Summary
Este protocolo descreve métodos usados para preparar dobras vocais de ratos para estudo neuromuscular histoquímico.
Abstract
O objetivo deste tutorial é descrever a preparação da dobra vocal de rato para o estudo neuromuscular histoquímico. Este protocolo descreve procedimentos para dissecção laríngea de ratos, congelamento de flash e criosectioning das dobras vocais. Este estudo descreve como criosecção dobras vocais em planos longitudinais e transversais. Uma novidade deste protocolo é o rastreamento laríngeo durante a criosecção que garante a identificação precisa dos músculos laríngeos intrínsecos e reduz a chance de perda de tecido. Os números demonstram a crioseção progressiva em ambos os planos. Vinte e nove hemi-laringes de ratos foram criosectionados e rastreados desde o surgimento da cartilagem tireoide até o aparecimento da primeira seção que incluía a dobra vocal completa. A dobra vocal completa foi visualizada para todos os animais em ambos os planos. Houve alta variabilidade na distância do aparecimento da cartilagem tireoide ao aparecimento da dobra vocal completa em ambos os planos. O peso não foi correlacionado à profundidade dos marcos laríngeos, sugerindo que a variabilidade individual e outros fatores relacionados à preparação tecidual podem ser responsáveis pela alta variabilidade no aparecimento de marcos durante a secção. Este estudo detalha uma metodologia e apresenta dados morfológicos para a preparação da dobra vocal de ratos para investigação neuromuscular histoquímica. Devido à alta variabilidade individual, os marcos laríngeos devem ser acompanhados de perto durante a crioseção para evitar a perda de tecido e tecido overfando. O uso de uma metodologia consistente, incluindo a preparação adequada do tecido e a conscientização de marcos dentro da laringe de ratos, auxiliará em resultados consistentes em estudos e ajudará novos pesquisadores interessados em usar a dobra vocal de ratos como modelo para investigar mecanismos neuromusculares laríngeos.
Introduction
A laringe de ratos é um modelo bem estabelecido para investigar adaptações de laringe neuromuscular estrutural e funcional para o desenvolvimento, envelhecimento, doença e agentes farmacológicos1,2,3,4,5. A consistência dos métodos histológicos é fundamental para essa linha de trabalho, pois há múltiplas complexidades envolvidas na preparação e análise muscular, bem como desafios associados ao tamanho, forma e topografia laríngeos dos músculos encapsulados dentro das cartilagens laríngeas1,6,7,8,9,10,11 . Devido ao pequeno tamanho dos músculos laríngeos intrínsecos do rato, incorporação sistemática, congelamento e criosecção são fundamentais para alcançar resultados consistentes e precisos. Por exemplo, ao seccionar a dobra vocal do rato no plano coronal, as junções neuromusculares (NMJs) de quatro dos músculos laríngeos intrínsecos estão localizadas dentro de menos de 1,8 mm de profundidade tecidual11. Portanto, o monitoramento preciso da anatomia muscular laríngea durante a criosecção é imperativo para identificar com precisão a seção de interesse e evitar o oversectioning do tecido. O oversectioning do músculo alvo pode resultar em identificação imprecisa do número e topografia de NMJs11 ou pode resultar em reduções globais no tamanho da amostra se o músculo alvo for descartado devido à confusão de orientação de marco12. À medida que novos modelos para o estudo do músculo laríngeo e suas respectivas adaptações são desenvolvidos, procedimentos operacionais padrão são essenciais para garantir que os resultados sejam precisos, confiáveis e reprodutíveis em todos os estudos.
O objetivo deste artigo é detalhar a preparação da dobra vocal de rato para uma análise longitudinal e transversal ideal. Métodos detalhados usados regularmente em nosso laboratório são descritos para identificar marcos musculares alvo durante a crioseção. Embora métodos semelhantes sejam usados em vários laboratórios, maiores detalhes são fornecidos aqui do que na literatura para garantir uma replicação confiável e precisa quando implementado por investigadores iniciantes. O objetivo deste tutorial é fornecer uma metodologia padrão para avaliação imunohistoquímica (IHC) da dobra vocal de ratos para melhorar a consistência entre laboratórios e investigações.
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Protocol
Este estudo foi realizado em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Nova York.
1. Disseca laringe de rato
- Eutanize rato de acordo com o protocolo institucionalmente aprovado. Raspe o pescoço ventral da mandíbula para o manúbrio e cotonete com álcool para evitar a contaminação de peles nos espécimes teciduais.
- Sob um escopo de dissecação com 10x de ampliação, extirpar toda a laringe, criando uma incisão do pescoço médio com um bisturi até que a traqueia seja exposta.
- Separe os músculos laríngeos extrínsecos ventral na linha média para expor a laringe usando fórceps e dissecando tesouras ou um bisturi.
- Corte a traqueia caudal até o terceiro anel traqueal e faça uma rostral incisão ao osso hioide para extirpor toda a laringe usando tesoura dissecando.
- Remova os tecidos laríngeos extrínsecos (esôfago, glândula tireoide e músculos laríngeos extrínsecos) da laringe usando ferramentas de microdisseção (pinças, pinos e microscisores) sob ampliação.
- Com microscisores, bissecção a laringe dorsalmente entre os aritóides usando a linha média entre os músculos cricoarytenoides posteriores como um marco. Fixar paredes laterais da laringe para expor as dobras vocais e, em seguida, bissect ventrally através da linha média da cartilagem tireoide entre a comissura anterior das dobras vocais com microscisores (Figura 1).
NOTA: Esta etapa pode ser opcional; ele pode ser pulado para manter a laringe inteira. A biseção de laringes permite múltiplas técnicas de imunossuagem usando separadamente os lados direito e esquerdo da mesma laringe. - Enxágüe cada hemi-laringe em solução tamponada de fosfato (PBS) por ~10 s e seque delicadamente com um limpador de tarefas para reduzir a formação de cristais de gelo durante o congelamento.
2. Fixar e/ou congelar o tecido laríngeo
NOTA: A fixação pode não ser ideal para todos os protocolos de imunossuagem. Muitas vezes os tecidos laríngeos são congelados imediatamente após a dissecção. Pule a etapa 2.1 para congelar o tecido laríngeo sem fixação.
- Para fixar hemi-laringes coloque tecidos em tubo de centrífuga preenchido com 4% de formaldeído em PBS por 1 h à temperatura ambiente em um agitador orbital a 70 rpm. Transfira tecidos para um tubo de centrífuga limpo e enxágue 3x por 20 min em PBS. Em seguida, transfira para um tubo de centrífuga limpo e submerse em uma solução de 20% de sacarose/5% de glicerol (~18 h ou até que o tecido afunde) a 4 °C.
ATENÇÃO: O formaldeído é perigoso e deve ser usado em um capô de fumaça, juntamente com equipamentos de proteção individual adequados. - Coloque todas as hemi-larynges em uma posição uniforme em um molde crio-mold cheio com composto de temperatura de corte ideal (OCT). Para um hemilarnox, coloque o tecido com a superfície medial da dobra vocal voltada para a parte inferior do criomold e o aspecto longitudinal da dobra vocal paralela à borda inferior da abertura criomold. Para laringes inteiros, coloque o tecido com os cricoarytenoides posteriores voltados para a parte inferior do criomold e o aspecto longitudinal da dobra vocal paralela à borda inferior da abertura criomold.
NOTA: A orientação laríngea consistente dentro do composto OCT é fundamental para a crioseção da dobra vocal do rato. Uma vez que o hemilarynx esteja embutido e congelado, ele deve ser descongelado para mudar sua orientação, introduzindo assim riscos de danos teciduais de múltiplos ciclos de congelamento de degelo. - Tecidos de congelamento de flash usando isopentano (2-metilbutano) refrigerados em um béquer de aço cercado por nitrogênio líquido.
NOTA: A isopentane atinge a temperatura ideal para congelamento de tecidos quando precipitações brancas começam a se formar nas laterais e na parte inferior do béquer13. Isopientano é usado porque tem uma condutividade térmica maior do que o nitrogênio líquido, o que ajuda a evitar a quebra do bloco tecidual durante o congelamento rápido. Para obter uma descrição mais detalhada do tecido de congelamento em OTC consulte Kumar et al.13. - Enrole cada molde em papel alumínio pré-rotulado e coloque em um saco de congelador individual para evitar a desidratação e armazene imediatamente em gelo seco até ser transferido para armazenamento em um congelador de -80 °C.
3. Criosection hemilarynx em avião transversal
- Ajuste a temperatura da câmara no criostato para -20 °C, que está no meio da faixa de temperatura (15-25 °C) recomendada para seção de tecido muscular pelo manual do fabricante.
- Defina a espessura da seção criostata para seções de 10 μm de espessura.
NOTA: Para a análise transversal da fibra muscular, as seções de 10 μm de espessura são ideais para permitir a coloração completa e intensidade de imagem robusta das fibras musculares rotuladas para análise de digitação de fibras14,15,16. Alguns protocolos podem exigir espessura de seção diferente dependendo de alvos neuromusculares. - Transfira tecidos para a câmara criostat, adicione uma camada uniforme de composto OCT no disco da amostra criostat (chuck) e coloque o bloco de tecido incorporado em cima do composto OCT no disco da amostra. Para obter seções transversais da dobra vocal para análise de fibra muscular tireonitoide (TA), afixe a amostra no mandril para que a cartilagem da tireoide ventral enfrente a lâmina criostat e a cartilagem aritóide enfrente o disco da amostra.
NOTA: É fundamental notar que esses marcos não são visíveis nesta fase, devido ao composto OCT tornar-se branco e opaco quando congelado. Essa falta de visibilidade é a razão pela qual é fundamental notar a orientação do hemilarynx durante a fase de congelamento do flash. - Corte o composto OCT avançando a cabeça da amostra em 100 μm até que a porção ventral da cartilagem da tireoide apareça.
- Em seguida, aparar e acompanhar seções de 30 μm desde o início da cartilagem tireoide até que a lavíria propria, os músculos M medial e o músculo TA lateral sejam expostos.
NOTA: Os marcos laríngeos devem ser rastreados e observados desde o início da cartilagem da tireoide a cada 100 μm para garantir que o ângulo de secção não seja oblíquo. A Figura 2 representa os dois conjuntos de marcos laríngeos no plano transversal a 10x de ampliação. - Uma vez alcançado o músculo TA alvo, colete seções em slides carregados positivamente a 10 μm.
- Armazene seções em PBS a 4 °C para reter a umidade até que estejam prontas para serem manchadas.
NOTA: O tecido fixo pode ser armazenado em PBS até uma semana, dependendo do alvo IHC, enquanto o tecido não fixado deve ser imediatamente processado.
4. Criosection hemilarynx em avião longitudinal
- Com a câmara criostata novamente definida para -20 °C, mude a espessura da seção para 30 μm.
NOTA: Para a análise do NMJ, uma espessura tecidual entre 30-60 μm pode ser usada para capturar vários NMJs completos dentro dos músculos laríngeos sem fragmentação do terminal nervoso ou da placa final do motor11,12,17. - Para obter seções longitudinal de dobra vocal para análise nmj do músculo TA, afixar os espécimes ao mandril de modo que a epiglote é orientada para a lâmina criostata e o lúmen traqueal voltado para baixo em direção ao disco do espécime.
- Corte o composto OCT avançando a cabeça da amostra em 100 μm até que a cartilagem da tireoide apareça.
- Seções de corte e faixa de 30 μm desde o início da tireoide até que a álmina propria e divisões medial e lateral do músculo TA sejam expostas.
NOTA: Cinco conjuntos de marcos laríngeos no plano longitudinal são recomendados para rastrear a progressão da profundidade tecidual em direção ao músculo TA alvo. A Figura 3 representa os marcos laríngeos no plano longitudinal a 10x de ampliação. - Uma vez alcançado o músculo TA alvo, colete seções em slides carregados positivamente a 30 μm.
- Armazene seções em PBS a 4 °C para reter a umidade até que estejam prontas para serem manchadas.
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Representative Results
Os resultados representativos foram parte de uma investigação contínua dos efeitos do exercício vocal no sistema neuromuscular laríngeo. Vinte e nove ratos Fischer 344/marrom da Noruega (12 de 9 meses, 17 24 meses) foram pesados e eutanásia com inalação de CO2 seguida de uma toracotomia bilateral.
Os procedimentos seguiram o protocolo delineado para rotular NMJs e tamanho de fibra dos músculos TS lateral e medial. A distância entre os marcos laríngeos foi rastreada em planos longitudinais e transversais usando músculos laríngeos e cartilagens circundantes para determinar a progressão durante a criosecção (Tabela 1). O rastreamento começou na primeira aparição da cartilagem da tireoide em ambos os planos direcionais. A Figura 2 ilustra o aparecimento de marcos laríngeos durante a crioseção transversal em ordem temporal com a tireoide (Figura 2a,b) aparecendo antes do músculo TA medial e para a órmina propria (Figura 2c,d). A Figura 3 ilustra o aparecimento de marcos laríngeos durante a crioseção longitudinal em ordem temporal com o músculo alar (Figura 3a,b) aparecendo antes do músculo TA medial (Figura 3c,d) e para a órmina propria (Figura 3e,f).
Em ambos os planos direcionais, as distâncias entre os pontos turísticos variaram muito para animais individuais.
As aparências de peso e de marco laríngeo apresentaram correlações fracas a moderadas para ratos jovens e correlações fracas para ratos idosos (Tabela 2 e Tabela 3). As distâncias entre os pontos turísticos dentro de cada plano foram moderadamente a fortemente correlacionadas para ambas as faixas etárias, mas fracamente correlacionadas entre os dois planos de dissecção. Portanto, a variabilidade na aparência marcante não poderia ser contabilizada por variações de peso ou individuais no tamanho laríngeo.
Figura 1: Uma laringe de rato dorsalmente bisseccionada entre as cartilagens aritóides (ArC).
O lado direito da hemi-laringe é anotado com marcos no plano longitudinal (LZ1-LZ5) correspondente aos cinco marcos longitudinais na Tabela 1. O lado esquerdo da hemi-laringe é anotado com marcos no plano transversal (CZ1 e CZ2) que correspondem ao início do músculo TA lateral e seção transversal completa da dobra vocal, respectivamente. VF = dobra vocal, CrC = cartilagem cricoide, AlC = cartilagem alar e T1 = primeiro anel traqueal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Duas seções transversais imagens em 10x de ampliação em brightfield (direita) e no canal fluorescente 488 (esquerda) seguindo imunostaining para laminina para delinear fibras musculares.
As seções (de cima para baixo) mostram a progressão durante a crioseção em ordem temporal com a tireoide (a,b) aparecendo antes do músculo TA medial e para a propria lamina da dobra vocal (c,d). THC = cartilagem tireoide, LTA = tireoarytenoid lateral, e MTA = tireoarytenoid medial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Três seções longitudinais imagens em ampliação de 10x em brightfield (direita) e no canal fluorescente 488 (esquerda) seguindo imunostaining para junções neuromusculares.
As seções (de cima para baixo) mostram a progressão durante a crioseção em ordem temporal com o músculo alar (a,b) aparecendo antes do músculo TA medial (c,d) e para a lavria propria (e,f) da dobra vocal. AlC = cartilagem alar, ThC = cartilagem tireoide, ArC = cartilagem aritóide, LTA = tireorretoide lateral, MTA = tireorreteroide medial e SCA = cricoarytenoid superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Marcos longitudinais | Média (desvio padrão) em μm | Alcance em μm | |
| 1. Todas as três cartilagens principais (tireoide, alar, aritóide) apareceram com o surgimento de fibras musculares | 1,591 (665) | 350–2,800 | |
| 2. Apareceram músculos cricoarytenoides superiores (SCA), cricoarytenoid alar (ACA) e tireoiretoide lateral (LTA) | 2,344 (591) | 91–3,500 | |
| 3. Os músculos ACA e LTA se estendiam completamente sem fragmentação | 2,631 (532) | 1505–3,640 | |
| 4. A cartilagem aritóide aumentou, ACA desapareceu, músculo tireoretêide medial (MTA) emergiu | 2,948 (606) | 1765–4,305 | |
| 5. Seção de dobra vocal completa do alvo: os músculos LTA e MTA se estenderam completamente sem fragmentação e a tração lamina emergiu | 3,131 (542) | 2205–4410 | |
| Pontos de referência transversais | |||
| 1. O músculo LTA apareceu | 303 (138) | 110–690 | |
| 2. O músculo MTA apareceu e era ~50% do tamanho da LTA com lamina propria clara e epitélio notado. | 482 (167) | 210–850 | |
Tabela 1: Distâncias em μm desde a primeira aparição da cartilagem da tireoide até cada marco laríngeo durante a crioseção (n = 29).
| CSA | Longitudinal | |||||||
| LTA | MTA | Cartilagens | Alar/SCA | LTA | MTA | LP | ||
| CSA | LTA | 1 | ||||||
| MTA | 0.88 | 1 | ||||||
| Longitudinal | Cartilagens | 0.42 | 0.42 | 1 | ||||
| Alar/SCA | 0.57 | 0.47 | 0.77 | 1 | ||||
| LTA | 0.59 | 0.47 | 0.71 | 0.98 | 1 | |||
| MTA | 0.53 | 0.39 | 0.72 | 0.97 | 0.98 | 1 | ||
| LP | 0.53 | 0.41 | 0.76 | 0.96 | 0.97 | 0.99 | 1 | |
| Peso | -0.55 | -0.35 | 0.08 | -0.45 | -0.46 | -0.46 | -0.41 | |
Tabela 2: Resultados da correlação de Pearson entre o peso e a profundidade dos marcos laríngeos nos planos transversais (CSA) e longitudinais para ratos machos jovens. LTA = tireoriretoide lateral, MTA = tireoretoide medial, SCA = cricoarytenoid superior e LP = lamina propria.
| CSA | Longitudinal | |||||||
| LTA | MTA | Cartilagens | Alar/SCA | LTA | MTA | LP | ||
| CSA | LTA | 1 | ||||||
| MTA | 0.9 | 1 | ||||||
| Longitudinal | Cartilagens | 0.21 | 0.33 | 1 | ||||
| Alar/SCA | 0.05 | 0.07 | 0.73 | 1 | ||||
| LTA | -0.06 | -0.04 | 0.64 | 0.96 | 1 | |||
| MTA | -0.02 | -0.02 | 0.6 | 0.79 | 0.84 | 1 | ||
| LP | -0.17 | -0.15 | 0.52 | 0.76 | 0.85 | 0.91 | 1 | |
| Peso | 0.23 | 0.13 | -0.24 | -0.07 | -0.15 | -0.15 | -0.3 | |
Tabela 3: Resultados da correlação de Pearson entre o peso e a profundidade dos marcos laríngeos nos planos transversais (CSA) e longitudinais para ratos velhos. LTA = tireoriretoide lateral, MTA = tireoretoide medial, SCA = cricoarytenoid superior e LP = lamina propria.
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Discussion
Preparar dobras vocais de ratos para análise neuromuscular pode apresentar vários desafios. Não só os músculos laríngeos são pequenos e cercados por cartilagem, dificultando a extração direta do músculo alvo, a alta variabilidade também foi encontrada entre os animais na profundidade de marcos anatômicos laríngeos. Para o protocolo de plano transversal, as seções completas das dobras vocais apareceram entre 21-85 seções (10 μm por seção) após o aparecimento inicial da cartilagem da tireoide ventral, que é um pouco menor do que as seções de 63-126 (35 μm por seção) no plano longitudinal para protocolos de análise NMJ (Tabela 1).
A variabilidade foi observada em distâncias entre marcos laríngeos, apesar da incorporação uniforme, orientação e secção de tecidos para cada tipo de protocolo. Além disso, as diferenças no peso corporal não explicaram a variabilidade nas amplas faixas de profundidade tecidual de um conjunto de marcos laríngeos para o próximo. Essa variabilidade na distância entre os marcos laríngeos pode ser devido a diferenças individuais na anatomia laríngea entre os animais, pequenas diferenças na orientação das laringes no criomold dentro do composto OCT no momento da dissecção, ou como os espécimes foram colocados no disco do espécime dentro do criostat quando seção (ou seja, a quantidade de composto OCT colocado no disco antes da montagem ou pequenas diferenças no ângulo de colocação).
Com a compreensão de que essas pequenas diferenças na preparação dos espécimes podem levar a uma variabilidade substancial em profundidade de marcos de tecido laríngeo, é fundamental que os pesquisadores novatos tenham um mapa de referência a partir do qual trabalhar. Protocolos de estudo delineados que definem métodos para identificar os músculos de interesse e evitar armadilhas de protocolo — como as descritas neste documento — podem melhorar a reprodutibilidade e prevenir a perda indesejada de tecidos.
Embora este estudo tenha focado no músculo TA, essa metodologia também é aplicável para outros músculos laríngeos intrínsecos. Por exemplo, a seção no plano de dobra vocal longitudinal produz seções longitudinais de fibra muscular do alar, TA lateral, TA medial, cricoarytenoid lateral, e músculos cricoarytenoides superiores, e seções transversais dos músculos cricoarentóides posteriores. A seção no plano da dobra vocal transversal produz seções transversais do alar, TA lateral, TA medial, cricoarytenoid lateral, cricoarytenoid superior e músculos cricothiroid, bem como seções longitudinais dos músculos cricoarytenoides posteriores. Além disso, embora este estudo não tenha sido realizado por ratos do sexo feminino, as diferenças entre ratos machos e fêmeas na aparência de marco laríngeo não são esperadas porque o dimorfismo sexual dentro da laringe de ratos é específico do músculo e não está relacionado à anatomia da estrutura laríngea16,18.
A variabilidade à distância entre marcos laríngeos pode dificultar a crioseção da dobra vocal de rato para os investigadores novatos. Este estudo demonstrou que, apesar da consistência na forma como as laringes de ratos foram congeladas, incorporadas e criosectionadas, a distância entre os marcos laríngeos variou muito; o peso animal não contava com essa variabilidade. Este estudo fornece procedimentos detalhados com imagens associadas sobre como preparar adequadamente o tecido muscular laríngeo e identificar marcos laríngeos para investigação histológica neuromuscular da dobra vocal do rato.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelas bolsas F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) e K23DC014517 (Johnson, PI) do Instituto Nacional de Surdez e outros Transtornos de Comunicação dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. |
References
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