Summary
Denne protokollen beskriver metoder som brukes til å forberede rottevokalfolder for histokjemisk nevromuskulær studie.
Abstract
Formålet med denne opplæringen er å beskrive utarbeidelsen av rottevokalfolden for histokjemisk nevromuskulær studie. Denne protokollen skisserer prosedyrer for rotte laryngeal disseksjon, flash-frysing og kryosectioning av vokalfoldene. Denne studien beskriver hvordan man gråter vokalfolder i både langsgående og tverrsnittsplan. En nyhet i denne protokollen er laryngeal sporing under kryosectioning som sikrer nøyaktig identifisering av de iboende laryngeale musklene og reduserer sjansen for vevstap. Figurer viser den progressive kryoseksjonen i begge flyene. Tjueni rotte hemi-larynges ble gråtoseksjonert og sporet fra fremveksten av skjoldbruskbruskkjertelen til utseendet til den første delen som inkluderte hele vokalfolden. Den fulle vokalfolden ble visualisert for alle dyr i begge flyene. Det var høy variasjon i avstanden fra utseendet på skjoldbruskbruskkjertelen til utseendet på den fulle vokalfolden i begge flyene. Vekten var ikke korrelert med dybden av laryngeale landemerker, noe som tyder på at individuell variasjon og andre faktorer knyttet til vevsforberedelse kan være ansvarlig for den høye variasjonen i utseendet på landemerker under seksjonering. Denne studien beskriver en metodikk og presenterer morfologiske data for å forberede rottevokalfolden for histokjemisk nevromuskulær undersøkelse. På grunn av høy individuell variasjon bør laryngeale landemerker spores nøye under kryoseksjon for å forhindre overseksjon av vev og vevstap. Bruken av en konsistent metodikk, inkludert tilstrekkelig vevsforberedelse og bevissthet om landemerker i rottestrupehodet, vil hjelpe med konsistente resultater på tvers av studier og hjelpe nye forskere som er interessert i å bruke rottevokalfolden som modell for å undersøke laryngeale nevromuskulære mekanismer.
Introduction
Rottestrupehodet er en veletablert modell for å undersøke strukturelle og funksjonelle nevromuskulære laryngeale tilpasninger til utvikling, aldring, sykdom og farmakologiske midler1,2,3,4,5. Konsistens av histologiske metoder er avgjørende for denne arbeidslinjen, da det er flere vanskeligheter involvert i muskelforberedelse og analyse, samt utfordringer forbundet med laryngeal størrelse, form og topografi av musklene innkapslet i laryngeal brusk1,6,7,8,9,10,11 . På grunn av den lille størrelsen på rotteintrinsiske laryngeale muskler, er systematisk innebygging, frysing og kryoseksjon avgjørende for å oppnå konsistente og nøyaktige resultater. For eksempel, når du seksjonerer rottevokalfolden i koronalplanet, ligger de nevromuskulære kryssene (NMJs) av fire av de iboende laryngeale musklene innen mindre enn 1,8 mm vevdybde11. Derfor er presis overvåking av laryngeal muskelanatomi under kryooseksjon viktig for å nøyaktig identifisere delen (e) av interesse og forhindre overseksjon av vev. Overseksjon av målmuskelen kan resultere i unøyaktig identifisering av antall og topografi av NMJs11 eller kan resultere i generelle reduksjoner i prøvestørrelsen hvis målmuskelen kastes på grunn av landemerke orientering forvirring12. Etter hvert som nye modeller for studiet av laryngeal muskel og deres respektive tilpasninger utvikles, er standard driftsprosedyrer avgjørende for å sikre at resultatene er presise, pålitelige og reproduserbare på tvers av studier.
Målet med denne artikkelen er å detaljere forberedelsen av rottevokalfolden for optimal langsgående og tverrsnittsanalyse. Detaljerte metoder som brukes regelmessig i laboratoriet vårt, er beskrevet for å identifisere målmuskellandemerker under kryooseksjon. Selv om lignende metoder brukes i flere laboratorier, er det gitt flere detaljer her enn i litteraturen for å sikre pålitelig og nøyaktig replikering når den implementeres av nybegynnere etterforskere. Målet med denne opplæringen er å gi en standardmetodikk for immunhiistokjemisk (IHC) evaluering av rottevokalfolden for å forbedre konsistensen på tvers av laboratorier og undersøkelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee ved New York University School of Medicine.
1. Disseker rotte larynx
- Euthanize rotte i henhold til den institusjonelt godkjente protokollen. Barber ventralhalsen fra mandibelen til manubrium og vattpinne med alkohol for å forhindre pelsforurensning i vevsprøvene.
- Under et dissekeringsomfang med 10x forstørrelse slukker hele strupehodet ved å skape et midtlinjehals snitt med en skalpell til luftrøret er utsatt.
- Skill de ventrale ekstrinsiske strupemusklene midt på linlinjen for å eksponere strupehodet ved hjelp av tang og dissekere saks eller en skalpell.
- Sever luftrøret caudal til den tredje trakeal ringen og lage et snitt rostral til hyoid bein for å utskille hele strupehodet ved hjelp av dissekering saks.
- Fjern det ekstrinsiske laryngeale vevet (spiserøret, skjoldbruskkjertelen og ekstrinsiske laryngeale muskler) fra strupehodet ved hjelp av mikrodeseksjonsverktøy (pinser, pinner og mikroscissorer) under forstørrelse.
- Med mikroscissorer, bisect strupehodet dorsally mellom arytenoider ved hjelp av midtlinjen mellom bakre cricoarytenoid muskler som et landemerke. Fest sideveggene på strupehodet for å eksponere vokalfoldene og deretter bisect ventrally gjennom midtlinjen av skjoldbruskbruskkjertelen mellom fremre kommisser av vokalfoldene med mikroscissorer (figur 1).
MERK: Dette trinnet kan være valgfritt; det kan hoppes over for å holde strupehodet helt. Biseksjon av larynger tillater flere immunoppfatningsteknikker ved å bruke høyre og venstre side av samme strupehode separat. - Skyll hver hemi-strupehode i fosfatbufret oppløsning (PBS) i ca. 10 s og tørk forsiktig med en oppgavevisker for å redusere iskrystalldannelse under frysing.
2. Fest og/eller blitsfrysing av laryngealt vev
MERK: Fiksering er kanskje ikke ideell for alle immundempende protokoller. Ofte laryngeal vev er flash-frossen frisk umiddelbart etter disseksjon. Hopp over trinn 2.1 for å blinke fryse laryngealt vev uten fiksering.
- For å fikse hemi-larynger plasser vev i sentrifugerør fylt med 4% formaldehyd i PBS i 1 time ved romtemperatur på en orbital shaker ved 70 rpm. Overfør vev til et rent sentrifugerør og skyll 3x i 20 min i PBS. Overfør deretter til et rent sentrifugerør og senk i en 20% sukrose / 5% glyseroloppløsning (~ 18 timer eller til vevet synker) ved 4 °C.
FORSIKTIG: Formaldehyd er farlig og bør brukes i en avtrekkshette sammen med egnet personlig verneutstyr. - Plasser alle hemi-larynger i en jevn posisjon i en kryoform fylt med optimal skjæretemperatur (OCT) forbindelse. For en hemilarynx, plasser vevet med den mediale overflaten av vokalfolden vendt mot bunnen av kryomoldet og det langsgående aspektet av vokalfolden parallelt med den nedre kanten av kryomelåpningen. For hele strupefugler, plasser vevet med de bakre cricoarytenoids vendt mot bunnen av kryonomen og det langsgående aspektet av vokalfolden parallelt med den nedre kanten av kryomelåpningen.
MERK: Konsistent laryngeal orientering i OCT-forbindelsen er avgjørende for kryooseksjon av rottevokalfolden. Når hemilarynx er innebygd og frosset, må den tines for å endre orienteringen, og dermed introdusere risiko for vevsskader fra flere tiningsfrysesykluser. - Flash-fryse vev ved hjelp av isopentan (2-metylbutane) kjølt i et stålbeger omgitt av flytende nitrogen.
MERK: Isopentanen når optimal temperatur for vevsfrysing når hvite utfellinger begynner å danne seg på sidene og bunnen av begeret13. Isopentan brukes fordi den har høyere termisk ledningsevne enn flytende nitrogen, noe som bidrar til å forhindre sprekker i vevsblokken under rask frysing. For en mer detaljert beskrivelse av frysevev i OTC, se Kumar et al.13. - Pakk hver form i forhåndsmerket folie og legg den i en individuell frysepose for å forhindre dehydrering og oppbevar umiddelbart på tørris til den overføres til lagring i en -80 °C fryser.
3. Kryoseksjon hemilarynx i tverrsnittsplan
- Sett kammertemperaturen i kryostaten til -20 °C, som er midt i temperaturområdet (15–25 °C) som anbefales for muskelvevsseksjoner i henhold til produsentens bruksanvisning.
- Sett tykkelse på kryostatseksjonen til 10 μm tykke seksjoner.
MERK: For muskelfiber tverrsnittsanalyse er 10 μm tykke seksjoner optimale for å muliggjøre fullstendig farging og robust bildeintensitet av de merkede muskelfibrene for fiberskrivingsanalyse14,15,16. Noen protokoller kan kreve forskjellig seksjonstykkelse avhengig av nevromuskulære mål. - Overfør vev til kryostatkammeret, legg til et jevnt lag med OCT-forbindelse på kryostatprøveskiven (chuck), og plasser den innebygde vevsblokken på toppen av OCT-forbindelsen på prøveskiven. For å oppnå tverrsnitt av vokalfolden for tyroarytenoid (TA) muskelfiberanalyse, fest prøven til chucken slik at den ventrale skjoldbruskbruskkjertelen vender mot kryostatbladet og arytenoidbrusk vender mot prøveskiven.
MERK: Det er viktig å merke seg at disse landemerkene ikke er synlige på dette stadiet, på grunn av at OCT-forbindelsen blir hvit og ugjennomsiktig når den fryses. Denne mangelen på synlighet er grunnen til at det er viktig å merke seg retningen på hemilarynx under blitsfrysingsstadiet. - Trim OCT-forbindelsen ved å fremme prøvehodet med 100 μm til den ventrale delen av skjoldbruskbruskkjertelen vises.
- Trim deretter og spor 30 μm seksjoner fra utbruddet av skjoldbruskbruskkjertelen til lamina propria, medial TA muskler, og lateral TA muskel er utsatt.
MERK: Laryngeale landemerker bør spores og noteres fra begynnelsen av skjoldbruskbruskkjertelen hver 100 μm for å sikre at vinkelen på seksjonering ikke er skrå. Figur 2 representerer de to settene med laryngeale landemerker i tverrsnittsplanet ved 10x forstørrelse. - Når målet TA muskelen er nådd, samle seksjoner på positivt ladede lysbilder på 10 μm.
- Oppbevar seksjoner i PBS ved 4 °C for å beholde fuktighet til de er klare til å bli farget.
MERK: Fast vev kan lagres i PBS opptil en uke, avhengig av IHC-målet, mens uløst vev umiddelbart skal behandles.
4. Kryoseksjon hemilarynx i langsgående plan
- Med kryostatkammeret igjen satt til -20 °C, endre seksjonstykkelsen til 30 μm.
MERK: For NMJ-analyse kan en vevstykkelse mellom 30-60 μm brukes til å fange flere komplette NMJs i laryngealmuskulaturen uten fragmentering av enten nerveterminalen eller motorens endeplate11,12,17. - For å oppnå langsgående vokalfoldeseksjoner for NMJ-analyse av TA-muskelen, fest prøvene til chucken slik at epiglottiene er orientert mot kryostatbladet og trakeallumen vender ned mot prøveskiven.
- Trim OCT-forbindelsen ved å fremme prøvehodet med 100 μm til skjoldbruskbruskkjertelen vises.
- Trim og spor seksjoner på 30 μm fra begynnelsen av skjoldbruskkjertelen til lamina propria og medial og lateral divisjoner av TA muskelen er utsatt.
MERK: Fem sett med laryngeale landemerker i lengdeplanet anbefales for å spore vevsdybdeprogresjon mot mål TA-muskelen. Figur 3 representerer laryngeale landemerker i lengdeplanet ved 10x forstørrelse. - Når målet TA muskelen er nådd, samle seksjoner på positivt ladede lysbilder på 30 μm.
- Oppbevar seksjoner i PBS ved 4 °C for å beholde fuktighet til de er klare til å bli farget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representative resultatene var en del av en pågående undersøkelse av effekten av vokaløvelse på laryngeal nevromuskulært system. 29 mannlige Fischer 344/brune norske rotter (12 9 måneder gamle, 17 24 måneder gamle) ble veid og avlivet med CO2-innånding etterfulgt av en bilateral thoraxotomi.
Prosedyrene fulgte den skisserte protokollen for å merke NMJs og fiberstørrelse på laterale og medial TA muskler. Avstanden mellom laryngeale landemerker ble sporet i både langsgående og tverrsnittsfly ved hjelp av laryngeale muskler og omkringliggende brusk for å bestemme progresjonen under kryooseksjon (tabell 1). Sporing startet ved første utseende av skjoldbruskbruskkjertelen i begge retningsplanene. Figur 2 illustrerer utseendet på laryngeale landemerker under tverrsnittsroposeksjon i timelig rekkefølge med skjoldbruskkjertelen (figur 2a,b) som vises før medial TA-muskelen og lamina propria (figur 2c,d). Figur 3 illustrerer utseendet på laryngeale landemerker under langsgående kryoseksjon i tidsmessig rekkefølge med alarmuskelen (figur 3a,b) som vises før medial TA-muskelen (figur 3c,d) og til lamina propria (figur 3e,f).
I begge retningsflyene varierte avstandene blant landemerker sterkt for individuelle dyr.
Vekt og laryngeal landemerke hadde svake til moderate sammenhenger for unge rotter og svake sammenhenger for eldre rotter (tabell 2 og tabell 3). Avstandene mellom landemerkene i hvert fly var moderat til sterkt korrelert for begge aldersgruppene, men svakt korrelert mellom de to disseksjonsplanene. Derfor kunne variasjon i landemerkeutseende ikke redegjøres for av vekt eller individuelle variasjoner i laryngeal størrelse.
Figur 1: En rotte larynx dorsally bisected mellom arytenoid brusk (ArC).
Høyre side av hemi-strupehodet er kommentert med landemerker i lengdeplanet (LZ1-LZ5) som tilsvarer de fem langsgående landemerkene i tabell 1. Venstre side av hemi-larynxen er kommentert med landemerker i tverrsnittsplanet (CZ1 og CZ2) som tilsvarer begynnelsen av lateral TA-muskelen og hele tverrsnittet av vokalfolden. VF = vokalfold, CrC = cricoid brusk, AlC = alar brusk, og T1 = første trakeal ring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: To tverrsnitt avbildet ved 10x forstørrelse i brightfield (høyre) og i fluorescerende 488 kanal (venstre) etter immunostaining for laminin for å skissere muskelfibre.
Seksjonene (fra topp til bunn) viser progresjonen under kryooseksjon i tidsmessig rekkefølge med skjoldbruskkjertelen (a,b) som vises før medial TA-muskelen og til lamina propria av vokalfolden (c,d). ThC = skjoldbruskbruskkjertel, LTA = lateral tyroarytenoid, og MTA = medial tyroarytenoid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Tre langsgående seksjoner avbildet ved 10x forstørrelse i brightfield (høyre) og i fluorescerende 488 kanal (venstre) etter immunostaining for nevromuskulære veikryss.
Seksjonene (fra topp til bunn) viser progresjonen under kryooseksjon i temporal rekkefølge med alarmuskelen (a,b) som vises før medial TA-muskelen (c,d) og til lamina propria (e,f) av vokalfolden. AlC = alar brusk, ThC = skjoldbrusk brusk, ArC = arytenoid brusk, LTA = lateral tyroarytenoid, MTA = medial tyroarytenoid, og SCA = overlegen cricoarytenoid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Langsgående landemerker | Gjennomsnitt (standardavvik) i μm | Område i μm | |
| 1. Alle tre store brusk (skjoldbruskkjertelen, alar, arytenoid) dukket opp med fremveksten av muskelfibre | 1,591 (665) | 350–2,800 | |
| 2. Overlegen cricoarytenoid (SCA), alar cricoarytenoid (ACA), og laterale tyroarytenoid (LTA) muskler dukket opp | 2,344 (591) | 91–3,500 | |
| 3. ACA og LTA muskler utvidet helt uten fragmentering | 2,631 (532) | 1505–3,640 | |
| 4. Arytenoid brusk forstørret, ACA forsvant, medial thyroarytenoid (MTA) muskel dukket opp | 2,948 (606) | 1765–4,305 | |
| 5. Mål full vokal fold seksjon: LTA og MTA muskler utvidet helt uten fragmentering og lamina propria dukket opp | 3,131 (542) | 2205–4410 | |
| Landemerker på tvers av deler | |||
| 1. LTA muskel dukket opp | 303 (138) | 110–690 | |
| 2. MTA muskel dukket opp og var ~ 50% av LTA-størrelsen med klar lamina propria og epitel notert. | 482 (167) | 210–850 | |
Tabell 1: Avstander i μm fra det første utseendet på skjoldbruskbruskkjertelen til hvert laryngealt landemerke under kryoseksjon (n = 29).
| CSA | Langsgående | |||||||
| LTA | MTA | Cartilages | Alar/SCA | LTA | MTA | LP | ||
| CSA | LTA | 1 | ||||||
| MTA | 0.88 | 1 | ||||||
| Langsgående | Cartilages | 0.42 | 0.42 | 1 | ||||
| Alar/SCA | 0.57 | 0.47 | 0.77 | 1 | ||||
| LTA | 0.59 | 0.47 | 0.71 | 0.98 | 1 | |||
| MTA | 0.53 | 0.39 | 0.72 | 0.97 | 0.98 | 1 | ||
| LP | 0.53 | 0.41 | 0.76 | 0.96 | 0.97 | 0.99 | 1 | |
| Vekt | -0.55 | -0.35 | 0.08 | -0.45 | -0.46 | -0.46 | -0.41 | |
Tabell 2: Resultater av Pearsons korrelasjon mellom vekt og dybden av laryngeale landemerker i tverrsnittsfly (CSA) og langsgående fly for unge hannrotter. LTA = lateral tyroarytenoid, MTA = medial tyroarytenoid, SCA = overlegen cricoarytenoid og LP = lamina propria.
| CSA | Langsgående | |||||||
| LTA | MTA | Cartilages | Alar/SCA | LTA | MTA | LP | ||
| CSA | LTA | 1 | ||||||
| MTA | 0.9 | 1 | ||||||
| Langsgående | Cartilages | 0.21 | 0.33 | 1 | ||||
| Alar/SCA | 0.05 | 0.07 | 0.73 | 1 | ||||
| LTA | -0.06 | -0.04 | 0.64 | 0.96 | 1 | |||
| MTA | -0.02 | -0.02 | 0.6 | 0.79 | 0.84 | 1 | ||
| LP | -0.17 | -0.15 | 0.52 | 0.76 | 0.85 | 0.91 | 1 | |
| Vekt | 0.23 | 0.13 | -0.24 | -0.07 | -0.15 | -0.15 | -0.3 | |
Tabell 3: Resultater av Pearsons korrelasjon mellom vekt og dybden av laryngeale landemerker i tverrsnittsfly (CSA) og langsgående fly for gamle hannrotter. LTA = lateral tyroarytenoid, MTA = medial tyroarytenoid, SCA = overlegen cricoarytenoid og LP = lamina propria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forberedelse av rottevokalfolder for nevromuskulær analyse kan by på ulike utfordringer. Ikke bare er laryngeale muskler små og omgitt av brusk, og dermed gjør det vanskelig å trekke ut målmuskelen direkte, høy variasjon ble også funnet mellom dyr i dybden av laryngeale anatomiske landemerker. For muskel tverrsnittsplanprotokollen oppstod komplette vokalfoldesnitt mellom 21-85 seksjoner (10 μm per seksjon) etter det første utseendet på den ventrale skjoldbruskbruskkjertelen, som er ganske mye færre enn de 63-126 seksjonene (35 μm per seksjon) i langsgående plan for NMJ analyseprotokoller (tabell 1).
Variabilitet ble notert i avstander mellom laryngeale landemerker til tross for ensartet innebygging, orientering og seksjonering av vev for hver type protokoll. Videre utgjorde forskjeller i kroppsvekt ikke variasjon i det brede spekteret av vevsdybde fra ett sett med laryngeale landemerker til det neste. Denne variasjonen i avstand mellom laryngeale landemerker kan skyldes individuelle forskjeller i laryngeal anatomi på tvers av dyr, små forskjeller i orientering av larynger i kryonom i OCT-forbindelsen på tidspunktet for disseksjonen, eller hvordan prøvene ble plassert på prøveskiven i kryostaten ved seksjonering (dvs. mengden OCT-forbindelse plassert på prøveskiven før montering eller små forskjeller i plasseringsvinkel).
Med en forståelse av at disse små forskjellene i prøveforberedelse kan føre til betydelig variasjon i dybden av laryngeale vevslandemerker, er det avgjørende at nybegynnere etterforskere har et referansekart å jobbe fra. Skisserte studieprotokoller som definerer metoder for å identifisere muskelen(e) av interesse og forhindre protokollfall – for eksempel de som er skissert i dette dokumentet – kan forbedre reproduserbarheten og forhindre uønsket vevstap.
Selv om denne studien fokuserte på TA-muskelen, gjelder denne metoden også for andre iboende laryngeale muskler. For eksempel gir seksjonering i langsgående vokalfoldplan langsgående muskelfiberdeler av alar, lateral TA, medial TA, lateral cricoarytenoid og overlegne cricoarytenoid muskler, og tverrsnitt av de bakre cricoarytenoid musklene. Seksjonering i tverrsnittet vokal fold plan gir tverrsnitt av alar, lateral TA, medial TA, lateral cricoarytenoid, overlegen cricoarytenoid, og cricothyroid muskler, samt langsgående deler av bakre cricoarytenoid muskler. I tillegg, selv om denne studien ikke inkluderte kvinnelige rotter, forventes ikke forskjeller mellom mannlige og kvinnelige rotter i laryngeal landemerke utseende fordi seksuell dimorfisme i rottestrupehodet er muskelspesifikk og ikke relatert til laryngeal rammeanatomi16,18.
Variasjonen i avstand mellom laryngeale landemerker kan gjøre kryooseksjon av rottevokalfolden vanskelig for nybegynnere. Denne studien viste at til tross for konsistens i hvordan rotte larynagene var frosset, innebygd og kryosott, varierte avstanden mellom laryngeale landemerker sterkt; dyrevekten utgjorde ikke denne variasjonen. Denne studien gir detaljerte prosedyrer med tilhørende bilder om hvordan du kan forberede laryngeal muskelvev på riktig måte og identifisere laryngeale landemerker for nevromuskulær histologisk undersøkelse av rottevokalfolden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av tilskudd F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) og K23DC014517 (Johnson, PI) fra National Institute on Deafness og andre kommunikasjonsforstyrrelser ved National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. |
References
- Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), Pt 1 579-586 (2002).
- Suzuki, T., et al. Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).
- Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration. Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).
- Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context. Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).
- Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval. Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).
- Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats. Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).
- Ciucci, M. R., et al. Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats. Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).
- Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease. Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).
- Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats. American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).
- Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats. Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).
- Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function. Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).
- Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).
- McMullen, C. A., et al. Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).
- Lenell, C., Johnson, A. M. Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat. Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats. Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).
