Summary
Denne protokol bestemmer ligevægtsoptagelse, indtrængningsdybde og ikke-ligevægtsdiffusionshastighed for kationiske peptidbærere i brusk. Karakterisering af transportegenskaber er afgørende for at sikre en effektiv biologisk reaktion. Disse metoder kan anvendes til at designe en optimalt ladet stof bærere til målretning negativt ladede væv.
Abstract
Flere negativt ladede væv i kroppen, ligesom brusk, udgør en barriere for den målrettede lægemiddellevering på grund af deres høje tæthed af negativt ladede aggrecaner og kræver derfor forbedrede målretningsmetoder for at øge deres terapeutiske respons. Fordi brusk har en høj negativ fast opladning tæthed, narkotika kan ændres med positivt ladede stof luftfartsselskaber til at drage fordel af elektrostatiske interaktioner, giver mulighed for øget intra-brusk narkotika transport. Undersøgelse af transport af narkotika bærere er derfor afgørende for at forudsige effekten af narkotika i at fremkalde en biologisk reaktion. Vi viser udformningen af tre eksperimenter, som kan kvantificere ligevægt optagelse, dybde penetration og ikke-ligevægt diffusion sats af kationiske peptid luftfartsselskaber i brusk explants. Ligevægt optagelse eksperimenter giver et mål for den opløste koncentration i brusk i forhold til dens omgivende bad, som er nyttigt for at forudsige potentialet i et lægemiddel luftfartsselskab i at øge terapeutisk koncentration af lægemidler i brusk. Dybden af penetrationsundersøgelser ved hjælp af konfokal mikroskopi giver mulighed for visuel repræsentation af 1D-opløst diffusion fra den overfladiske til dybe zone af brusk, hvilket er vigtigt for vurderingen af, om opløselser når deres matrix og cellulære målsteder. Ikke-ligevægtsspiffusionsrate undersøgelser ved hjælp af et specialdesignet transportkammer gør det muligt at måle styrken af bindende interaktioner med vævsmatrixen ved at karakterisere diffusionsraterne for fluorescerende mærkede opløste stoffer på tværs af vævet; dette er gavnligt for at designe bærere af optimal bindingsstyrke med brusk. Tilsammen giver resultaterne fra de tre transporteksperimenter en retningslinje for design af optimalt ladede lægemiddelbærere, som udnytter svage og reversible afgiftsinteraktioner for anvendelser af lægemiddellevering. Disse eksperimentelle metoder kan også anvendes til at evaluere transport af narkotika og narkotika-narkotika luftfartsselskab konjugates. Yderligere, disse metoder kan tilpasses til brug i målretning andre negativt ladede væv såsom menisk, hornhinden og glasagtig humor.
Introduction
Drug-levering til negativt ladede væv i kroppen er fortsat en udfordring på grund af den manglende evne til lægemidler til at trænge dybt ind i vævet for at nå celle og matrix mål steder1. Flere af disse væv består af tætpakkede, negativt ladede aggrecaner, som skaber en høj negativ fast ladningstæthed (FCD)2 i vævet og fungerer som en barriere for levering af de fleste makromolekyler3,4. Men med bistand fra positivt ladede stof luftfartsselskaber, denne negativt ladede væv barriere kan faktisk omdannes til et lægemiddel depot via elektrostatiske afgift interaktioner for vedvarende lægemiddellevering1,,5,6,7( Figur1).
Figur 1: Opladningsbaseret intrabrusklevering af CPC'er. Intra-led injektion af CPC'er i knæleddet rummet. Elektrostatiske interaktioner mellem positivt ladede CPC'er og negativt ladede aggrecangrupper muliggør hurtig og fuld dybdeindtrængning gennem brusk. Dette tal er blevet ændret fra Vedadghavami et al4. Klik her for at se en større version af dette tal.
For nylig, kort længde kationiske peptid luftfartsselskaber (CPC) blev designet med det formål at skabe små kationiske domæner i stand til at bære større størrelse terapeutiske til levering til negativt ladede brusk4. For effektiv lægemiddellevering til brusk til behandling afudbredte 8,9 og degenerative sygdomme som slidgigt (OA) 10 , er detafgørende,at terapeutiske koncentrationer af lægemidler trænge dybt ind i vævet, hvor størstedelen af bruskceller (chondrocytter) ligger11. Selv om der er flere potentielle sygdom ændre lægemidler til rådighed, ingen har fået FDA godkendelse, fordi disse ikke er i stand til effektivt at målrette brusk12,,13. Derfor er det nødvendigt at evaluere transportegenskaberne for narkotikabærere for at forudsige lægemidlers effektivitet ved at fremkalde et terapeutisk respons. Her har vi designet tre separate eksperimenter, der kan udnyttes til at vurdere ligevægtsoptagelsen, penetrationsdybden og ikke-ligevægtsdiffusionshastigheden for CPC4.
For at sikre, at der er en tilstrækkelig lægemiddelkoncentration i brusken, som kan give et optimalt terapeutisk respons, blev optagelsesforsøg designet til at kvantificere ligevægts-CPC-koncentrationen i brusk4. I dette design, efter en ligevægt mellem brusk og dens omgivende bad, kan den samlede mængde af opløst inde i brusk (enten bundet til matrix eller gratis) bestemmes ved hjælp af en optagelse forhold. Dette forhold beregnes ved at normalisere koncentrationen af opløselighed inde i brusk til ligevægtsbadet. I princippet ville neutrale opløste stoffer, hvis diffusion gennem brusk ikke understøttes af afgiftsinteraktioner, have et optagelsesforhold på mindre end 1. Omvendt viser kationiske opløseligheder, hvis transport forstærkes via elektrostatiske interaktioner, et optagelsesforhold, der er større end 1. Som vist med CPC'er kan brugen af en optimal positiv ladning imidlertid resultere i meget højere optagelsesforhold (større end 300)4.
Selv om høj lægemiddelkoncentration i brusk er vigtigt for at opnå terapeutisk fordel, Er det også afgørende, at lægemidler diffuse gennem den fulde tykkelse af brusk. Derfor, undersøgelser, der viser dybden af penetration er nødvendig for at sikre, at narkotika nå dybt inde i brusk, således at matrix og cellulære mål websteder kan nås, hvilket giver en mere effektiv behandling. Dette eksperiment var designet til at vurdere envejsdiffusion af opløseligheder gennem brusk, der simulerer spredning af narkotika i brusk efter intra-artikulær injektion i vivo. Fluorescens billeddannelse ved hjælp af konfokal mikroskopi giver mulighed for evaluering af dybden af indtrængning i brusk. Net partikel afgift spiller en central rolle i modererende hvordan dybe lægemidler kan diffuse gennem matrix. En optimal nettoladning baseret på et væv FCD er nødvendig for at give mulighed for svag reversibel bindende interaktioner mellem kationiske partikler og anioniske væv matrix. Dette indebærer, at enhver interaktion er svag nok, så partikler kan adskille sig fra matrixen, men vendbar i naturen, så den kan binde sig til et andet matrixbindingssted dybere inde i vævet4. Omvendt kan overdreven positiv nettoladning af en partikel være skadelig over for diffusion, da for stærk matrixbinding forhindrer løsrivelse af partikler fra det oprindelige bindingssted i den overfladiske bruskzone. Dette ville resultere i en utilstrækkelig biologisk respons , da de fleste af målpladserne ligger dybt inde i vævet11.
For yderligere at kvantificere styrken af de bindende interaktioner, analyse af narkotika diffusion satser gennem brusk er fordelagtig. Ikke-ligevægtsdiffusionsundersøgelser giver mulighed for at sammenligne diffusionsrater i realtid mellem forskellige opløste stoffer. Som narkotika diffuse gennem de overfladiske, midterste og dybe zoner af brusk, tilstedeværelsen af bindende interaktioner kan i høj grad ændre diffusion satser. Når der er bindende interaktioner mellem lægemidler og bruskmatrixen, defineres det som den effektive diffusivitet (DEFF). I dette tilfælde, når alle bindingssteder er blevet besat, er udbredelsen af narkotika styret af steady-state diffusion (DSS). Sammenligning mellem DEFF af forskellige opløste bestemmer den relative bindende styrke af opløselige stoffer med matrix. For en given opløst, hvis DEFF og DSS er inden for samme størrelsesorden, indebærer det, at der er minimal binding til stede mellem lægemidlet og matrix under diffusion. Men hvis DEFF er større end DSS, findes der en betydelig binding af partikler til matrix.
De designede eksperimenter individuelt giver mulighed for karakterisering af opløst transport gennem brusk, men en holistisk analyse inklusive alle resultater er nødvendig for at designe en optimalt ladet stof luftfartsselskab. Den svage og reversibel karakter af ladning interaktioner styrer partikel diffusion sats og giver mulighed for høj ligevægt optagelse og hurtig fuld dybde penetration gennem brusk. Gennem ligevægt optagelse eksperimenter, bør vi kigge efter bærere, der viser høj optagelse som følge af afgift interaktioner, som kan verificeres ved hjælp af ikke-ligevægt diffusion sats undersøgelser. Disse bindende interaktioner bør dog være svage og reversible for at give mulighed for fuld tykkelsesindtrængning af opløstet gennem brusk. En ideel stof luftfartsselskab ville have en optimal ladning, som gør det muligt stærk nok bindende for optagelse og høj intra-brusk stof koncentrationer, men ikke for stærk til at hindre fuld tykkelse diffusion4. De præsenterede forsøg vil hjælpe med design karakteristika for charge-baserede væv rettet mod narkotika bærere. Disse protokoller blev brugt til at karakterisere CPC transport gennem brusk4, men disse kan også anvendes på en række lægemidler og narkotika luftfartsselskaber gennem brusk og andre negativt ladede væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Der blev opnået universitetsgodkendelser for at udføre forsøgene med døde væv. Kvægled blev erhvervet kommercielt fra et slagteri.
1. Brusk explant udvinding
- Ved hjælp af en skalpel (#10 klinge), skære og fjerne fedt, muskler, ledbånd, sener og alle andre bindevæv til at udsætte brusk fra femoropatellar rille af kvæg knæled.
- Brug 3 mm og 6 mm dermale slag, gøre vinkelrette slag i brusk til at udtrække cylindriske stik. Stik i individuelle brønde på en 48-brøndplade indeholdende 500 μL 1x fosfatbuffer (PBS) suppleret med 1% v/v antibiotikum-antimykotisk.
- Placer den overfladiske side af et bruskstik, der vender nedad, i en brønd i udskæringsarmaturen (Figur 2). Brug et barberblad, skær stikket langs overfladen af udskæringen stativ for at opnå en 1 mm tyk brusk explant, der er inklusive den overfladiske zone. Gentag for hver brusk stik.
- Lagre brusk explants individuelt i polypropylenrør, der indeholder 500 μL 1x PBS suppleret med proteasehæmmere (PBS-PI, 1 PI mini-tablet pr 50 ml 1x PBS) ved -20 °C.
- Før der udføres hvert af følgende transportforsøg, optøs de eksplanteholdige hætteglas i 30 min. i et 37 °C vandbad.
Figur 2: Specialdesignet udskæringsbeslag. Design parametre af rustfrit stål udskæring stativ, der anvendes til udskæring brusk explants af 3 og 6 mm diameter. Plast skær af varierende tykkelse blev placeret inde brønde til at justere tykkelsen af skiver explants. Rustfrit stål cylindriske pin af <1 mm diameter blev brugt til at skubbe explant ud af armaturet. Alle numeriske værdier præsenteres i mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Ligevægtsoptagelse af CPC'er i brusk
- Forsigtigt dab brusk explants (3 mm dia. X 1 mm tyk.) med en delikat opgave tørre at fjerne overskydende 1x PBS fra explant overflade. Ved hjælp af en balance, hurtigt registrere den våde vægt af hver explant og derefter straks sted i en 1x PBS bad for at forhindre dehydrering.
- Der tilberes 30 μM-opløsninger (300 μL pr. eksplante) af fluorescerende mærkede CPC'er i 1x PBS-PI. Brug RNase-fri polypropylenrør til rekonstitution.
- I en 96-brøndplade pipetterer 300 μL af hver 30 μM CPC-opløsning i separate brønde. Undgå at bruge brønde nær pladens kant for at forhindre fordampning. Ved hjælp af en spatel overføres hver flade til opløsningen, der indeholder brønde.
- Fyld de omkringliggende brønde med 300 μL 1x PBS og dæk brøndpladen med låg. Luk pladens kanter med fleksibel film for at minimere fordampning.
- Inde i en 37 °C inkubator, placere pladen på en plade shaker at begrænse partikel sedimentering. Inkuberes i 24 timer under skånsom omdrejning (50 omdr./min. med en bane på 15 mm) for at muliggøre ligevægtsoptagelse af CPC'er i brusken (figur 3).
- Generér en standardkurve for korrelation af fluorescens til CPC-koncentration
- Forbered serielle fortyndinger af CPC-opløsninger fra 30 μM – 0 μM (10 2 gange fortyndinger) i 1x PBS-PI i polypropylenrør. Sørg for, at der er mindst 500 μL af hver fortynding til stede.
- Der tilsættes 200 μL af hver fortynding til sammenhængende brønde i en sort 96-brøndplade. Duplikere i en anden række for at øge eksempelstørrelsen.
- Der udtages fluorescensaflæsninger af hver prøve ved hjælp af en pladelæser ved lysstofrørets ophidselse og emissionsbølgelængder ved hjælp af en pladelæser.
- Plot fluorescens læsning vs CPC koncentration og udlede en ligning for den lineære del af kurven.
BEMÆRK: For at begrænse variabiliteten ved fluorescensaflæsninger inkuberes CPC-lageropløsningen under samme betingelser som prøvepladen før generering af standardkurven.
- Efter 24 timers inkubation indsamles ligevægtsbadet fra hver brønd i separate polypropylenrør.
- 200 μL af hver opløsning overføres til separate brønde af en sort 96-brøndplade. Der udtages fluorescensaflæsninger af hver prøve under de samme lysstofrør som standardkurven. Om nødvendigt fortyndes prøven i 1x PBS-PI for at sikre, at aflæsningerne falder inden for den lineære del af standardkurven.
Figur 3: Skematiske ligevægtsoptagelsesforsøg. Brusk explants (3 mm dia. x 1 mm tyk) blev placeret i enkeltpersoner brønde i en 96-brønd plade, der indeholder fluorescerende mærket CPC løsning. Efter 24 timer blev CPC'er taget af brusken, hvilket reducerede fluorescensen i det omgivende bad. Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Dybden af CPC'ernes indtrængning i brusk
- Der tilberes 30 μM-opløsninger (300 μL pr. eksplante) af fluorescerende mærkede CPC'er i 1x PBS-PI. Brug RNase-fri polypropylenrør til rekonstitution.
- Ved hjælp af en skalpel, skåret brusk explants (6 mm diameter x 1 mm tykkelse) i halve for at gøre halv-diske. Hold den eksplante hydreret med et lag af 1x PBS-PI, mens der skæres.
- Lim en halv-disk explant i midten af en brønd af specialdesignede 1-dimensionelle transportkammer ved hjælp af en epoxy (Figur 4, Figur 5). Sørg for epoxy påføres den omkreds (buede) side af explant. Fjern overskydende lim fra brønden for at forhindre kontakt med diffusion overfladeareal af brusk og gøre et notat af den overfladiske side af explant.
- Der tilsættes 80 μL 1x PBS-PI på begge sider af explanten. Pipette væsken op og ned fra den ene side af explant at kontrollere for lækage til den anden side. Hvis der opstår lækage, skal du justere explant og anvende epoxy efter behov.
- 1x PBS-PI udskifts fra den side, der vender mod bruskens overfladiske overflade (opstrøms), med 80 μL 30 μM CPC-opløsning. Der skal være 80 μL 1x PBS-PI på den side, der vender mod den dybe bruskzone (nedstrøms).
- Anfør forsigtigt transportkammeret i en betrækbar beholder. Dæk bunden af beholderen med et lag 1x PBS for at undgå fordampning af opløsninger. Sørg for, at der ikke er direkte kontakt mellem opløsninger fra opstrøms- og nedstrømskamre.
- Anstænkningsbeholderen på en pladeshaker for at begrænse partikelsedimentering. Inkuberes i enten 4 eller 24 timer ved stuetemperatur under svag omdrejning (50 omdr./min. med en bane på 15 mm).
- Efter inkubation, fjerne explant fra kammeret og skære ~ 100 μm skive fra midten af explant.
BEMÆRK: Dette tværsnit er inklusive de overfladiske, midterste og dybe områder af brusk. - Placer skiven mellem et glas dias og en coverslip. Skær skiven fugtes med et lag på 1x PBS-PI.
- Ved 10x forstørrelse, billede gennem den fulde tykkelse af skiven for at opnå z-stak af fluorescerende billeder ved hjælp af en konfokal mikroskop.
- Brug ImageJ projekt den gennemsnitlige intensitet af billederne i z-stack til at bestemme dybden af penetration af CPC'er i brusk.
- Åbn billedstakken ved at klikke på Filer | Åbn.
- Klik på 'Billede' på proceslinjen, og klik på Billede | Stakke | Z Project fra rullemenuen.
- Inputudsnitnumre fra 1 til det sidste udsnit. Vælg 'Gennemsnitlig intensitet' under Projektionstype. Klik på'OK''
Figur 4: Specialdesignet 1D-transportkammer. Design parametre for PMMA 1D transportkammer med 6 individuelle brønde. Alle numeriske værdier præsenteres i mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Skematisk dybde af penetrationsundersøgelser. Brusk explants (6 mm diameter x 1 mm tykkelse) blev skåret i halve og fastgjort til midten af 1-D diffusive transport brønde. Fluorescerende mærket CPC løsning blev tilføjet til siden af brønden i kontakt med den overfladiske zone (SZ) af brusk. 1x PBS-PI blev tilføjet til siden af brønden i kontakt med den dybe zone (DZ) af brusk. Efter diffusionen blev et tværsnit af brusk (3 mm x 1 mm) afbildet ved hjælp af konfokal mikroskopi. Dette tal er blevet ændret fra Vedadghavami et al.4 og Bajpayee et al.3Klik her for at se en større version af dette tal.
4. Ikke-ligevægtsspiffusionshastighed for CPC'er i brusk
- Bring de to halvdele af det specialdesignede transportkammer (Figur 6) sammen for at samle og lukke kammeret. Brug skiver, møtrikker og bolte til tæt at lukke kammeret med en skruenøgle.
BEMÆRK: Transportkammeret skal være gennemsigtigt, så det ikke forstyrrer lysstofrørdelæsningerne. De transportkamre, der anvendes i denne protokol, er fremstillet af polymethylmethacrylat (PMMA). - Kammerets indre rum belægges med 0,5 % m/v fedtfri mælkeopløsning i 1x PBS (2 ml for hvert kammer) i 15 minutter for at forhindre, at CPC'er ikke er specifikke til kammervægge. Skyl derefter kammeret med 1x PBS (2 ml for hvert kammer).
- Brug det specialdesignede skærebeslag (Figur 2) og et barberblad, skær en 6 mm diameter brusk explant (tværplan) til en tykkelse på 500-800 μm, inklusive den overfladiske zone. Hold den eksplante hydreret med 1x PBS.
- Ved hjælp af hammerdrevne og dermale slag, skabe pakninger fra gummiplader som vist i figur 7.
- Saml hver halvdel transport kammer til at omfatte 1 stor gummipakning, 1 PMMA indsats og 1 lille gummipakning hver. Placer explant i brøndene i plastindsatsen, med den overfladiske zone mod opstrømskammeret. Sandwich de to halvdele sammen for at fuldføre samlingen og skrue stramt ved hjælp af en skruenøgle(Figur 7).
- Fyld opstrømskammeret med 2 ml 1x PBS-PI og overhold nedstrømskammeret for udsivning af væske fra opstrømskammeret. Hvis der er lækage, skal kammeret samles igen, pakningspositionen og skruernes tæthed. Hvis der ikke lækker lækage, skal du også fylde nedstrømskammeret med 2 ml 1x PBS-PI.
- Tilføj en mini-røre bar til både op og nedstrøms kamre og placere kammeret på en røre plade. Juster kammeret, så laser fra spektrofotometeret er fokuseret mod midten af nedstrømskammeret. Anvend signalmodtagerdelen af spektrofotometeret bag nedstrømskammeret (Figur 8).
BEMÆRK: Spektrofotometerets laser og modtager skal være udstyret med passende filtre til at ophidse, udsende og sende signaler fra det fluorescerende mærkede protein. Beskyt transportkammeret mod lys ved hjælp af en sort boks under forsøg for at undgå interferens i fluorescenssignal. Det er bedste praksis at forsegle åbningerne oven på kammeret med fleksibel film for at undgå fordampning. - Opsaml nedstrømsfluorescensemissionsaflæsninger i realtid, og sørg for et stabilt signal i mindst 5 min.
BEMÆRK: Aliquots fra nedstrømskammeret kan opnås og vurderes for fluorescens ved hjælp af en pladelæser, hvis et specialdesignet spektrofotometer eller gennemsigtigt transportkammer ikke er tilgængeligt. - Pipette en forudberegnet volumen af lageropløsning af fluorescerende mærkede CPC'er ind i opstrømskammeret for at sikre en endelig koncentration på 3 μM inde i opstrømskammeret. Overhold downstream fluorescenssignalet, og gør det muligt for opløst transport at nå en støt stigning i hældningen.
BEMÆRK: En tykkere brusk explant vil kræve længere tid at nå steady-state. - Når steady state er nået, skal du tage 20 μL fra opstrømskammeret og tilsættes nedstrømskammeret ("spiketest").
BEMÆRK: Der observeres en stigning i den nedstrøms fluorescens. Dette vil gøre det muligt at korrelere fluorescensaflæsninger og CPC-koncentration. - Indsamle real-time downstream fluorescens aflæsninger.
Figur 6: Specialdesignet transportkammer, der ikke er ligevægtsformørd. Designparametre for PMMA ikke-ligevægtsdiffusionstransportkammer. Kammeret skal være gennemskinneligt, så det ikke forstyrrer fluorescensaflæsningerne. Det komplette transportkammer bestod af to identiske halvdele af armaturet vist. To cylindriske ben i rustfrit stål (~2,94 mm diameter, ~18 mm lang) var nødvendige for at sikre justering og fuldstændig lukning af halvdele af kammeret. Fire identiske slots til 6-32 gevindskruer blev lavet i hvert hjørne af kammeret til skruetæt samling. Alle numeriske værdier præsenteres i millimeter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Samling af transportkammer, der ikke er ligevægt. Designparametre for (A) sorte PMMA-skær og (B) store og små gummipakninger. Tykkelsen af gummipakninger blev justeret for at sikre tæt lukning af kammeret. Alle numeriske værdier præsenteres i mm. ( C )Skematisk,der viser rækkefølgen af samling for to halvdele af transportkammeret med brusk explant placeret i midten. SZ angiver overfladisk zone af brusk, som stod over for opstrøms kammer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Skematiske forsøg med ikke-ligevægtsdiffusion. Brusk explants (6 mm diameter x 1 mm tykkelse) blev placeret i midten af transportkammeret med den overfladiske overflade vender opstrøms kammer. Både op og nedstrøms sider af kammeret var fyldt med 1x PBS-PI og blandet ved hjælp af en mini røre bar. Med en laser pegede mod nedstrøms kammer til at indsamle fluorescerende aflæsninger, fluorescerende mærkede CPC løsning blev tilføjet til opstrøms kammer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter ligevægtabsorption af CPC'er ved brusk falder badets fluorescens, når opløsten er blevet taget af vævet. Men hvis fluorescensværdien af det endelige bad forbliver magen til den oprindelige, indikerer det, at der ikke er nogen / minimal opløst optagelse. En anden bekræftelse af opløst optagelse er, hvis vævet synligt har ændret farve til farven på fluorescerende farvestof. Den kvantitative optagelse af opløseligheder i brusk blev bestemt ved hjælp af optagelsesforholdet (RU), efter at fluorescensværdierne blev konverteret til koncentration ved hjælp af standardkurven. Ved hjælp af den indledende badkoncentration (CBath,i) ogkoncentration af ligevægtsbade (C-bad) blev den opløste koncentration inde i brusk (CBrusk)beregnet på følgende måde, hvor VBad=300 μL:Bath
Ved hjælp af CBrusk og CBath, optagelsen forholdet blev bestemt ved hjælp af ligningen nedenfor.
Værdier >>1 angiver forbedret optagelse på grund af opladningsinteraktioner, mens værdier <1 angiver lav optagelse. For eksempel har større, neutrale opløseligheder som Neutravidin (60 kDa, pI 7) vist RU<1 på grund af sterisk hinderance med bruskmatrixen1, mens mindre, neutrale opløste stoffer forventes at vise RU~ 1, da de er i stand til at sprede sig ind i brusk, nå ligevægt. I modsætning hertil har Avidin (pI 10.5), neutravidins positivt ladede modstykke, vist en RU~180 i brusk1. Desuden viser små CPC'er (~2,5-4 kDa) en RU på op til 4004. Som det fremgår af figur 9, viste optagelsesprocenterne et afgiftsafhængigt respons4.
Figur 9: Repræsentative resultater af ligevægtsoptagelsen af CPC'er i brusk. CPC'er med varierende nettoafgift (+8, +14 og +20) og deres respektive optagelsesforhold i brusk viste, at optagelsen ikke stiger monotont med stigende ladning. Dette tal er blevet ændret fra Vedadghavami et al.4Klik her for at se en større version af dette tal.
I tilfælde af fluorescens af badet er steget efter at have nået ligevægt, dette tyder på, at den oprindelige bad koncentration af fluorescently mærkede opløst var for høj. Dette ville medføre, at emissionen blev fanget i opløsningen efter excitation via pladelæser. For at løse dette problem, sænke den oprindelige bad koncentration.
Efter konfokal billeddannelse blev der produceret en stak billeder, hvor hvert billede viste dybden af fluorescerende mærkede CPC'er på forskellige lag af brusk. Billedet fra midten af brusk explant viste den fjerneste dybde af penetration i forhold til ethvert andet billede i hele tykkelsen af explant. Ved hjælp af en software som ImageJ, stakken af billeder blev overlejret til at producere et billede, der viser den gennemsnitlige intensitet CPC penetration. Disse overlejrede billeder gav den bedste sammenligning af den samlede dybde af penetration mellem forskelligt ladede stof luftfartsselskaber. Der blev observeret et afgiftsafhængigt respons for CPC'er i vævet (figur 10). Store neutralt ladede luftfartsselskaber (f.eks Neutravidin) vil ikke trænge meget længere end den overfladiske zone, da de mangler evnen til at bruge afgift interaktioner til at fremkalde binding med matrix1. Tilsvarende vil en for høj positiv ladning være begrænset til den overfladiske zone (som det fremgår af CPC+20 selv efter 24 timer)4, men dette skyldes, at luftfartsselskabet er bundet for stærkt til matrixen; de ikke er i stand til at fjernebind fra deres oprindelige mål. En optimalt ladet stof luftfartsselskab ville dog være i stand til at trænge igennem til de dybe zoner af brusk, da det kan drage fordel af den svage og reversibel karakter af elektrostatiske interaktioner (som det fremgår af CPC + 14)4. Dette giver mulighed for luftfartsselskabet til at binde sig til sit oprindelige mål, unbind at bevæge sig dybere gennem matrix, og derefter binde igen til mål længere inde i vævet. For eksempel, Avidin (~ 7 nm diameter, 66 kDa, pI 10,5) binding med negativt ladede matrix glycosaminoglycans (GAGs) har en dissociation konstant (KD)på 150 μM, som blev anset for at være svag nok til at gøre det muligt for reversible bindende er nødvendige for fuld tykkelse penetration1. På trods af den svage binding udviste Avidin høj fastholdelse og optagelse i brusk på grund af tilstedeværelsen af en høj tæthed af negativt ladede GAGs (Bindingstæthed NT = 2900 μM)1. Yderligere, som det fremgår af CPC +8, fuld tykkelse penetration var synlig inden for 4 timer, mens CPC + 14 kræves 24 h for at nå fuld dybde4. Således bør flere tidspunkter vælges til effektivt at sammenligne sats af forskellige opløseligheder ved gennemtrængende vævtykkelse. For en mere kvantitativ forståelse af dybden af penetration, de relative intensiteter af opløselige stoffer langs tykkelsen af væv kan opnås ved hjælp af ImageJ.
Figur 10: Repræsentative resultater fra dybden af penetrationsundersøgelser i brusk. CPC'er med varierende nettoafgift (+8, +14 og +20) og deres respektive indtrængningsdybde gennem brusk afslørede en svag reversibel binding som set af CPC+8 og CPC+14 er nøglen til fuld dybdeindtrængning. Men for stærk binding som set for CPC +20 hæmmet fuld tykkelse penetration. Dette tal er blevet ændret fra Vedadghavami et al.4Klik her for at se en større version af dette tal.
Hvis der ikke er observeret noget fluorescerende signal inde i brusken under billeddannelse, kan der være to problemer til stede. enten blev overfladearealet for diffusion blokeret af epoxyen, eller den oprindelige badkoncentration var for lav til at frembringe et fluorescerende signal. For at løse disse problemer, fjerne overskydende epoxy fra brusk overflader og øge opløst koncentration.
Forsøg med transport uden for ligevægt resulterede i en kurve som vist i figur 11. Den første del af kurven repræsenterer opløst diffusion gennem brusk som opløst-matrix bindende interaktioner finder sted. Med øget opladning af luftfartsselskabet, stærkere matrix binding opstod, hvilket vil resultere i en længere tid for opløselige at nå nedstrøms kammer. Når opløselige trængte gennem dybden af brusk og nåede nedstrøms kammer, en stigning i hældningen af kurven blev observeret som fluorescens læsning steget over tid. Denne anden del af kurven nåede en stabil hældning, der repræsenterer steady-state diffusion. En tangential linje blev trukket på steady-state hældning for at bestemme den tid, det tager at nå steady-state diffusion (τLag), præget af x-skæringspunkt. Den effektive diffusivitet (DEFF),diffusionshastigheden af CPC'er, mens der er bindende interaktioner i brusk, blev beregnet ved hjælp af τLag og explant tykkelse (L) som følger:
Efter overførsel af 20 μL opløsning fra opstrøms til nedstrømskammer blev der observeret en stigning i fluorescens. den deraf følgende stabiliserede fluorescensintensitet blev anvendt til korrelation med koncentrationen. Koncentrationen af CPC'er i nedstrøms (CD)normaliseret til upstream-koncentrationen (CU) blev derefter afbildet mod tiden. Hældningen af denne kurve blev anvendt til at anslå steady-state diffusionshastigheden, når alle bindingssteder i brusk er optaget (DSS)som vist nedenfor. Denne værdi var inklusive fordelingskoefficienten. Her repræsenterer φ, VD og A brusk porøsitet (~0,8), nedstrøms kammervolumen (2 ml) og tværsnitsareal af brusk (0,1257 cm2), hhv. Repræsentative DEFF- og D SS-værdier beregnet ud fra ikke-ligevægtstransportforsøg for CPC 'er findes i tabel 1.
Figur 11: Repræsentative resultater fra ikke-ligevægtsdiffusionsundersøgelser gennem brusk. CPC+8 diffusionskurve, afbildet som downstream-koncentrationen (CD)normaliseredes til upstreamkoncentrationen (CU) mod tiden. En tangential line trukket ved steady-state hældningen (blå) krydser x-aksen ved τLag, som blev brugt til at beregne DEFF. Tangentens hældning blev brugt til at beregne DSS. Spiketesten (grå) repræsenterer den stabiliserede koncentration i nedstrømskammeret efter overførsel af 20 μL CPC-opløsning fra opstrøms til nedstrøms, der anvendes til normalisering af downstream-koncentration. Dette tal er blevet ændret fra Vedadghavami et al.4Klik her for at se en større version af dette tal.
Hvis den nedstrøms fluorescens ikke stabiliseres før tilsætning af fluorescerende mærket peptid til opstrømskammeret, er det sandsynligt, at der er opløste rester fast på væggene fra et tidligere eksperiment. I dette tilfælde adskille kammeret og vaskes med sæbe og sonikere. Hvis der er en stigning i nedstrøms fluorescens umiddelbart efter tilsætning af fluorescerende mærkede peptid til opstrømskammeret, dette kunne indikere, at lækage er til stede. Dette ville kræve genmontering af transportkammeret og re-test for lækager. Hvis downstream fluorescens signalet når et plateau i modsætning til en steady-state stigning, det indikerer et muligt tab af koncentration i opstrøms kammer, sandsynligvis forårsaget af opløseligheder stikning til væggene i kammeret. Tilsætning af 0,005% w/ v kvæg serum albumin (BSA) til opstrøms kammer kan hjælpe med at forhindre stikning.
| Cpc | DEFF (cm2/s) | DSS (cm2/s) |
| CPC+8 | 1,7 ± 0,4 x 10-7 | 5,8 ± 0,0 x 10-5 |
| CPC+14 | 9,8 ± 0,2 x 10-8 | 2,6 ± 1,2 x 10-5 |
| CPC+20 | 4,7 ± 0,1 x 10-8 | 1,4 ± 0,9 x 10-5 |
Tabel 1: Repræsentative DEFF- og DSS-værdier for CPC-transport gennem brusk. Denne tabel er blevet ændret fra Vedadghavami et al.4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder og protokoller, der er beskrevet her, er vigtige for området målrettet lægemiddellevering til negativt ladede væv. På grund af den høje tæthed af negativt ladede aggrecans til stede i disse væv, en barriere er skabt, hvilket forhindrer lægemidler i at nå deres cellulære mål websteder, der ligger dybt inde i matrix. For at løse denne udestående udfordring kan narkotika ændres til at omfatte positivt ladede narkotikabærere, som kan øge transportraten, optagelsen og bindingen af lægemidler ivæv 1,3,4,14,15,16,17,18,19. Som vist her med de udviklede metoder, transport af positivt ladede stof bærere kan karakteriseres til at bestemme ligevægt optagelse, dybde penetration og ikke-ligevægt diffusion sats. Vi har med succes designet tre separate eksperimentelle opsætninger, som kan udnyttes til vurdering af transporten gennem brusk explants.
For en vellykket karakterisering af transport, kritiske skridt i proceduren skal følges. Brugen af proteasehæmmere (PI) i alle opløsninger er afgørende for præcist at karakterisere intrabrusk transport af CPC'er gennem brusk, da de fungerer for at forhindre enzymatisk fordøjelse af proteiner i væv20. Derfor, hvis det ikke anvendes, brusk matrix komponenter såsom aggrecans og kollagen kan begynde at nedbrydes og udskilles i det omgivende bad under eksperimenter. Dette kan i høj grad sænke FCD af brusk, hvilket reducerer antallet af afgiftsbaserede bindingssteder i bruskmatrixen. Den resulterende væv ville ikke længere være repræsentativ for sund brusk. Omvendt kan de fremlagte eksperimenter også bruges til at evaluere transporten af CPC'er gennem gigtbrusk, hvor aggrecanindholdet er meget lavere som det ses i OA20. Brug trypsin eller Chondroitinase ABC at fordøje brusk explants, den aggrecan tæthed kan kontrolleres, hvilket giver mulighed for evaluering af transport og narkotika levering i en syg tilstand. I dette tilfælde kan afgiftsbaseret binding blive kompromitteret, mens andre typer interaktioner såsom brintbindinger og hydrofobiske interaktioner synergistisk øger bindingen og retentionen inden forbrusk 4.
Opretholdelse hydrering af brusk explant er nøglen under prøve forberedelse og eksperimenter. Dehydrering via udsættelse for luft i mere end 6 minutter har vist sig at fremkalde uoprettelige skader på ledbrusk21. Som følge heraf kan der forekomme uventede ændringer i transporten af CPC'er. Tilsvarende kan fordampning af CPC bade resultere i explant dehydrering; dette kan forhindres ved at forsegle med en fleksibel film. Men, bad fordampning kan ikke kun forårsage explant dehydrering, men det kan også forårsage en ændring i CPC bad koncentration, resulterer i falske fluorescerende aflæsninger. Endvidere er det vigtigt at bemærke, at dybden af penetrationsundersøgelser kræver tynde tværsnit (~ 100 μM) af brusk, der skal afbildes. Dette er en teknik, der kræver praksis, således at skiver af ensartet tykkelse kan opnås. Det er også afgørende for ikke-ligevægtsdiffusionsforsøg, at transportkammeret er gennemsigtigt, således at der kan opnås lysstofrørsmålinger i realtid med det specialdesignede spektrofotometer. Som alternativ kan der dog opnås og vurderes for fluorescens ved hjælp af en pladelæser eller anden spektrofotometrisk læser.
De metoder, der præsenteres her, er af stor betydning, da de giver en bænk-skala metode til at karakterisere narkotika luftfartsselskab transport gennem brusk for bedre at forudsige in vivo opbevaring af narkotika og langsigtet biologisk effekt. For nylig blev der implementeret en finite elementramme for beregningsvæskedynamik til måling af opløst transport via porøse medier22. Arbabi et al. har anvendt finite elementanalyse i kombination med eksperimentelle data fra mikro-CT-billeddannelse til måling af diffusionsrater for negativt ladede kontrastmiddel, ioxaglat i brusk23,24. Ved hjælp af en multizone, multifasisk model blev diffusionskoefficienterne for ioxaglat i forskellige bruskzoner desuden målt sammen med FCD for hver zone. Mens mikro-CT imaging kun kan bruges med kontrastmidler, vores eksperimentelle setup giver mulighed for karakterisering af transport af alle lægemidler og narkotika luftfartsselskaber, der kan fluorescerende mærket. Men den avancerede beregningsmodellering, der anvendes af Arbabi et al. giver en mere omfattende analyse af opløst transport adfærd og kan anvendes på vores eksperimentellemetoder 13,24.
En begrænsning af den præsenterede metode er, at den eksperimentelle opsætning for hvert opløst transporteksperiment ikke fuldt ud omfatter in vivo-miljøet. Biologiske reaktioner og mekaniske og dynamiske kræfter, der opstår i den naturlige fælles er ikke simuleret her. For at indarbejde disse kræfter kan transportkammeret ændres med et stempel for at simulere konvektive strømningsmønstre, der opstår under aktiviteter som gang og løb. Men, mens konvektive flow kan øge optagelsen med 2 gange, optagelse på grund af elektrostatiske interaktioner kan øge 100-400x. De eksperimentelle opsætninger, der præsenteres her, giver således et godt skøn over afgiftsbaseret transport og optagelse25. Yderligere, da knæleddet naturligt indeholder synovialvæske, kan det bruges i badet løsninger til transport eksperimenter i stedet for 1x PBS-PI. Det anslås, at optagelsen af kationiske bærere i brusk ville falde i synovialvæske sammenlignet med i 1x PBS på grund af tilstedeværelsen af hyaluronankæder med negativt ladede carboxylgrupper i synovialvæske. Det er muligt, at kationiske bærere konkurrencedygtige binde med hyaluronan kæder af synovialvæsken ud over GAGs af brusk. Men tætheden af negativt ladede grupper er betydeligt højere i brusk sammenlignet med synovialvæske, på grund af tilstedeværelsen af både negativt ladede carboxylated hyaluronan kæder og sulfated GAGs i brusk15. Således, selv om optagelsen i brusk i nærvær af synovialvæske vil være lavere end i 1x PBS, er det stadig forventes at opretholde en høj intra-brusk optagelse. In vivo, Avidin har vist høj intra-brusk optagelse i både rotte og kanin brusk i nærvær af synovialvæske16,26. Yderligere, Avidin har vist høj optagelse og fastholdelse i brusk op til 2 uger efter intra-artikulær injektion i en kanin forreste korsbånd transsektion model27.
Anvendelse af brusk af kvæg i dette system giver mulighed for en mere nøjagtig repræsentation af lægemiddelindtrængning gennem brusk på grund af dets ligheder med menneskelig brusk med hensyn til tykkelse (~1,5-2 mm)28,29. Transport af opløselige stoffer gennem brusk kan variere med tykkelse; lægemiddelbærere kan kræve færre bindende interaktioner til fuldt ud at trænge gennem mus eller rotte brusk, som er meget tyndere, dog kan i væsentlig grad hindres i at trænge dybere i tykkere menneskelige brusk1. Yderligere, selv om disse eksperimenter var designet til at karakterisere opløst transport inden for brusk, disse metoder kan ændres og anvendes på andre negativt ladede væv såsom menisk, hornhinde og glaslegeme humor i øjet, og kernen pulposus af intervertebrale diske. De metoder til eksperimenter designet her er fordelagtige, da dimensionerne af inventar og transportkamre kan tilpasses efter størrelse og arter af væv. Virkningen af disse metoder er udbredt, begrænset ikke kun til narkotikabærere, men også til evaluering af transport af narkotika og narkotikabærerkonjugater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af det amerikanske forsvarsministerium gennem Congressionally Directed Medical Research Programs (CDMRP) under kontrakt W81XWH-17-1-0085, og National Institute of Health R03 EB025903-1. AV blev finansieret af College of Engineering Dean's Fellowship på Northeastern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 Stainless Steel SAE Washer | McMaster-Carr | 91950A044 | For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD |
| 96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | Black |
| Acrylic Thick Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | 100x |
| Bovine Cartilage | Research 87 | N/A | 2-3 weeks old, femoropatellar groove |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
| CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Custom designed peptide |
| CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Custom designed peptide |
| CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Custom designed peptide |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Dermal Punch | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 and 6 mm |
| Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning Costar | 3595 | Clear, 96 well |
| Flexible Wrapping Film | Bemis Parafilm M Laboratory | 1337412 | |
| Gold Seal Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 6378701 | # 1.5, 18x18 mm |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2" Diameter |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4" Diameter |
| Laser | Chroma Technology | AT480/30m | Spectrophotometer Laser Light |
| Low-Strength Steel Hex Nut | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Thread size |
| LSM 700 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 700 | |
| Micro Magnetic Stirring Bars | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7x2 mm |
| Multipurpose Neoprene Rubber Sheet | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32" Thickness |
| Non-Fat Dried Bovine Milk | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | 150 mm diameter |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CMR | 1x |
| Plate Shaker | VWR | 89032-088 | |
| Protease Inhibitors | Thermo Scientific | A32953 | |
| Razor Blades | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | Black transport chamber inserts |
| RTV Silicone | Loctite | 234323 | Epoxy, Non-corrosive, clear |
| Scalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 blades |
| Signal Receiver | Chroma Technology | ET515lp | Spectrophotometer Laser Signal Receiver |
| Snap-Cap Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22363204 | 1.5 mL |
| Spatula | TedPella | 13508 | |
| Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
| Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Thread size, 1" Long |
References
- Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help. Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).
- Maroudas, A. Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules. Journal of Anatomy. 122, Pt 2 335-347 (1976).
- Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis. Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).
- Vedadghavami, A., et al. Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues. Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).
- Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., Önnerfjord, P., Bajpayee, A. G. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture. Arthritis Research & Therapy. 21 (1), 238 (2019).
- Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins. Nano Today. 34, 100898 (2020).
- Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics. Bioelectricity. , (2020).
- Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
- Martel-Pelletier, J. Pathophysiology of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Chevalier, X., et al. Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study. Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).
- Cohen, S. B., et al. A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee. Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125 (2011).
- Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. Progress in intra-articular therapy. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).
- He, T., et al. Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs. Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).
- Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).
- Zhang, C., et al. Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery. MethodsX. , 100882 (2020).
- Wagner, E. K., et al. Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention. Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).
- Troeberg, L., Nagase, H. Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).
- Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage. Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).
- Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Solute transport across a contact interface in deformable porous media. Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage. Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).
- Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate. Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).
- Bajpayee, A. G., et al. Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis. European Cells & Materials. 34, 341-364 (2017).
- Malda, J., et al. Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass. PLoS One. 8 (2), 57683 (2013).
- Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee. Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).
