いは期待されていない。
喉頭のランドマーク間の距離の変動は、初心者の研究者にとってラットの声帯を凍結切断することを困難にする可能性があります。この研究は、ラット喉頭の凍結、埋め込み、および凍結切断の方法の一貫性にもかかわらず、喉頭のランドマーク間の距離が大きく変化したことを示した。動物の体重は、この変動を考慮しませんでした。本研究は、喉頭筋組織を適切に準備し、ラットの声帯の神経筋組織学的調査のための喉頭のランドマークを同定する方法に関する関連画像を含む詳細な手順を提供する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、国立国立衛生研究所の難聴やその他のコミュニケーション障害研究所のF31DC017053-01A1(LENELL、PI)およびK23DC014517(ジョンソン、PI)の助成金によって支えられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. |
References
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