Summary
Этот протокол описывает методы, используемые для подготовки голосовых складок крыс к гистохимическому нервно-мышечному исследованию.
Abstract
Целью этого урока является описание подготовки голосовой складки крысы к гистохимическому нервно-мышечному исследованию. В этом протоколе описываются процедуры рассечения гортани крыс, мгновенного замораживания и криосекции голосовых складок. В этом исследовании описывается, как проводить криосекцию голосовых складок как в продольной, так и в поперечной плоскостях. Новинкой этого протокола является отслеживание гортани во время криосекции, что обеспечивает точную идентификацию внутренних мышц гортани и снижает вероятность потери тканей. Рисунки демонстрируют прогрессивную криосечение в обеих плоскостях. Двадцать девять крысиных геми-ларингов были криосекциированы и отслежены от появления щитовидного хряща до появления первой секции, которая включала полную голосовую складку. Полная голосовая складка была визуализирована для всех животных в обоих плоскостях. Отмечалась высокая вариабельность расстояния от появления щитовидного хряща до появления полной голосовой складки в обеих плоскостях. Вес не коррелировал с глубиной гортанных ориентиров, предполагая, что индивидуальная изменчивость и другие факторы, связанные с подготовкой тканей, могут быть ответственны за высокую изменчивость внешнего вида ориентиров во время секционирования. Это исследование детализирует методологию и представляет морфологические данные для подготовки голосовой складки крысы к гистохимическому нервно-мышечному исследованию. Из-за высокой индивидуальной вариабельности ориентиры гортани должны тщательно отслеживаться во время криосекции, чтобы предотвратить пересечение ткани и потерю тканей. Использование последовательной методологии, включая адекватную подготовку тканей и осведомленность о ориентирах в гортани крысы, поможет получить последовательные результаты во всех исследованиях и поможет новым исследователям, заинтересованным в использовании голосовой складки крысы в качестве модели для изучения нервно-мышечных механизмов гортани.
Introduction
Крысиная гортань является хорошо зарекомендовавшей себя моделью для исследования структурных и функциональных нервно-мышечных адаптаций гортани к развитию, старению, болезням и фармакологическим агентам1,2,3,4,5. Согласованность гистологических методов имеет решающее значение для этого направления работы, поскольку существует множество тонкостей, связанных с подготовкой и анализом мышц, а также проблемы, связанные с размером гортани, формой и топографией мышц, инкапсулированных в гортанных хрящах1,6,7,8,9,10,11 . Из-за небольшого размера внутренних мышц гортани крыс систематическое встраивание, замораживание и криосечение имеют решающее значение для достижения последовательных и точных результатов. Например, при разрезании голосовой складки крысы в корональной плоскости нервно-мышечные соединения (NMJ) четырех внутренних мышц гортани расположены в пределах менее 1,8 мм глубины ткани11. Поэтому точный мониторинг анатомии гортанных мышц во время криосекции необходим для точного определения интересующего участка (участков) и предотвращения чрезмерного разреза ткани. Чрезмерное вырезание целевой мышцы может привести к неточной идентификации числа и топографии NMJs11 или может привести к общему уменьшению размера выборки, если целевая мышца отброшена из-за путаницы ориентации ориентира12. По мере разработки новых моделей для изучения мышц гортани и их соответствующих адаптаций стандартные операционные процедуры необходимы для обеспечения точности, надежности и воспроизводимости результатов во всех исследованиях.
Целью данной статьи является детальная подготовка голосовой складки крысы к оптимальному продольному и поперечному анализу. Описаны подробные методы, регулярно используемые в нашей лаборатории для выявления целевых мышечных ориентиров во время криосекции. Хотя подобные методы используются в нескольких лабораториях, здесь приводится более подробная информация, чем в литературе, чтобы обеспечить надежную и точную репликацию при внедрении начинающими исследователями. Целью этого учебника является предоставление стандартной методологии иммуногистохимической (IHC) оценки голосовой складки крыс для улучшения согласованности в лабораториях и исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было проведено в соответствии с Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Медицинской школы Нью-Йоркского университета.
1. Рассечение гортани крысы
- Усыпляйте крыс в соответствии с институционально утвержденным протоколом. Сбрить вентральную шейку от нижней челюсти до манубриума и тампона спиртом, чтобы предотвратить загрязнение меха в образцах тканей.
- Под рассекающим прицелом с 10-кратным увеличением иссейте всю гортань, создав разрез шеи средней линии скальпелем до тех пор, пока трахея не обнажится.
- Отделите вентральные наружные гортанные мышцы по средней линии, чтобы обнажить гортань с помощью щипцов и рассекающих ножниц или скальпеля.
- Отрежьте каудальную трахею до третьего кольца трахеи и сделайте ростральный разрез к подъязычной кости, чтобы иссечь всю гортань с помощью рассекающих ножниц.
- Удалите наружные ткани гортани (пищевод, щитовидную железу и наружные гортанные мышцы) из гортани с помощью инструментов микродиссекции (пинцет, булавки и микросублицы) под увеличением.
- С помощью микроциссоров делят гортань пополам дорсально между аритеноидами, используя среднюю линию между задними крикоаритеноидными мышцами в качестве ориентира. Закрепите боковые стенки гортани, чтобы обнажить голосовые складки, а затем вентрально разделить пополам через среднюю линию щитовидного хряща между передней комиссурой голосовых складок с помощью микросублиц (рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть необязательным; его можно пропустить, чтобы сохранить гортань целой. Бисекция ларингов допускает несколько методов иммуноокрашения путем раздельного использования правой и левой сторон одной и той же гортани. - Промыть каждую гемигортань в фосфатно-буферном растворе (PBS) в течение ~ 10 с и деликатно высушить с помощью рабочего стеклоочистителя, чтобы уменьшить образование кристаллов льда во время замораживания.
2. Зафиксируйте и/или заморозьте ткань гортани
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация может быть не идеальной для всех протоколов иммуноокрашения. Часто ткани гортани мгновенно замораживаются свежими сразу после рассечения. Пропустите шаг 2.1, чтобы мгновенно заморозить ткань гортани без фиксации.
- Для фиксации гемиларингов помещают ткани в центрифужную трубку, заполненную 4% формальдегидом в ПБС в течение 1 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере при 70 об/мин. Переложите ткани в чистую центрифужную трубку и промойте 3 раза в течение 20 минут в PBS. Затем переложить в чистую центрифужную трубку и погрузить в 20% раствор сахарозы/5% глицерина (~18 ч или до тех пор, пока ткань не утонет) при 4 °C.
ВНИМАНИЕ: Формальдегид опасен и должен использоваться в вытяжном шкафу вместе с соответствующими средствами индивидуальной защиты. - Поместите все геми-ларинги в однородное положение в криоформу, заполненную компаундом оптимальной температуры резания (OCT). Для гемилярной глотки поместите ткань с медиальной поверхностью голосовой складки, обращенной к нижней части криомольда, и продольным аспектом голосовой складки параллельно нижнему краю отверстия криомольда. Для целых ларингов поместите ткань с задними крикоаритеноидами лицом к нижней части криомольда и продольным аспектом голосовой складки параллельно нижнему краю криомольдного отверстия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательная ориентация гортани в соединении OCT имеет решающее значение для криосекции голосовой складки крысы. После того, как гемилярная глотка внедрена и заморожена, ее необходимо разморозить, чтобы изменить ее ориентацию, тем самым создавая риски повреждения тканей от нескольких циклов оттаивания-замораживания. - Ткани мгновенной заморозки с использованием изопентана (2-метилбутана) охлаждают в стальном стакане, окруженном жидким азотом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изопентан достигает оптимальной температуры для замерзания тканей, когда белые осадки начинают образовываться по бокам и дну стакана13. Изопентан используется потому, что он имеет более высокую теплопроводность, чем жидкий азот, что помогает предотвратить растрескивание тканевого блока при быстром замораживании. Для более подробного описания замораживания тканей в безрецептурном режиме обратитесь к Kumar et al.13. - Заверните каждую форму в предварительно маркированную фольгу и поместите в индивидуальный морозильный мешок для предотвращения обезвоживания и немедленно храните на сухом льду до передачи для хранения в морозильной камере при температуре -80 °C.
3. Криосекция гемилярной глотки в плоскости поперечного сечения
- Установите температуру камеры в криостате на -20 °C, что находится в середине температурного диапазона (15−25 °C), рекомендованного для разрезания мышечной ткани руководством производителя.
- Установите толщину секции криостата на толщину 10 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа поперечного сечения мышечных волокон оптимальны срезы толщиной 10 мкм, чтобы обеспечить полное окрашивание и надежную интенсивность визуализации меченых мышечных волокон для анализа типирования волокон14,15,16. Некоторые протоколы могут требовать различной толщины сечения в зависимости от нервно-мышечных мишеней. - Перенесите ткани в криостатную камеру, добавьте однородный слой соединения OCT на диск образца криостата (патрон) и поместите встроенный блок тканей поверх соединения OCT на диск образца. Чтобы получить поперечные сечения голосовой складки для анализа тимеоаритеноидных (ТА) мышечных волокон, прикрепите образец к патрону так, чтобы вентральный щитовидный хрящ был обращен к лезвию криостата, а аритеноидный хрящ — к диску образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что эти ориентиры не видны на этом этапе из-за того, что соединение OCT становится белым и непрозрачным при замораживании. Это отсутствие видимости является причиной того, что важно отметить ориентацию гемилярной глотки во время стадии замораживания вспышки. - Обрежьте соединение OCT путем продвижения головки образца на 100 мкм до тех пор, пока не появится вентральная часть щитовидного хряща.
- Затем обрежьте и отслеживайте участки 30 мкм от начала щитовидного хряща до тех пор, пока не будут обнажены lamina propria, медиальные мышцы TA и боковая мышца TA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентиры гортани должны отслеживаться и отмечаться с самого начала щитовидного хряща каждые 100 мкм, чтобы угол сечения не был косым. На рисунке 2 представлены два набора ориентиров гортани в плоскости поперечного сечения при 10-кратном увеличении. - Как только целевая мышца ТА достигнута, соберите участки на положительно заряженных слайдах на 10 мкм.
- Храните срезы в PBS при температуре 4 °C, чтобы сохранить влагу до тех пор, пока они не будут готовы к окрашиванию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированная ткань может храниться в PBS до одной недели в зависимости от мишени IHC, тогда как нефиксированная ткань должна быть немедленно обработана.
4. Криосекция гемилярной глотки в продольной плоскости
- Когда криостатная камера снова установлена на -20 °C, измените толщину сечения на 30 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа NMJ толщина ткани между 30−60 мкм может быть использована для захвата нескольких полных NMJ в мышцах гортани без фрагментации ни нервного терминала, ни концевой пластины двигателя11,12,17. - Чтобы получить продольные участки голосовой складки для NMJ-анализа мышцы TA, прикрепите образцы к патрону так, чтобы надгортанник был ориентирован на лезвие криостата, а просвет трахеи обращен вниз к диску образца.
- Обрежьте соединение OCT, продвигая головку образца на 100 мкм до появления щитовидного хряща.
- Обрезка и отслеживание участков 30 мкм от начала щитовидной железы до обнажения ламины проприи и медиальных и боковых отделов мышцы ТА.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пять наборов ориентиров гортани в продольной плоскости рекомендуются для отслеживания прогрессирования глубины ткани к целевой мышце ТА. На рисунке 3 представлены ориентиры гортани в продольной плоскости при 10-кратном увеличении. - Как только целевая мышца ТА достигнута, соберите участки на положительно заряженных слайдах на 30 мкм.
- Храните срезы в PBS при температуре 4 °C, чтобы сохранить влагу до тех пор, пока они не будут готовы к окрашиванию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативные результаты были частью продолжающегося исследования влияния вокальных упражнений на нервно-мышечную систему гортани. Двадцать девять самцов крыс Fischer 344/brown Norway (12 9-месячных, 17 24-месячных) были взвешены и усыплены с вдыханием CO2 с последующей двусторонней торакотомией.
Процедуры следовали описанному протоколу для маркировки NMJ и размера волокон боковых и медиальных мышц TA. Расстояние между гортанными ориентирами отслеживалось как в продольной, так и в поперечной плоскостях с использованием гортанных мышц и окружающих хрящей для определения прогрессирования во время криосекции (таблица 1). Отслеживание началось при первом появлении щитовидного хряща в обеих плоскостях направления. Рисунок 2 иллюстрирует появление ориентиров гортани во время криосекции поперечного сечения во временном порядке с щитовидной железой (рисунок 2a,b), появляющейся перед медиальной мышцей TA и lamina propria (рисунок 2c,d). Рисунок 3 иллюстрирует появление ориентиров гортани во время продольной криосекции во временном порядке с алярной мышцей (рисунок 3a,b), появляющейся перед медиальной мышцей TA (рисунок 3c,d) и lamina propria (рисунок 3e,f).
В обеих плоскостях направления расстояния между ориентирами сильно варьировались для отдельных животных.
Вес и внешний вид гортани имели слабые и умеренные корреляции для молодых крыс и слабые корреляции для пожилых крыс (таблица 2 и таблица 3). Расстояния между ориентирами в пределах каждой плоскости были умеренно или сильно коррелированы для обеих возрастных групп, но слабо коррелировали между двумя плоскостями рассечения. Поэтому изменчивость внешнего вида ориентира не может быть объяснена весом или индивидуальными изменениями размера гортани.
Рисунок 1: Гортань крысы дорсально разделена пополам между арытеноидными хрящами (ArC).
Правая сторона гортани аннотирована ориентирами в продольной плоскости (LZ1-LZ5), соответствующими пяти продольным ориентирам в таблице 1. Левая сторона геми-гортани аннотирована ориентирами в плоскости поперечного сечения (CZ1 и CZ2), которые соответствуют началу боковой мышцы ТА и полному поперечному сечению голосовой складки соответственно. VF = голосовая складка, CrC = крикоидный хрящ, AlC = аларный хрящ и T1 = первое трахеальное кольцо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Два поперечных сечения, изображенные при 10-кратном увеличении в ярком поле (справа) и в флуоресцентном канале 488 (слева) после иммуноокрашивания ламинина для очерчивания мышечных волокон.
Разделы (сверху вниз) показывают прогрессирование во время криосекции во временном порядке с щитовидной железой (a,b), появляющейся до медиальной мышцы TA и lamina propria голосовой складки (c,d). ThC = щитовидный хрящ, LTA = боковой тиреоаритеноид, и MTA = медиальный тиреоаритеноид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Три продольных участка, изображенных при 10-кратном увеличении в ярком поле (справа) и в флуоресцентном канале 488 (слева) после иммуноокрашения нервно-мышечных соединений.
Участки (сверху вниз) показывают прогрессирование во время криосекции во временном порядке с алярной мышцей (a,b), появляющейся перед медиальной мышцей TA (c,d) и lamina propria (e,f) голосовой складки. AlC = аларный хрящ, ThC = щитовидный хрящ, ArC = аритеноидный хрящ, LTA = латеральный тиреоаритеноид, MTA = медиальный тиреоаритеноид и SCA = верхний крикоаритеноид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Продольные ориентиры | Среднее (стандартное отклонение) в мкм | Диапазон в мкм | |
| 1. Все три основных хряща (щитовидный, алар, аритеноид) появились с появлением мышечных волокон | 1,591 (665) | 350–2,800 | |
| 2. Появились верхний крикоаритеноид (SCA), аларный крикоаритеноид (ACA) и боковые тиреоаритеноидные (LTA) мышцы | 2,344 (591) | 91–3,500 | |
| 3. Мышцы ACA и LTA расширены полностью без фрагментации | 2,631 (532) | 1505–3,640 | |
| 4. Увеличен аритеноидный хрящ, исчезла ACA, появилась медиальная тиреоаритеноидная (MTA) мышца | 2,948 (606) | 1765–4,305 | |
| 5. Цельная секция голосовой складки: мышцы LTA и MTA расширены полностью без фрагментации и появилась lamina propria | 3,131 (542) | 2205–4410 | |
| Ориентиры поперечного сечения | |||
| 1. Появилась мышца LTA | 303 (138) | 110–690 | |
| 2. Появилась мышца MTA и составила ~50% от размера LTA с отмеченной прозрачной пластинкой проприи и эпителием. | 482 (167) | 210–850 | |
Таблица 1: Расстояния в мкм от первого появления щитовидного хряща до каждого ориентира гортани во время криосекции (n = 29).
| КГА | Продольный | |||||||
| ЛТА | МТА | Хрящей | Алар/SCA | ЛТА | МТА | ЛП | ||
| КГА | ЛТА | 1 | ||||||
| МТА | 0.88 | 1 | ||||||
| Продольный | Хрящей | 0.42 | 0.42 | 1 | ||||
| Алар/SCA | 0.57 | 0.47 | 0.77 | 1 | ||||
| ЛТА | 0.59 | 0.47 | 0.71 | 0.98 | 1 | |||
| МТА | 0.53 | 0.39 | 0.72 | 0.97 | 0.98 | 1 | ||
| ЛП | 0.53 | 0.41 | 0.76 | 0.96 | 0.97 | 0.99 | 1 | |
| Вес | -0.55 | -0.35 | 0.08 | -0.45 | -0.46 | -0.46 | -0.41 | |
Таблица 2: Результаты корреляции Пирсона между весом и глубиной гортанных ориентиров в плоскостях поперечного сечения (CSA) и продольного для молодых самцов крыс. LTA = латеральный тиреоаритеноид, MTA = медиальный тиреоаритеноид, SCA = верхний крикоаритеноид и LP = lamina propria.
| КГА | Продольный | |||||||
| ЛТА | МТА | Хрящей | Алар/SCA | ЛТА | МТА | ЛП | ||
| КГА | ЛТА | 1 | ||||||
| МТА | 0.9 | 1 | ||||||
| Продольный | Хрящей | 0.21 | 0.33 | 1 | ||||
| Алар/SCA | 0.05 | 0.07 | 0.73 | 1 | ||||
| ЛТА | -0.06 | -0.04 | 0.64 | 0.96 | 1 | |||
| МТА | -0.02 | -0.02 | 0.6 | 0.79 | 0.84 | 1 | ||
| ЛП | -0.17 | -0.15 | 0.52 | 0.76 | 0.85 | 0.91 | 1 | |
| Вес | 0.23 | 0.13 | -0.24 | -0.07 | -0.15 | -0.15 | -0.3 | |
Таблица 3: Результаты корреляции Пирсона между весом и глубиной гортанных ориентиров в плоскостях поперечного сечения (CSA) и продольной плоскости для старых самцов крыс. LTA = латеральный тиреоаритеноид, MTA = медиальный тиреоаритеноид, SCA = верхний крикоаритеноид и LP = lamina propria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Подготовка голосовых складок крыс к нервно-мышечному анализу может столкнуться с различными проблемами. Мало того, что гортанные мышцы малы и окружены хрящом, что затрудняет непосредственное извлечение мышц-мишеней, высокая изменчивость также была обнаружена между животными в глубине анатомических ориентиров гортани. Для протокола плоскости поперечного сечения мышц после первоначального появления вентрального тиреоидного хряща появились полные участки голосовой складки между 21−85 участками (10 мкм на сечение), что несколько меньше, чем 63−126 сечений (35 мкм на сечение) в продольной плоскости для протоколов анализа НМЖ (таблица 1).
Вариабельность отмечалась в расстояниях между ориентирами гортани, несмотря на равномерное встраивание, ориентацию и секционирование тканей для каждого типа протокола. Кроме того, различия в массе тела не учитывали изменчивость в широких диапазонах глубины тканей от одного набора ориентиров гортани к другому. Эта изменчивость расстояния между ориентирами гортани может быть обусловлена индивидуальными различиями в анатомии гортани у животных, небольшими различиями в ориентации ларингсов в криомольде внутри соединения OCT во время рассечения или тем, как образцы были помещены на диск образца в криостате при сечении (т. Е. Количество соединения OCT, помещенного на диск образца до монтажа, или небольшие различия в углу размещения).
С пониманием того, что эти небольшие различия в подготовке образцов могут привести к существенной изменчивости в глубине ориентиров ткани гортани, крайне важно, чтобы начинающие исследователи имели справочную карту для работы. Описанные протоколы исследования, определяющие методы идентификации мышц, представляющих интерес, и предотвращения ловушек протокола, таких как описанные в этом документе, могут улучшить воспроизводимость и предотвратить нежелательную потерю тканей.
Хотя это исследование было сосредоточено на мышцах ТА, эта методология применима и для других внутренних мышц гортани. Например, сечение в плоскости продольной голосовой складки дает продольные участки мышечных волокон алярных, латеральных ТА, медиальных ТА, боковых крикоареноидных и верхних крикоаритеноидных мышц, а также поперечные сечения задних крикоаритеноидных мышц. Сечение в плоскости поперечной голосовой складки дает поперечные сечения алярных, боковых ТА, медиальных ТА, боковых крикоаритеноидных, верхних крикоаритеноидных и крикотиреоидных мышц, а также продольных отделов задних крикоаритеноидных мышц. Кроме того, хотя это исследование не включало самок крыс, различия между самцами и самками крыс в внешнем виде гортани не ожидаются, потому что половой диморфизм в гортани крысы является мышечно-специфическим и не связан с анатомией гортанного каркаса16,18.
Изменчивость расстояния между ориентирами гортани может затруднить криосекцию голосовой складки крысы для начинающих исследователей. Это исследование показало, что, несмотря на последовательность в том, как крысиные ларинги были заморожены, встроены и криосекционированы, расстояние между гортанными ориентирами сильно варьировалось; вес животных не учитывал эту изменчивость. Это исследование предоставляет подробные процедуры с соответствующими изображениями о том, как правильно подготовить мышечную ткань гортани и определить ориентиры гортани для нервно-мышечного гистологического исследования голосовой складки крысы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) и K23DC014517 (Johnson, PI) от Национального института глухоты и других коммуникативных расстройств Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. |
References
- Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), Pt 1 579-586 (2002).
- Suzuki, T., et al. Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).
- Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration. Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).
- Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context. Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).
- Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval. Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).
- Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats. Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).
- Ciucci, M. R., et al. Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats. Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).
- Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease. Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).
- Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats. American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).
- Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats. Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).
- Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function. Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).
- Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).
- McMullen, C. A., et al. Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).
- Lenell, C., Johnson, A. M. Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat. Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats. Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).
