Summary
Bu protokol, histokimyasal nöromüsküler çalışma için sıçan vokal kıvrımları hazırlamak için kullanılan yöntemleri açıklar.
Abstract
Bu öğreticinin amacı histokimyasal nöromüsküler çalışma için sıçan vokal kıvrımının hazırlanmasını tanımlamaktır. Bu protokol, sıçan gırtlağım diseksiyonu, flaş dondurma ve ses kıvrımlarının kriyoseksiyonu için prosedürleri özetlemektedir. Bu çalışmada hem boyuna hem de kesitsel düzlemlerde kriyoseksiyon vokal kıvrımlarının nasıl ağlaşılacağı açıklanmaktadır. Bu protokolün bir yeniliği, kriyoseksiyon sırasında içsel gırtlağın doğru tanımlanmasını sağlayan ve doku kaybı olasılığını azaltan gırtlağı takibidir. Rakamlar her iki düzlemde de ilerleyici kriyoseksiyon olduğunu gösteriyor. Tiroid kıkırdılmasının ortaya çıkışından tam vokal kıvrımını içeren ilk bölümün görünümüne kadar yirmi dokuz sıçan hemi-larynges kriyoseksiyon ve izlendi. Tam vokal kıvrımı her iki düzlemdeki tüm hayvanlar için görselleştirildi. Tiroid kıkırdajının görünümünden her iki düzlemde de tam ses kıvrımının görünümüne kadar olan mesafede yüksek değişkenlik vardı. Ağırlık, laringeal yer işaretlerinin derinliği ile ilişkili değildi, bu da bireysel değişkenlik ve doku hazırlığı ile ilgili diğer faktörlerin, bölümleme sırasında yer işaretlerinin görünümündeki yüksek değişkenliklerden sorumlu olabileceğini düşündürdü. Bu çalışma bir metodolojiyi detaylandırıyor ve sıçan vokal kıvrımını histokimyasal nöromüsküler araştırma için hazırlamak için morfolojik veriler sunuyor. Yüksek bireysel değişkenlik nedeniyle, aşırı doku ve doku kaybını önlemek için kriyoseksiyon sırasında gırtlağı yer işaretleri yakından takip edilmelidir. Yeterli doku hazırlama ve sıçan larinks içindeki yer işaretlerinin farkındalığı da dahil olmak üzere tutarlı bir metodolojinin kullanılması, çalışmalar genelinde tutarlı sonuçlara yardımcı olacak ve laringeal nöromüsküler mekanizmaları araştırmak için sıçan vokal kıvrımını bir model olarak kullanmakla ilgilenen yeni araştırmacılara yardımcı olacaktır.
Introduction
Sıçan larinksi, gelişim, yaşlanma, hastalık ve farmakolojik ajanlara yapısal ve fonksiyonel nöromüsküler laringeal adaptasyonları araştırmak için iyi kurulmuş bir modeldir1,2,3,4,5. Histolojik yöntemlerin tutarlılığı, kas hazırlama ve analizinde birden fazla incelik olduğu gibi gırtlağı kıkırdaklar içinde kapsüllenen kasların gırtlağı boyutu, şekli ve topografyası ile ilgili zorluklar olduğu için bu iş kolu için kritik öneme sahiptir1,6,7,8,9,10,11 . Sıçan içsel gırtlağım kaslarının küçük boyutu nedeniyle, tutarlı ve doğru sonuçlar elde etmek için sistematik gömme, dondurma ve kriyoseksiyon kritik öneme sahiptir. Örneğin, sıçan ses kıvrımını koronal düzlemde bölümlerken, içsel gırtlağı kaslarının dördünün nöromüsküler kavşakları (NMJs) doku derinliğinin 1,8 mm'den daha az içinde bulunur11. Bu nedenle, kriyoseksiyon sırasında gırtlaj kas anatomisinin hassas bir şekilde izlenmesi, ilgi alanlarını doğru bir şekilde tanımlamak ve dokunun aşırı bölümünü önlemek için zorunludur. Hedef kasın aşırı gözden belirlenmesi, NMJs11'in sayısının ve topografyasının yanlış tanımlanmasına neden olabilir veya hedef kas dönüm noktası oryantasyon karışıklığı nedeniyle atılırsa örnek boyutunda genel azalmalara neden olabilir12. Laringeal kasların ve ilgili adaptasyonlarının incelenmesi için yeni modeller geliştirildiği için, sonuçların kesin, güvenilir ve çalışmalar arasında tekrarlanabilir olmasını sağlamak için standart çalışma prosedürleri gereklidir.
Bu makalenin amacı, sıçan vokal kıvrımının optimal boyuna ve kesitsel analiz için hazırlanmasını detaylandırmaktır. Kriyoseksiyon sırasında hedef kas yer işaretlerini belirlemek için laboratuvarımızda düzenli olarak kullanılan ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Benzer yöntemler birkaç laboratuvarda kullanılsa da, acemi araştırmacılar tarafından uygulandığında güvenilir ve doğru replikasyon sağlamak için burada literatüre göre daha fazla ayrıntı sağlanmaktadır. Bu öğreticinin amacı, laboratuvarlar ve araştırmalar arasında tutarlılığı artırmak için sıçan vokal kıvrımının immünohistokimyasal (IHC) değerlendirilmesi için standart bir metodoloji sağlamaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma New York Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'ne uygun olarak gerçek gerçekleştirildi.
1. Sıçan larinksi diseksiyon
- Kurumsal olarak onaylanmış protokole göre sıçanı ötenazi edin. Doku örneklerinde kürk kirlenmesini önlemek için ventral boynu mandibuladan manubriuma tıraş edin ve alkolle sürün.
- 10x büyütmeli bir diseksiyon dürbün altında, nefes borusu açığa çıkına kadar neşterle orta hat boyun kesisi oluşturarak tüm larinksi kesinleştirin.
- Dış dıştrinsik gırtlaj kaslarını orta çizgide ayırarak, karaçamı, önps ve diseksiyon makası veya neşter kullanarak ortaya çıkarır.
- Trakea kaudalini üçüncü trakeal halkaya kesin ve diseksiyon makası kullanarak tüm larinksi çıkarmak için hyoid kemiğine bir kesi rostral yapın.
- Dışsal gırtlak dokularını (yemek borusu, tiroid bezi ve dıştrinsik gırtlak kasları) büyütme altında mikrodiseksiyon araçları (cımbız, pim ve mikros makas) kullanarak gırtlaktan çıkarın.
- Mikroscisörlerle, arka krikoarytenoid kasları arasındaki orta çizgiyi bir dönüm noktası olarak kullanarak gırtlağı arytenoidler arasında dorsally olarak ikiye ayırın. Ses kıvrımlarını ortaya çıkarmak için larinksin yanal duvarlarını sabitleyin ve daha sonra mikroscisörlerle ses kıvrımlarının ön komiseri arasındaki tiroid kıkırdayının orta çizgisi boyunca ventral olarak ikiye ayırın (Şekil 1).
NOT: Bu adım isteğe bağlı olabilir; larinksi bütün tutmak için atlanabilir. Laringlerin bizeksiyonu, aynı larinksin sağ ve sol taraflarını ayrı ayrı kullanarak birden fazla immünostainasyon tekniğine izin verir. - Her bir hemi-gırtlağı fosfat tamponlu çözeltide (PBS) ~10 s durulayın ve donma sırasında buz kristali oluşumunu azaltmak için bir görev silecek ile hassas bir şekilde kurulayın.
2. Largeal dokuyu düzeltin ve/veya flaş dondurun
NOT: Fiksasyon tüm immün sistemi baskılama protokolleri için ideal olmayabilir. Genellikle laringeal dokular diseksiyondan hemen sonra flaş donmuş tazedir. Fiksasyon yapmadan laringeal dokuyu flaş dondurmak için adım 2.1'i atlayın.
- Hemi-larynges sabitlemek için dokuları PBS'de% 4 formaldehit ile dolu santrifüj tüpüne 70 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda oda sıcaklığında 1 saat yerleştirin. Dokuları temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve PBS'de 20 dakika boyunca 3x durulayın. Daha sonra temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de% 20 sakkaroz /% 5 gliserol çözeltisine (~ 18 saat veya doku batana kadar) batırın.
DİkKAT: Formaldehit tehlikelidir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla birlikte duman kaputunda kullanılmalıdır. - Tüm hemi-larynges'i düzgün bir konuma, optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile dolu bir kriyo kalıbına yerleştirin. Hemilarynx için, ses kıvrımının medial yüzeyine sahip dokuyu kriyodoldun altına ve vokal kıvrımının boyuna yönüne kriyomold açıklığının alt kenarına paralel olarak yerleştirin. Tüm larynges için, arka krikoarytenoidler kriyooldun altına ve kriyomold açıklığının alt kenarına paralel olarak vokal kıvrımının boyuna yönüne bakan dokuyu yerleştirin.
NOT: OCT bileşiği içindeki tutarlı gırtlaj yönelimi, sıçan vokal kıvrımının kriyoseksiyonu için kritik öneme sahiptir. Hemilarynx gömülüp dondurulduktan sonra, yönünü değiştirmek için çözülmelidir, böylece birden fazla çözülme-donma döngüsünden doku hasarı riskleri ortaya getirilmelidir. - Sıvı nitrojenle çevrili çelik bir beherde soğutulmuş izopentan (2-metilbütan) kullanarak flaş donduran dokular.
NOT: Beherin yanlarında ve dibinde beyaz çökeltiler oluşmaya başladığında izopentan doku dondurma için en uygun sıcaklığa ulaşır13. Izopentan, sıvı nitrojenden daha yüksek bir termal iletkenliğe sahip olduğu için kullanılır, bu da hızlı donma sırasında doku bloğunun çatlamasını önlemeye yardımcı olur. OTC'deki donma dokusunun daha ayrıntılı bir açıklaması için Kumar ve ark.13'e bakın. - Her kalıbı önceden etiketlenmiş folyoya sarın ve dehidrasyonu önlemek için ayrı bir dondurucu torbasına yerleştirin ve -80 °C dondurucuda saklanmak üzere transfer edilene kadar hemen kuru buzda saklayın.
3. Kesit düzleminde kriyoseksiyon hemilarynx
- Kriyostattaki oda sıcaklığını, üretici kılavuzu tarafından kas dokusu kesiti için önerilen sıcaklık aralığının (15−25 °C) ortasındaki -20 °C'ye ayarlayın.
- Kriyostat kesit kalınlığını 10 μm kalınlığında bölümlere ayarlayın.
NOT: Kas lifi kesit analizi için, 10 μm kalınlığındaki bölümler, fiber tipleme analizi için etiketli kas liflerinin tam boyama ve sağlam görüntüleme yoğunluğuna izin vermek için en uygun bölümlerdir14,15,16. Bazı protokoller nöromüsküler hedeflere bağlı olarak farklı kesit kalınlığı gerektirebilir. - Dokuları kriyostat odasına aktarın, kriyostat numune diskine (chuck) düzgün bir OCT bileşiği katmanı ekleyin ve gömülü doku bloğunu örnek diskteki OCT bileşiğin üzerine yerleştirin. Tirarytenoid (TA) kas lifi analizi için vokal kıvrımının kesitlerini elde etmek için, numuneyi aynaya yapıştırın, böylece ventral tiroid kıkırdağı kriyostat bıçağına ve arytenoid kıkırdak örnek diske bakacaktır.
NOT: OCT bileşiği dondurulduğunda beyaz ve opak hale geldiğinden, bu yer işaretlerinin bu aşamada görünmediğini belirtmek önemlidir. Bu görünürlük eksikliği, flaş dondurma aşamasında hemilarynx'in yönünü not etmenin kritik öneme sahip olmasının nedenidir. - Tiroid kıkırdantının ventral kısmı görünene kadar numune kafasını 100 μm ilerleterek OCT bileşiği kırpın.
- Daha sonra tiroid kıkırdılmasının başlangıcından lamina propria, medial TA kasları ve lateral TA kası açığa çıkarana kadar 30 μm kesitleri kırpın ve izleyin.
NOT: Gırtlağı simgesel yapılar izlenmeli ve kesit açısının eğik olmadığından emin olmak için tiroid kıkırdajının başlangıcından itibaren her 100 μm'de bir not edilmelidir. Şekil 2 , kesit düzlemdeki iki laringeal yer işareti kümesini 10x büyütmede temsil eder. - Hedef TA kasına ulaşıldıktan sonra, 10 μm'de pozitif yüklü slaytlarda bölümler toplayın.
- Lekelendirilmeye hazır olana kadar nemi korumak için bölümleri PBS'de 4 °C'de saklayın.
NOT: Sabit doku IHC hedefine bağlı olarak PBS'de bir haftaya kadar saklanabilirken, düzeltilmemiş doku derhal işlenmelidir.
4. Boyuna düzlemde kriyoseksiyon hemilarynx
- Kriyostat odası tekrar -20 ° C'ye ayarlanmışken, kesit kalınlığını 30 μm'ye değiştirin.
NOT: NMJ analizi için, sinir terminali veya motor plakasının parçalanması olmadan gırtlaj kasları içindeki birkaç tam NMJ'yi yakalamak için 30−60 μm arasında bir doku kalınlığı kullanılabilir11,12,17. - TA kasının NMJ analizi için boyuna vokal katlama bölümleri elde etmek için, numuneleri aynaya yapıştırın, böylece epiglottis kriyostat bıçağına ve trakeal lümen numune diskine doğru aşağı doğru yönelir.
- Tiroid kıkırdağı görünene kadar numune kafasını 100 μm ilerleterek OCT bileşiği kırpın.
- Tiroidin başlangıcından TA kasının lamina propria ve medial ve lateral bölünmelerine kadar 30 μm'lik bölümleri kırpın ve izleyin.
NOT: Boyuna düzlemdeki beş laringeal yer işareti seti, doku derinliğinin hedef TA kasına doğru ilerlemesini izlemek için önerilir. Şekil 3 , 10x büyütmede boyuna düzlemdeki laringeal işaretleri temsil eder. - Hedef TA kasına ulaşıldıktan sonra, 30 μm'de pozitif yüklü slaytlarda bölümler toplayın.
- Lekelendirilmeye hazır olana kadar nemi korumak için bölümleri PBS'de 4 °C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temsili sonuçlar, vokal egzersizinin laringeal nöromüsküler sistem üzerindeki etkilerinin devam eden bir araştırmasının bir parçasıydı. 29 erkek Fischer 344/kahverengi Norveç sıçanı (12 9 aylık, 17 24 aylık) CO2 inhalasyonu ve ardından bilateral torakotomi ile tartıldı ve ötenaziye tabi tökezlendi.
Prosedürler, lateral ve medial TA kaslarının NMJ'leri ve lif boyutunu etiketlemek için belirtilen protokolü izledi. Gırtlağı simgesel yapıları arasındaki mesafe, kriyoseksiyon sırasında ilerlemeyi belirlemek için gırtlağı kasları ve çevresindeki kıkırdaklar kullanılarak hem boyuna hem de kesitsel düzlemlerde izlendi (Tablo 1). İzleme, tiroid kıkırdajının her iki yönlü düzlemde ilk görünümünde başladı. Şekil 2, medial TA kası ve lamina propriası öncesinde ortaya çıkan tiroid ile zamansal sırada kesit kriyoseksiyon sırasında gırtlak yer işaretlerinin görünümünü göstermektedir (Şekil 2c,d). Şekil 3, medial TA kası (Şekil 3c,d) ve lamina propria'dan önce ortaya çıkan alar kas (Şekil 3a,b) ile zamansal sırada boyuna kriyoseksiyon sırasında gırtlak yer işaretlerinin görünümünü göstermektedir (Şekil 3e,f).
Her iki yönlü düzlemde, simge yapılar arasındaki mesafeler bireysel hayvanlar için büyük ölçüde değişti.
Ağırlık ve laringeal dönüm noktası görünümlerinde genç sıçanlar için zayıf ila orta korelasyonlar ve yaşlı sıçanlar için zayıf korelasyonlar vardı (Tablo 2 ve Tablo 3). Her düzlemdeki yer işaretleri arasındaki mesafeler, her iki yaş grubu için de orta derecede güçlü bir şekilde ilişkiliydi, ancak iki diseksiyon düzlemi arasında zayıf bir şekilde ilişkiliydi. Bu nedenle, dönüm noktası görünümündeki değişkenlik, laringeal boyuttaki ağırlık veya bireysel varyasyonlarla hesaba katılamadı.
Şekil 1: Arytenoid kıkırdaklar (ArC) arasında dorsally ikiye bölünmüş bir sıçan larinks.
Hemi-larinksin sağ tarafı, Tablo 1'deki beş uzunlamasına simgesel yapıya karşılık gelen uzunlamasına düzlemdeki (LZ1-LZ5) simgesel yapılarla açıklamalandırılmıştır. Hemi-larinksin sol tarafı, sırasıyla yan ta kasının başlangıcına ve vokal kıvrımının tam kesitine karşılık gelen kesit düzleminde (CZ1 ve CZ2) yer işaretleri ile açıklamalı. VF = vokal kıvrımı, CrC = cricoid kıkırdak, AlC = alar kıkırdak ve T1 = ilk trakeal halka. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Laminin kas liflerini ana hatlarıyla belirlemesini takiben brightfield (sağda) ve floresan 488 kanalında (solda) 10x büyütmede iki kesit görüntülenmiştir.
Bölümler (yukarıdan aşağıya) kriyoseksiyon sırasındaki ilerlemeyi, medial TA kasından önce görünen tiroid (a,b) ve vokal kıvrımının lamina propriası (c,d) ile zamansal sırada gösterir. THC = tiroid kıkırdağı, LTA = lateral tiroarytenoid ve MTA = medial tiroarytenoid. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Nöromüsküler kavşaklar için immün yetinmeyi takiben brightfield (sağda) ve floresan 488 kanalında (solda) 10x büyütmede üç uzunlamasına bölüm görüntülenmiştir.
Bölümler (yukarıdan aşağıya) kriyoseksiyon sırasındaki ilerlemeyi, alar kas (a,b) medial TA kasından (c,d) önce ve vokal kıvrımının lamina propriasına (e,f) kadar zamansal sırada gösterir. ALC = alar kıkırdak, ThC = tiroid kıkırdağı, ArC = arytenoid kıkırdak, LTA = lateral tiroarytenoid, MTA = medial tiroarytenoid ve SCA = üstün krikoarytenoid. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Boyuna simge yapılar | μm'de ortalama (standart sapma) | μm aralığı | |
| 1. Her üç ana kıkırdak (tiroid, alar, arytenoid) kas liflerinin ortaya çıkmasıyla ortaya çıktı | 1,591 (665) | 350–2,800 | |
| 2. Üstün krikoarytenoid (SCA), alar cricoarytenoid (ACA) ve lateral tiroarytenoid (LTA) kasları ortaya çıktı | 2,344 (591) | 91–3,500 | |
| 3. ACA ve LTA kasları parçalanma olmadan tamamen uzatıldı | 2,631 (532) | 1505–3,640 | |
| 4. Arytenoid kıkırdak genişledi, ACA kayboldu, medial tiroarytenoid (MTA) kası ortaya çıktı | 2,948 (606) | 1765–4,305 | |
| 5. Hedef tam vokal kat bölümü: LTA ve MTA kasları parçalanmadan tamamen uzatıldı ve lamina propria ortaya çıktı | 3,131 (542) | 2205–4410 | |
| Kesitsel simge yapılar | |||
| 1. LTA kası ortaya çıktı | 303 (138) | 110–690 | |
| 2. MTA kası ortaya çıktı ve net lamina propria ve epitel ile LTA boyutunun ~% 50'siydi. | 482 (167) | 210–850 | |
Tablo 1: Kriyoseksiyon sırasında tiroid kıkırdavunun ilk görünümünden her gırtlağım simgesine kadar μm'deki mesafeler (n = 29).
| CSA | Boyuna | |||||||
| LTA | MTA | Kıkırdak | Alar/SCA | LTA | MTA | LP | ||
| CSA | LTA | 1 | ||||||
| MTA | 0.88 | 1 | ||||||
| Boyuna | Kıkırdak | 0.42 | 0.42 | 1 | ||||
| Alar/SCA | 0.57 | 0.47 | 0.77 | 1 | ||||
| LTA | 0.59 | 0.47 | 0.71 | 0.98 | 1 | |||
| MTA | 0.53 | 0.39 | 0.72 | 0.97 | 0.98 | 1 | ||
| LP | 0.53 | 0.41 | 0.76 | 0.96 | 0.97 | 0.99 | 1 | |
| Ağırlık | -0.55 | -0.35 | 0.08 | -0.45 | -0.46 | -0.46 | -0.41 | |
Tablo 2: Genç erkek sıçanlar için kesitsel (CSA) ve boyuna düzlemlerdeki ağırlık ve laringeal işaretlerin derinliği arasındaki Pearson korelasyonunun sonuçları. LTA = lateral tirarytenoid, MTA = medial tiroarytenoid, SCA = üstün krikoarytenoid ve LP = lamina propria.
| CSA | Boyuna | |||||||
| LTA | MTA | Kıkırdak | Alar/SCA | LTA | MTA | LP | ||
| CSA | LTA | 1 | ||||||
| MTA | 0.9 | 1 | ||||||
| Boyuna | Kıkırdak | 0.21 | 0.33 | 1 | ||||
| Alar/SCA | 0.05 | 0.07 | 0.73 | 1 | ||||
| LTA | -0.06 | -0.04 | 0.64 | 0.96 | 1 | |||
| MTA | -0.02 | -0.02 | 0.6 | 0.79 | 0.84 | 1 | ||
| LP | -0.17 | -0.15 | 0.52 | 0.76 | 0.85 | 0.91 | 1 | |
| Ağırlık | 0.23 | 0.13 | -0.24 | -0.07 | -0.15 | -0.15 | -0.3 | |
Tablo 3: Yaşlı erkek sıçanlar için kesitsel (CSA) ve boyuna düzlemlerdeki ağırlık ve laringeal yer işaretlerinin derinliği arasındaki Pearson korelasyonunun sonuçları. LTA = lateral tirarytenoid, MTA = medial tiroarytenoid, SCA = üstün krikoarytenoid ve LP = lamina propria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nöromüsküler analiz için sıçan vokal kıvrımlarının hazırlanması çeşitli zorluklarla karşı karşıya olabilir. Gırtlağı kasları sadece küçük ve kıkırdakla çevrili değildir, böylece doğrudan hedef kasın çıkarılmasını zorlaştırır, ayrıca gırtlağı anatomik yer işaretlerinin derinliğinde hayvanlar arasında yüksek değişkenlik bulunmuştur. Kesit düzlem protokolünü kaslamak için, ventral tiroid kıkırdajının ilk görünümünden sonra 21−85 bölüm (bölüm başına 10 μm) arasında tam ses kıvrım bölümleri ortaya çıktı, bu da NMJ analiz protokolleri için boyuna düzlemdeki 63−126 bölümden (bölüm başına 35 μm) biraz daha azdır (Tablo 1).
Değişkenlik, her protokol türü için dokuların tek tip gömülmesi, yönlendirilmesi ve bölümlenebilmesine rağmen laringeal yer işaretleri arasındaki mesafelerde kaydedildi. Ayrıca, vücut ağırlığındaki farklılıklar, bir dizi laringeal yer işaretinden diğerine kadar geniş doku derinliği aralıklarında değişkenliği hesaba katmadı. Gırtlağının simge yapıları arasındaki mesafedeki bu değişkenlik, hayvanlar arasında gırtlağını anatomisinde bireysel farklılıklardan kaynaklanabilir, diseksiyon sırasında OCT bileşiği içindeki kriyomold içindeki laringlerin yönelimindeki küçük farklılıklar veya numunelerin bölümleme sırasında kriyostat içindeki numune diskine nasıl yerleştirilmediği (yani, montajdan önce numune diskine yerleştirilen OCT bileşiği miktarı veya yerleştirme açısındaki küçük farklılıklar).
Numune hazırlamadaki bu küçük farklılıkların gırtlağı dokusu yer işaretlerinin derinliğinde önemli değişkenliğe yol açabileceğinin anlaşılmasıyla, acemi araştırmacıların çalışmak için bir referans haritasına sahip olması kritik öneme sahiptir. İlgi çekici kasları tanımlamak ve bu belgede özetlenenler gibi protokol tuzaklarını önlemek için yöntemler tanımlayan ana hatlarıyla belirlenmiş çalışma protokolleri, tekrarlanabilirliği artırabilir ve istenmeyen doku kaybını önleyebilir.
Bu çalışma TA kasına odaklansa da, bu metodoloji diğer içsel gırtlağı kasları için de geçerlidir. Örneğin, boyuna vokal katlama düzleminde kesitleme, alar, lateral TA, medial TA, lateral krikoarytenoid ve üstün krikoarytenoid kasların boyuna kas lifi bölümlerini ve arka krikoarytenoid kasların kesitlerini verir. Kesitsel vokal katlama düzleminde kesitler alar, lateral TA, medial TA, lateral cricoarytenoid, superior cricoarytenoid ve cricothyroid kaslarının kesitlerinin yanı sıra arka krikoarytenoid kaslarının boyuna bölümlerini verir. Ek olarak, bu çalışma dişi sıçanları içermemesine rağmen, laringeal dönüm noktası görünümünde erkek ve dişi sıçanlar arasındaki farklar beklenmemektedir, çünkü sıçan larinks içindeki cinsel dimorfizm kas spesifiktir ve laringeal çerçeve anatomisi ile ilgili değildir16,18.
Gırtlağım işaretleri arasındaki mesafenin değişkenliği, acemi araştırmacılar için sıçan vokal kıvrımını kriyoseksiyonunu zorlaştırabilir. Bu çalışma, sıçan gırtlakları nasıl dondurulduğu, gömdülmüş ve kriyoseksiyonlu olduğu tutarlılığına rağmen, gırtlağı simgesel yapılar arasındaki mesafenin büyük ölçüde değiştiğini göstermiştir; hayvan ağırlığı bu değişkenliği hesaba katmadı. Bu çalışma, laringeal kas dokusunun uygun şekilde nasıl hazırlanacağı ve sıçan vokal kıvrımının nöromüsküler histolojik incelemesi için laringeal yer işaretlerinin nasıl belirlenip tanımlanıp tanımlandırılmak üzere ilişkili görüntülerle ayrıntılı prosedürler sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü'nden F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) ve K23DC014517 (Johnson, PI) hibeleri ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. |
References
- Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), Pt 1 579-586 (2002).
- Suzuki, T., et al. Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).
- Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration. Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).
- Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context. Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).
- Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval. Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).
- Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats. Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).
- Ciucci, M. R., et al. Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats. Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).
- Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease. Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).
- Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats. American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).
- Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats. Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).
- Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function. Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).
- Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).
- McMullen, C. A., et al. Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).
- Lenell, C., Johnson, A. M. Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat. Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats. Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).
