Klamidya Trachomatis'te Gelişimsel Mutantları Tanımlamak ve Izole Etmek Için Canlı Hücre İleri Genetik Yaklaşım

Summary

Bu protokol, Klamidya trachomatisgelişimsel mutantları tanımlamak ve izole etmek için yönlendirilmiş ileri genetik yaklaşımda floresan organizatör-muhabirler, canlı hücre mikroskobu ve bireysel dahil çıkarma kullanır.

Abstract

Hücre içi bakteriyel patojen Klamidya trachomatis iki morfolojik ayrık gelişim formundan oluşan bir gelişim döngüsünden geçer. Replikatif olmayan temel cisim (EB) konaklayıcının enfeksiyonunu başlatır. Bir kez içinde, EB reticulate vücut (RB) içine ayırt eder. RB daha sonra bulaşıcı EB formuna geri ayırt etmeden önce, çoğaltma birden fazla tur uğrar. Hücre türleri arasında geçiş başarısızlığı ya ana konak işgali veya çoğaltma önler gibi bu döngü klamydial sağkalım için gereklidir.

Klamidya'nın zorunlu hücre içi doğasınedeniyle genetik tekniklerde sınırlamalar hücre tipi gelişiminde rol oynayan moleküler mekanizmaların tanımlanmasını engellemiştir. Canlı hücre mikroskobu ile birlikte hücre tipi anahtarlamanın gerçek zamanlı olarak görüntülenmesine olanak tanıyan yeni bir çift promotör-muhabir plazmid sistemi tasarladık. Hücre tipi gelişimin düzenlenmesinde yer alan genleri belirlemek için, canlı hücre promotör-muhabir sistemi, çift muhabir in kimyasal mutagenezi birleştirerek ileri genetik bir yaklaşım geliştirilmesi için kaldıraçlı, görüntüleme ve altered gelişimsel kinetik ile Klamidya izleme, mutantların klonal izolasyon izledi. Bu ileri genetik iş akışı genetik yollar geniş bir yelpazede içine yönlendirilmiş sorgulama için değiştirilebilir esnek bir araçtır.

Introduction

Klamidya trachomatis (Ctr) onun hayatta kalma ve proliferasyon için gerekli olan bir bifhasik gelişim döngüsü ile ilerler zorunlu bir hücre içi^patojen1. Bu döngü iki gelişimsel formdan oluşur: temel gövde (EB) ve retikülat gövdesi (RB). EB çoğaltma yetersiz ama etkili veya indüklenen endocytosis²ile hücre invazyonu aracılık . Bir kez ana bilgisayarda, EB çoğaltıcı RB olgunlaşır. RB, sonraki enfeksiyon turlarını başlatmak için EB'ye geri dönmeden önce birden fazla çoğaltma turu yapar.

Genetik araçların sınırlı dizi biyokimyasal çalışmalar veya vekil sistemlerin kullanımı için klamydial araştırma çoğu kısıtlamıştır. Sonuç olarak, gen regülasyonu ve gelişim döngüsünün kontrolü açıklaması zor olmuştur^3,4. Klamydial alanında daha önemli sorunlardan biri klamydial gelişim döngüsünün yüksek çözünürlüklü zamansal izleme ve onun düzenlenmesinde yer proteinlerin belirlenmesidir. Klamydial gelişim döngüsü sırasında gen ekspresyonu geleneksel RNAseq, qPCR ve sabit hücre mikroskobu⁵dahil yıkıcı "bitiş noktası" yöntemleri ile yapılmıştır 5^,6. Bu yöntemler paha biçilmez bilgiler sağlasa da, kullanılan teknikler zahmetli dir ve düşük zamansal çözünürlüğe^{sahiptir 5,6}.

Son on yıl içinde, Ctr genetik manipülasyon plazmid dönüşüm ve mutagenesis^,7,8,9için yöntemlerin giriş ile ilerlemiştir. Bu çalışma için, plazmid tabanlı bir sistem bir enfeksiyon boyunca gerçek zamanlı olarak bireysel inklütal gelişimi izlemek için geliştirilmiştir. Bir chlamydial transformant hem bir RB ve EB hücre tipi özel organizatör-muhabir ifade oluşturuldu. RB özel muhabiri floresan protein Yonca erken RB gen euo upstream organizatörü eriterek inşa edilmiştir. EUO geç EB ilişkili genlerin bir alt kümesi bastırır transkripsiyondüzenleyici¹⁰. HCTBorganizatörü , EB nükleoid yoğuşması dahil bir histon benzeri protein kodlar, doğrudan mKate2 (RFP) upstream EB özel muhabir oluşturmak için klonlandı¹¹. hctBprom-mKate2/euoprom-Clover için omurga p2TK2SW2⁷oldu. HctB ve euo organizatörleri Ctr-L2 genomik DNA'sından güçlendirilmiştir. Her organizatör dizisi belirtilen klamydial gen artı ilgili ORF ilk 30 nükleotit (10 amino asit) için öngörülen transkripsiyon başlangıç alanının yukarı ~ 100 baz çiftleri oluşuyordu. Floresan FP varyantları ticari olarak Ctr kodonu optimize gen blokları olarak elde edildi ve her bir klamydial gen ve promotör ilk 30 nükleotit ile çerçeve içinde klonlanmış. IncD terminatör doğrudan mKate2 aşağı klonlanmış oldu. İkinci organizatör-muhabir incD terminatör aşağı yerleştirildi. P2TK2SW2'deki ampisilin direnç geni(bla)pBam4'ten aadA geni (Spectinomycin direnci) ile değiştirildi. Bu son yapı p2TK2 sonuçlandı-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Şekil 1A) Ctr-L2⁷dönüştürülmüştür . Bu RB/EB muhabiri, canlı hücre mikroskopisi kullanılarak tek dahil ler içinde gelişim döngüsünün gözlemlemesine olanak sağlar (Şekil 1B,C).

Organizatör-muhabir yapımımızı kimyasal mutagenez ile birlikte kullanan bir protokol, Ctr serovar L2'nin mutajenleşmiş popülasyonlarından gelişimsel anormallikler sergileyen bireysel klonları izlemek ve izole etmek için bir protokol geliştirildi. Bu protokol, tek tek klamydial inklüetlerin doğrudan izlenmesine, zaman içinde gen ekspresyonunun izlenmesine, değişmiş bir gelişimsel gen ekspresyonu deseni ifade eden klamyal klonların tanımlanmasına ve Klamidya'nın tek tek içermelerden klonal izolasyonuna olanak sağlar.

Bu protokol özellikle klamydial gelişime dahil olan genlerin tanımlanması için oluşturulmuş olsa da, herhangi bir sayıda kimydial genetik yolu sorgulamak için kolayca uyarlanabilir.

Protocol

Bu protokolde kullanılan tüm Python komut dosyaları Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing

1. Mutagenize Muhabiri Klamidya

NOT: Ctr-L2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EB'ler, eksenik ortam CIP-1'de etil metansülfonat (EMS) kullanılarak doğrudan mutajenleştirildi, çünkü bu ortam EB enfektivitesinin bakımını ve bakımını destekler¹².

1. P2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover reporter plazmid ve pelet ile dönüştürülmüş ~3 x 10⁷ EB içeren buz üzerinde bir chlamydial stokunu 4 °C'de 30 dakika boyunca 30 dakika boyunca 14.000 x g olarak eritin.
   NOT: Bu deneylerde kullanılan klamidya organizmaları 1x sakaroz-fosfat-glutamat tamponunda (SPG) -80 °C'de %30 renografin yoğunluğu saflaştırılmış ve dondurulmuştur.
2. Supernatant atın ve 10 s için% 10 güç buz üzerinde sonication ile CIP-1 tampon 100 μL EB pelet yeniden askıya. 100 μL'lik EB süspansiyonunu mutajenize edilmiş ve sahte işlenmiş numuneler için iki 50 μL'lik aliquots'a bölün.
3. Ayrı bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüp içinde 20 mg/mL EMS-CIP-1 çözeltisi hazırlayın. Bunu yapmak için, 375 μL toplam hacim de 6.8 μL EMS ekleyin.
4. EMS-CIP-1 çözeltisinin 50 μL'sini mutagenez için klamydial aliquotlardan birine ve 50 μL'lik CIP-1'i sadece sahte mutagenez için diğer chlamydial aliquot'a ekleyin.
   NOT: Son EMS konsantrasyonu 10 mg/mL'dir. Konlamyal titer, EMS konsantrasyonu ve bu protokolde kullanılan maruz kalma süresi bulaşıcı soyundan yaklaşık olarak %60-80 azalmaya yol açmaktadır. Bu azalma düzeyi konlamidial genom başına ~5-20 DNA lezyonlarına karşılık gelir^8.
5. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka. Mutajenize eB'ler bölüm 2 monolayers enfekte doğrudan kullanılacaktır.
   DİkKAT: EMS bilinen bir karsinojendir. EMS ile temas eden tüm ekipman ve malzemeler imha edilmeden önce 24 saat boyunca 1 M NaOH içinde ıslatılmalı, protokol ve EMS malzemelerinin temizliği sırasında eldivenler her zaman kullanılmalıdır.

2. Mutant Ctr görüntüleme

1. Mutajenize Ctr görüntüleme ve izolasyon için konak hücre kültürü
   1. Tohum 6 iyi cam alt plaka ile 6 x 10⁵ Cos-7 hücreleri (ATCC) iyi başına 2 mL tam medya (RPMI-1640% 10 fetal sığır serum ve 10 mg / mL gentamicin ile desteklenmiştir). Mutagenized Ctr görüntüleme için bu cam alt plaka kullanın.
   2. 1 mL tam ortamda her 1 x 10⁵ Cos-7 hücresi (ATCC) içeren 24 kuyu polistiren plakatohum. İlgi izole Klamidya reenfeksiyon için bu polistiren plaka kullanın.
   3. Her iki plakayı da yaklaşık 18 saat boyunca %5 CO₂, 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Hücreler biraraya geldiğinde, medyayı 1 μg/mL siklohekamid ile tamamlanmış tam ortamla değiştirin ve bir gecede kuluçkaya yatırın.
2. Ev sahibi hücre kültürünü mutajenize Ctr ile enfekte etmek
   1. 1,5 mL/kuyu buz gibi HBSS'de 1,5 mL/kuyu buz gibi HBSS'de 1,5 mL/kuyubuz gibi eB'ler ile cam alt plakanın 5 kuyusu ile enfekte edin.⁵ Bu da mutagenez nedeniyle ~%70 mortalite oranı beklendiği için ~ 0.3'ün MOI'sine neden olacaktır.
   2. Kalan kuyuya 1,5 mL/kuyu buz gibi HBSS'de ~2 x 10⁵ sahte mutajenize edilmiş EB'lerle bulaştırın. Mutagenez olmadan, daha az mortalite bekliyoruz, böylece inokül üçte biri ~ 0.3 MOI elde etmek için kullanılır.
      NOT: ~0.3 MOI, konak hücrelerinin tek bir EB tarafından enfekte olmasını sağlar ve klonal izolasyon için enfekte hücreler arasında yeterli ayrımı sağlar.
   3. Plakayı 37 °C'de 15 dakika boyunca, sallanan bir şekilde kuluçkaya yatırın.
   4. Enfekte konak hücreleri önceden ısıtılmış (37 °C) HBSS içeren 1 mg/mL heparin ile hemen ardından hbss durulama ile yıkayın. Heparinin çıkarıldığından emin olmak için heparini hemen HBSS ile durulayın, heparini tekrarlayın.
      NOT: Heparin inhibe eder ve konak hücre ile EBs¹³arasındaki erken elektrostatik etkileşimleri tersine çevirebilir. Heparin yıkar henüz konak hücrelerine girmek için, enfeksiyon senkronize EBs kaldırmak. Hücreler yıkanırken, hücrelerin kuyuların yüzeyinden sislodize siniönlemek için bunu nazikçe yaparlar. HBSS ve heparin çözeltileri artık EMS içerir ve imha edilmeden önce 24 saat boyunca 1 M NaOH içeren bir kabın içine konulmalıdır.
   5. HBSS'yi önceden ısıtılmış (37 °C) görüntüleme ortamının 4 mL/kuyusu (komple ortam, 1 μg/mL siklohekamid, 20 mM HEPES ve fenol kırmızısı yok) ile değiştirin.
   6. Sıcaklık kontrolüne yardımcı olmak ve buharlaşmayı azaltmak için ara boşlukları önceden ısıtılmış (37 °C) deiyonize H₂O ile doldurun. Plakayı 37 °C inkübatörde %5 CO₂ ile 10 saat kuluçkaya yatırın.
3. Mikroskop kurulumu ve görüntüleme
   NOT: Çok renkli çok konumlu otomatik canlı hücre floresan görüntüleme gelişimsel gen ekspresyonu dinamikleri farklı klamydial mutantlar tanımlamak için zaman atlamalı görüntüleri toplamak için kullanılır. Bu protokol, otomatik mikroskop kontrolü için açık kaynak μManager yazılım paketini kullanır¹⁴.
   1. Mikroskop kurulumu 10 saat sonrası enfeksiyon başlayın. Mikroskop sahne kuluçka makinesini %5 CO₂, 37 °C'ye ayarlayın. Enfekte 6 kuyu cam alt plakayı sahne kuluçka makinesine yerleştirin ve numune termistini h₂O'ya yerleştirin.
   2. Yüksek İçerik Tarama(HCS) eklentisini kullanarak XY aşamasını kalibre edin. Eklentiler | Edinme Araçları | HCS Site Jeneratörü μManager mikroskop kontrol yazılımı (JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
   3. 6 kuyulu plaka şablonunu seçin ve HCS eklentisi(JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4)içinde her biri için 12 görüş alanından (FOV) oluşan bir görüntüleme konum listesi oluşturun. Sahne Konumu Listesini açın ve manuel olarak odaklanın ve Aşama Kontrol eklentisini(JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6)kullanarak her FOV için ilk Z konumunu ayarlayın. Eksik hücreleri olan veya tek bir tek katmanlı içermeyen herhangi bir FOV'un XY koordinatlarını ayarlayın.
      NOT: Her görüntünün yakalanması için gereken süre nedeniyle, 30 dk aralığında en fazla 72 FOV alınabilir.
   4. Görüntüleme için 20x objektif lens kullanın. Bu büyütme, istenen çözünürlüğü sağlarken ~ 8 dahil fov başına görüntülenmesine olanak sağlar.
   5. Bu veri analizi(JoVE61365_screenfile7)sonra ilgi dahil bulmak için kullanılacak gibi pozisyonlar listesini kaydedin.
   6. Otomatik görüntüleme(JoVE61365_screenfile8)için odak ayarlamak için görüntüleme yazılımında Otomatik Odaklama seçeneğini kullanın.
   7. μManager'da görüntü tabanlı otofokusu kullanarak en tutarlı netleme sonuçlarını üretmek için aşağıdaki seçimleri ve değerleri kullanın. Otomatik netleme özellikleri penceresinde açılan menüden OughtaFocus'u seçin ve aşağıdaki ayarları kullanın. OughtaFocus-SearchRange_μm: 350, OughtaFocus-Tolerance_μm: 0.5, OughtaFocusCropFactor: 0.3, OughtaFocus-Pozlama: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, OughtaFocus-ShowImages: Evet, OughtaFocus-Maximize: SharpEdges, OughtaFocus-Kanal: DIC.
      NOT: Kırpma faktörünü azaltarak otofokus görüntüleme penceresini azaltmak daha tutarlı otomatik odaklama sağlar. OughtaFocus-ShowImages için Evet'i seçmek, kullanıcının otofokus görüntüsünü görüntülemesini sağlar.
   8. 30 dk zaman aralıkları(JoVE61365_screenfile9)ile 24 saat görüntüleme ile gelişim döngüsünün kinetik yakalayın. 12-36 HPI arasında görüntüleme Klamidya'nın gelişim döngüsünü tamamlamasını sağlar ancak konak hücreyi etkilemez.
   9. GFP ve RFP kanallarında sırasıyla %4 ve %18 yoğunlukta 250 ms maruziyeti olan hücre monokatmanlarınıgörüntüleyin (JoVE61365_screenfile10). 514/30 nm bandpass emisyon filtresi ile 470 nm'de uyarma ile Yonca (GFP) sinyalini algıla. mKate2 (RFP) sinyalini 595 nm'de uyarma ve 641/75 nm bandpass emisyon filtresi ile tespit edin.
      NOT: Uyarma yoğunluğunu en aza indirmek, Klamidya'yaflorofor fotobeyaztasyon unu ve fototoksisiteyi en aza indirmek için çok önemlidir. Pilot çalışmalarda 200-300 ms pozlama ile çözülmüş bir görüntü oluşturmak için minimum uyarma yoğunluğu ampirik olarak belirlenmelidir.
   10. Odak dilimin her iki tarafında sona eren bir odak aralığıyla birden çok Z dilimi yakalayın. Bu deneyde, 20x büyütme, bu 10 μm adımlar(JoVE61365_screenfile11)4 dilim ile elde edilmiştir.
   11. Edinme penceresinde birden çok dilimi görüntülemek için Göreli Z'yi seçin. Göreli Z seçeneği, görüntüleme konum listesinde kaydedilen Z düzlem konumunu bir sonraki zaman aralığının başlangıç noktası olarak kullanır. Floresan görüntüleme kanalları için uygun Z-ofset değerlerini girdi(JoVE61365_screenfile12).
       NOT: Görüntü tabanlı odaklama sistemi kusurludur ve 24 saat görüntüleme süresi boyunca bu odak kaymasına yol açar. Her zaman noktası için 3-4 Z odak düzlemi yakalayarak odak içi bir görüntünün korundi olduğu bulunmuştur. Floresan görüntü kanalları ile DIC kanalı arasındaki odak düzlemleri arasındaki farklılıkları düzeltmek için Z-ofset gereklidir. Bu Z-ofsetin ampirik tayini gerekecektir.
   12. Kök dizinini seçip denemeyi adlandırarak görüntüleri kaydedin. Görüntüleri tiff yığın dosyaları(JoVE61365_screenfile13)olarak kaydetmek için μManager resim yığını dosya seçeneğini kullanın.
   13. Çoklu D Edinme penceresinde(JoVE61365_screenfile13) Edinme Yorumları kutusuna deneysel ayrıntıları kaydedin. yani, Peki A1: Tedavi edilmezse kontrol. Peki A2-3 ve B1-3: EMS Mutantlar. Görüntüleme: 12-36HPI. Görüntü edinimi 12 HPI'dan başlatın.
       NOT: μManager kullanıyorsanız, deneme tamamlandıktan sonra programı, deneysel kurulumu ve mikroskop donanımını çalıştırarak bırakın. Mutasyona uğramış popülasyonun analizi tamamlandıktan sonra görüntüleme siteleri dahil izolasyon için tekrar ziyaret edilecektir.

3. Değişmiş gelişimsel fenotiplerle mutajenleştirilmiş Klamidya'yı tanımlamak ve izole etmek

1. Odak içi görüntü yığını oluşturma
   1. Zaman noktası başına 4 Z dilimi içeren kaydedilen görüntü verilerini kullanarak Z yığınlarından en çok netleme görüntüsünü ayıklayın. Kurtoz ölçüm seçeneğini kullanın (Analiz | Ölçü)ImageJ / FIJI otomatik olarak odak Z dilim (en yüksek kurtosis puanı) en tanımlamak ve sadece bu odak içi görüntüler ile yeni bir görüntü yığını oluşturmak için. Python komut dosyası, bu işlemi otomatikleştirmek için tamamlayıcı bir dosya(Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py)olarak ekolarak ekolarak yer almaktadır.
2. Floresan ekspresyonunu bireysel içermelerde ölçme
   NOT: İki muhabirin ifade kinetiğini ölçmek için açık kaynak görüntü analizi uygulaması ImageJ/FIJI ve eklenti Trackmate^15'ikullanın. Trackmate 'noktalar' tanımlar (bu durumda eklemeler karşılık gelir) ve zaman içinde her dahil için X, Y konumu ve sinyal yoğunluğu nu kaydeden bir zaman atlamalı görüntü yığını ile onları izler(JoVE61365_screenfile14). Bu bilgiler CSV dosyası olarak kaydedilir ve çözümleme için özel bir Python not defterine aktarılır.
   1. Eklentileri tıklatarak Bio-formatlar İthalatçı kullanarak ImageJ/FIJI'deki odak içi Z-azaltılmış görüntü yığınını açın | Bio-Formats | Bio-formatları İthalatçı. Hyperstack ve Composite (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16)seçeneğini belirleyin.
   2. İşlem'e tıklayarak resim arka planını çıkarma | 50,0 piksellik Rolling ball yarıçapı kullanarak Arka Planı çıkarın ve Doymuş pikseller için görüntü kontrastını %0,3'e çıkarın (İşlem | Kontrastı geliştirin). Görüntü değerlerini 10.0 ile çarpma (İşlem | Matematik | Çarpın) (JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
   3. In Trackmate (Eklentiler | İzleme | Trackmate), 48 piksel (ampirik görüntüleme sonunda inclusion boyutuna göre belirlenir) tahmini blob çapı seçin. 8,0 piksellik Bağlantı maksimum mesafesi ve Boşluk kapatma maksimum mesafesi ve 1(JoVE61365_screenfile23 - JoVE61365_screenfile25) boşluk kapatma maksimum kare boşluğu seçerek parçasız dahil parça üretin.
      NOT: Trackmate'in tüm döngü boyunca dahil edilmeleri tanımlama ve izleme yeteneğini geliştirmek için ImageJ/FIJI'deki görüntü matematik işlevini kullanarak euobalo ve hctBbalo kanalları birlikte eklenerek ayrı bir görüntü kanalı oluşturulur. Bu kanal daha sonra Trackmate tarafından zaman içinde eklemeleri tanımlamak ve izlemek için kullanılır. Euobalo ve hctBbalo kanallarının floresan değerleri daha sonra kanal 2 ve 3'e kaydedilir.
   4. Minimum sürekli süreyi karşılayan kayıt parçaları: Parça süresi: 20(JoVE61365_screenfile26). Parçaları analiz edin ve Parçaların istatistiklerindeki Spotları Bir CSV dosyası(JoVE61365_screenfile27)olarak kaydedin.
      NOT: Bu işlem, ek verilerde(TrackMate_Zreduced_JOVE.py)sağlanan özel bir Python komut dosyası kullanılarak otomatikleştirilmiştir.
3. Değiştirilmiş gelişim profillerine sahip dahil etme parçalarını belirleme
   NOT: İçermeleri belirlemek için Chlamydia değiştirilmiş gelişimsel profillerle, her dahil etme parçası Python dizüstü bilgisayar kullanılarak görselleştirildi. Bu görselleştirmeler, sahte tedavi edilen popülasyondan farklı kinetik gen ekspresyonu profilleri ile içermelerin belirlenmesine olanak sağlar. Değiştirilmiş gelişimsel programlamaile kapsayıcıların tanımlanmasında kullanılan Python dizüstü bilgisayar, ek verilerde (EMS_Screen-İşaretle).
   1. EMS_Screen-Markdown Python Notebook'taki Alma hücresini kullanarak, izleme istatistikleri CSV dosyalarındaki Noktalar'dan gelen dahil parça verilerini Pandas veri çerçevesine aktarın.
   2. Taban çizgisi, Taban Çizgisi Çıkarma hücrelerini kullanarak her parçanın minimum değerini parça değerlerinin geri kalanından çıkararak her parçayı düzeltin. Pickle hücre olarak kaydet kullanarak elde edilen değerleri turşu dosyası olarak kaydedin. Bu, daha sonraki alma için temel çıkarmadan sonra kanal değerlerini kalıcı olarak kaydeder.
      NOT: Temel çıkarma, her dahilin başlangıç floresan yoğunluğunu sıfıra ayarlar.
   3. Floresan profilleri tam olarak yakalanmayabileceğinden, Filtre Kenarları hücresini kullanarak FOV'un kenarlarına yakın eklemelerden gelen izleri ortadan kaldırın; bu izler yanlış pozitif gelişimprofilleri üretebilir.
   4. Deneysel başlangıç zamanıtotalFramesve görüntüleme zaman aralığını kullanarak görüntü dilimlerinden zamana(startTime, interval) zamana (startTime, interval)değerleri ayarlayın. Time-lapse Calibration Parça Süresi Filtresi hücresini kullanarak denemenin son 20 saatini (16-36 HPI) sürmeyen izlemeleri filtreleyerek kısmi dahil etme okumalarını hariç tutarak okumaları hariç tutarak.
   5. Tedavi hücre atama ile deneysel duruma göre tek tek veri çerçeveleri içine parça ayrı izler. Büyüme Filtresi hücresini kullanarak yeterli büyüme gösteren eklemeler için filtre uygulayın. Büyüme Filtresi hücresinde, son iki kod satırındaki değerleri değiştirerek euoprom kanalının floresan yoğunluk eşiğini ampirik olarak ayarlayın. Bu büyümedi Klamidya filtre olacaktır.
      NOT: Eşik filtreleri ayarlarken dikkatli olun, filtre çok düşükse ortaya çıkan dağılım çizimleri gürültülü olacaktır, ancak filtreleme çok yüksek ayarlanırsa önemli mutantlar ortadan kaldırılabilir.
   6. Mutajenize edilmiş parça/kuyu sayısını, sahte işlem görmüş parça/kuyu sayısına bölerek EMS'nin neden olduğu yüzde mortaliteyi hesaplayın. Mock-treated parça/kuyu sayısını hesaplamak için, sahte işlem görmüş parça sayısını ilk seyreltme faktörü 3 ile çarpın. Bu görevi gerçekleştirmek için Count Inclusion Tracks'i kullanın ve Yüzde Ölüm Yüzdesi hücrelerini hesaplayın.
   7. Hesapla hücresini kullanarak her parça için hem erken hem de geç muhabirler için yarı maksimal ifade süresini hesaplayın. Bu değerler, gelişimsel mutantları tanımlamak için mutajenize edilmiş ve sahte popülasyonları karşılaştırmak için kullanılacaktır.
   8. Half-Max Plot hücre içinde her organizatörün yarım max ifade için zaman görselleştirmek için bokeh çizim paketi kullanın, hctBbalo karşı yarım maksimal ifade euobalo süresi grafik. Bokeh etkileşimli parça kimliği gezginini kullanarak sahte işlem gören dağılım bulutu dışında kalan mutant popülasyonun içermelerini belirleyin. İlgi nin eklenmesinin FOV ve XY koordinatlarını not edin (Şekil 2).
      NOT: Her bir klonun doğrulanması ve istatistiksel olarak değerlendirilmesi daha sonra gerçekleştirileceği için, kontrol bulutunun dışına görsel olarak düşen aday eklemeleri seçin.
   9. Animasyonlu Çizim hücre içinde çizim aracı Plotly¹⁶kullanarak hctBbalokarşı euobalo ifade yoğunlukları grafik tarafından zaman içinde dinamik olarak organizatör ifade kinetik değişiklikleri görselleştirmek . Plotly'nin dağılım fonksiyonu zaman içinde gen ekspresyonunu canlandırmak için kullanılır (Video 1).
   10. Bokeh paketini kullanarak belirli bir zaman noktasında (yani 28 HPI) euobalo ve hctBbalo ifadesini çizerek, İçerme Bulucu hücresindeki Plotly animasyonlu grafiğinden bir anlık görüntü görselleştirin(Şekil 3). Adım 3.3.8'de açıklandığı gibi mutant popülasyonundan eklemeleri belirleyin.
       NOT: Bu analizin hızlı bir şekilde yapılması gerekir (<4 h) dahil edilmeler hala genişliyor ve enfeksiyon dan sonra konak hücreleri ~48 saat lyse başlayacaktır.
4. Gelişimsel mutantları ilgi nin dahil edilmesinden izole edin
   NOT: Klamidya'yı değişmiş gen regülasyonunu gösterdiği belirlenen inklütiflerden izole etmek için kılcal iğneli bir mikromanipülatör kullanılmıştır. Well ID, FOV ve X,Y ilgi eklemekoordinatları bölüm 3.3'teki veri görselleştirmesi kullanılarak belirlenmiştir.
   1. Bir alev içinde kılcal tüp merkezi tutarak ve ayrılana kadar kılcal tüpün her iki ucunu çekerek kılcal iğneler hazırlayın. Bir mikroskop slayt üzerinde çekilen ucu kırarak çekilen kılcal iğne bir açıklık oluşturun. İğneyi kırmak için, kapalı ucu mikroskop kaydırağının buzlu kısmına bir açıyla yerleştirin ve basınç uygulayın.
      NOT: Kılcal tüp özellikleri 1.0 mm O.D., 0.5 mm I.D. idi.
   2. İğne açmanın yaklaşık olarak mikroskop altında bir ekleme büyüklüğünde olup olmadığını kontrol edin, 20x hedefi.
   3. Prepull ~ 25-30 kılcal iğneler aday eklemeizolasyon için (dahil başına bir iğne).
   4. Mikroenjektörü hava kabarcıklarının bulunmamasını sağlayarak mineral yağile doldurun.
   5. Mikroenjektöre cam kılcal bir iğne takın ve herhangi bir hava kabarcığı sildi. Kılcal iğneyi tam ortama yerleştirin ve ortamı yarıya kadar çekin. Kılcal iğnenin ortamla doldurulması kuyudaki yağ kontaminasyonunu önler.
   6. 2.3.5 adımından μManager'da kaydedilen konum listesini kullanarak, Python görselleştirme not defterinde tanımlanan ilgi alanının kuyuya ve FOV'una geçirin.
   7. Kapiller iğneyi xy koordinatlarına lokalize etmek için mikromanipülatörün joystick'ini kullanın.
   8. Ekstraksiyon için EB'leri görselleştirmek için 595 nm uyarma kanalını ve iğne görselleştirme için faz/DIC beyaz ışık kanalını kullanın. Kapiller iğneyi dahil etmek için manevra, dahil yırtılma ve sonra mikroenjektör kullanarak kapiller iğne içine EBs çizin.
   9. Adım 2.1.2'de hazırlanan 24 kuyu polistiren plakanın tek bir kuyuya kapiller iğneden EB'leri atın. Kılcal iğneyi çıkarın ve bir sonraki eklenme ekstraksiyonu için taze bir kılcal iğne ile değiştirin. Tüm aday eklemeler için bölüm 3.4'u tekrarlayın.
      NOT: Genişleme ve yeniden görüntüleme için yeterince yüksek bir titre sağlamak için, konak hücrelerin çoğunluğu enfekte olana kadar bir% 5 CO₂, 37 ° C inkübatör içinde inkübat mutant izole (~ 1 hafta). Farklı izole farklı büyüme oranları gösterebilir gibi kuyular yakından izlenmelidir.
5. Hasat mutant izole
   1. Buz üzerinde, 1 mL mikropipet ucu ile kazıyarak enfekte monolayer bozun. Medya, hücre enkaz aktarın ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüp içine Klamidya yayımladı.
   2. Pelet Klamidya santrifüj ile 30 dk 4 °C, >14,000 x g. 75 μL buz soğuğu 1x SPG'de süpernatant ve resuspend peletçıkarın. Aliquot üç içine 1.5 mL vida-kapak mikrosantrifüj tüpler. -80 °C'de saklayın.

4. Mutant izole fenotiplerin doğrulanması

1. Mutajenize izole görüntüleme için konak hücre kültürü
   1. 100 μL'lik tam ortamda her kuyu başına 1,6 x 10⁴ Cos-7 hücresi (ATCC) içeren 96 kuyu cam alt plakatohum. %5 CO₂, 37 °C'de kuluçka. Hücreler yaklaşık 24 saat içinde biraraya ulaşmalıdır. Hücreler konduktan sonra, 1 μg/mL sikloheximid ile takviye tam medya ile medya değiştirin, gece kuluçka.
2. Fenotipik doğrulama için aday izole hücreleri enfekte
   1. Buz üzerinde mutant klonları ve yabani klamidya ları eritin.
   2. Hazırlanan 96 kuyu plakasında, izole başına bir sütun (11 sütun) kullanarak mutant izole iki kat seri seyreltme gerçekleştirin. 100 μl HBSS'de 1:20'lik bir başlangıç seyreltme ile başlayın.
      NOT: Klamidya'nın seri seyreltmesi mutant numunelerin MOI < 1'de görüntülemesini sağlamak için yapılır.
   3. Kalan (12.) kolona MOI ~0.5'te yabani tip Klamidya ile bulaş.
      NOT: Yabani klamidya mutajenize izolasyonlara karşı karşılaştırma için bir kontrol olarak kullanılır.
   4. 37 °C'de 15 dk sallayarak kuluçka.
   5. Enfekte konak hücreleri önceden ısıtılmış (37 °C) HBSS ile 1 mg/mL heparin ve HBSS bölüm 2.2'de belirtildiği şekilde yıkayın.
   6. Önceden ısıtılmış (37 °C) görüntüleme ortamının kuyubaşına 200°L'lik bir kısmını değiştirin.
   7. Ara boşlukları önceden ısıtılmış (37 °C) deiyonize H₂O ile doldurun.
   8. %5 CO₂, 37 °C'de 10 saat kuluçkaya yatırın.
3. Mikroskop kurulumu
   NOT: Mikroskop kurulumu için bölüm 2.3'e bakın, bu bölüm yalnızca gerekli kurulum değişikliklerini içerecektir.
   1. HCS eklentisinden 96 kuyu plaka şablonu seçin.
   2. Ampirik olarak her mutant izole için bir MOI < 1 karşılık gelen kuyuları belirleyin. Euo organizatörü kontrolündeki yonca ifadesi ~10 HPI'de gözlemlenebilir ve içermelerin erken görselleştirilmesi mümkün olur(Şekil 1B).
   3. Mutant başına moi < 1'e karşılık gelen üç kuyu seçin ve kuyu başına iki FOV'dan oluşan bir görüntüleme konum listesi oluşturun.
      NOT: Donanım kısıtlamaları nedeniyle zaman aralığında sadece 72 görüntü alınabilir, bu durum 12 örnek görüntülenirse kuyu başına iki görüntüleme sitesi kullanılarak her sulandırma başına üç seyreltme (kuyu) eşittir.
   4. 12 HPI'den başlayarak 30 dk aralıklarla 36 saat boyunca her mutantın gelişim döngüsünü kaydedin.
   5. Deneysel ayrıntıları Satın Alma Yorumları kutusuna kaydedin. yani e., Peki ABC1: wildtype kontrolü. Peki ABC2: Mutant zorlanma 1, ABC3: Mutant suşu 2, vb ... Görüntüleme: 12-48 HPI.
   6. Görüntü edinimi 12 HPI'dan başlatın.

5. İzole doğrulama için veri analizi

1. Odak içi görüntü yığınları oluşturun ve floresan ifadesini tek tek eklemelerde ölçün
   1. Bölüm 3.1 - 3.2'de belirtildiği gibi her dahil etme için floresan yoğunluk izleri oluşturun.
2. Ctr mutagenized izole doğrulayın
   NOT: Mutant yalıtmalarının değiştirilmiş gelişimsel profillerini doğrulamak için, ifade profilleri Python not defteri kullanılarak wildtype ifade profiliyle karşılaştırılır. Değiştirilmiş gelişimsel programlama ile mutant klonların doğrulanması için kullanılan Python dizüstü tamamlayıcı veriler(clone_check-Markdown)sağlanır.
   1. Bölüm 3.3'te yapıldığı gibi, clone_check-Markdown Python not defterindeki dahil etme izleme verilerini içe aktarın ve filtreleyin.
   2. Ortalama yı hesapla ve STD hücresini kullanarak her yalıtma ve yabani tipi kontrol popülasyonunun izlerinden ortalama ve standart sapmayı (STD) hesaplayın.
   3. Graph Iso vs WT hücre çizimi ile her mutant klonun ortalama (SEM) ortalama ve standart hatası, mutant ekspresyonun un wildtype örneğinden farklı olup olmadığını belirlemek için wildtype kontrolüne karşı(Şekil 4).
   4. İzleyen mutant popülasyonun mutant izlerini çizerek ve bölüm 3.3'te (3.3.7-3.3.10 adımları) yapıldığı gibi bir dağılım çizimi kullanarak yabani tip ekleme izlerini karşılaştırarak klonal olup olmadığınıbelirleyin( Şekil 2 , Şekil 3). İzole karışık bir popülasyonsa, arsa, bir popülasyonun vahşi tiple örtüştünü ve vahşi tip dağılım bulutunun dışında ikinci bir ayrı popülasyon ugösterir. Popülasyon karışık görünüyorsa mutant bölüm 3.4'te açıklanan orijinal prosedür kullanılarak yeniden izole edilebilir.
      NOT: İzole edilen bir izolenin gelişimprofilinin istatistiksel olarak wildtype'tan farklı olup olmadığını belirlemek için, her yalıtma eğrisi ANOVA kullanılarak wildtype ile karşılaştırılmalıdır.

Representative Results

Organizatörümüzün-muhabir chlamydial zorlanmamızın direkt EMS mutagenezi, enfektelikte ~%75 azalma ile sonuçlandı. Açıklanan canlı hücre görüntüleme protokolü kullanılarak, ~600 dahil etme 24 saatlik bir süre boyunca görüntülendi ve izlendi. Her iki muhabirin floresan ifade kinetiği özel Python not defteri komut dosyaları kullanılarak görselleştirildi. İzolasyon için aday mutajenize Chlamydia belirlemek için iki görselleştirme yaklaşımı uygulanmıştır. İlk metodoloji (adım 3.3.8) euo ve hctB organizatörlerinin etkileşimli bir dağılım çiziminde tek tek kromozomizole edilen yarım maksimal ifade süresini görselleştirir(Şekil 2). İçkiler, sahte işlem gören dağılım bulutuna düştüklerinde izolasyon için tanımlanmıştır. Aday klonlar, görsel olarak kontrol bulutunun dışına düşen ler seçildi. Her klonun doğrulanması daha sonra gerçekleştirildi. A3-6-67 ve B3-8-58 klonları izolasyon için seçilmiştir, çünkü euo promotöründen yarım maksimal ekspresyonaya daha kısa sürede, hctB için daha uzun süreler üretilmiştir(Şekil 2).

Değiştirilmiş kinetik (adımlar 3.3.9-10) ile eklemeleri tanımlamak için ikinci görselleştirme yöntemi, iki promotörden dinamik gen ekspresyonunun görselleştirilmesine dayalı bireysel içermeleri tanımlar(Video 1). Yine, denetim içermelerden belirgin bir şekilde farklı dinamik dahil etme ifade desenlerine sahip aday klonlar seçilmiştir. B3-6-62, euo organizatöründen 23 ve 29 HPI(Video 1)arasında floresan birikiminin artması nedeniyle seçilmiştir. Animasyon grafiğinin anlık görüntüsü, ilgi nin dahil edildiğinin konumunu belirlemek için alınmıştır (Şekil 3).

İki görselleştirme yöntemi kullanılarak, izolasyon için toplam 24 dahil etme tanımlanmıştır. Toplam 24 izoleden 10'u yeniden test edildikten sonra diferansiyel kinetik gösterdi. Bu izole üç henotipik kategoriye ayrılmıştır; 8 izole ~ 24 HPI azalmış euoprom ifade, RB-EB dönüşüm zaman akarşılık gelen, klon A3-6-67 tarafından gösterildiği gibi(Şekil 4A). Geri kalan iki klon benzersiz henotibik profiller sergiledi, B3-8-58 izole de ~ 24 HPI azalmış euoprom ekspresyonu sergiledi, henüz hctBbalo ekspresyonunda genel bir artış(Şekil 4B),B3-6-62 euo organizatörü floresan artmış düzeyde ifade ise her iki promotörler(Şekil 4C). Mutant B3-6-62 için canlı hücre mikrograflarının analizi, konak hücre lisisinin bu mutantla enfekte olmuş hücrelerde yabani tip enfekte hücrelerden çok daha erken oluştuğunu ortaya koymuştur(Video 2).

Şekil 1: Ctr organizatörü-muhabirleri ile hücre tipi geliştirmenin izlenmesi.
(A) Organizatör-muhabir yapısı şeması, p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover. (B) Ctr'da 10HPI(C)Ctr'da euoprom-Clover ve hctBprom-mKate2'nin 36 HPI'de canlı hücre mikrografı. hctB Ölçek çubuğu: 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Temsilcinin tanımlanması, her organizatör için zamanın yarı maksimal ifadeye göre görüntülenmesiyle A3-6-67 ve B3-8-58'i izole eder.
Etkileşimli grafik, yanlış işlenmiş kontrol dağılım bulutundan farklı ifade profilleri sergileyen mutajenize chlamydia'yı tanımlamak için kullanılır. Grafikteki her nokta tek bir eklemeyi temsil eder. Dahil noktalar A3-6-67 ve B3-8-58 onlar mock-treated bulut dışında düşmek gibi vurgulanır, her ikisi de hctByarım maksimal ifade için daha uzun süre ile birlikte euo organizatörü yarı maksimal ifade için daha kısa zaman sergileyen . euobalo: x ekseni, hctBbalo: y ekseni. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Dahil konumunun tanımlanması için etkileşimli anlık görüntü.
Sunulan grafik, animasyonlu dağılım çiziminden(Video 1)28 HPI'de bir anlık görüntüdür ve ilgi nin eklenmesinin FOV ve XY koordinat konumunu tanımlamak için kullanılmıştır. B3-6-62 animasyonlu dağılım çiziminden izolasyon için seçildiği gibi gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Temsili mutant izolasyonlarının doğrulanması.
Mutajenize edilmiş gelişimprofilleri A3-6, B3-8 ve B3-6'yı izole eder. (A) A3-6 mutant ~ 24 HPI bir azalma euobalo ifade sergiler. (B) B3-8 mutant izole ~ 24 HPI bir azalma euoprom ifade sergiler, ancak hctBprom ekspresyonu genel bir artış. (C) B3-6 izole euobalo ekspresyonu düzeyleri artar ve ~40 HPI'de her iki promotörde de ani bir ifade kaybı ortaya çıkar. Her örnek belirtilen popülasyonun ortalamasıdır, n > 25. Bulut SEM temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Organizatör-muhabir Ctr'nin yönlendirilmiş ileri genetik analizi için iş akışı:
Ctr-L2-p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Yonca EB'leri axenik ortamda EMS ile doğrudan mutajenize edildi, CIP-1. Mutajenize EB'ler görüntüleme ve floresan ekspresyon analizi için Cos-7 hücreli monokatmanları enfekte etmek için kullanıldı. Klamidya değiştirilmiş gelişim dinamiklerini ifade interaktif grafiklerde görselleştirme ile tanımlanmış. Değiştirilmiş gelişimsel profillere sahip eklemeler mikromanipülatör kullanılarak izole edildi. İzolelerin fenotipleri reenfeksiyon ile doğrulandı. Mutant izole ler fenotiplerle ilişkili DNA lezyonlarLarını belirlemek için WGS'ye tabi tutulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Dinamik gen ekspresyonu çizimi kullanarak farklı ekspresyon kinetikleri sergileyen mutajenize chlamydia'nın tanımlanması. Bireysel içermeler için euo ve hctB'nin promotör ifadesi, değişmiş ifade dinamikleri ile mutajenleştirilmiş Klamidya'yı tanımlamak için zaman içinde çizilmiş ve görselleştirilmiştir. B3-6-62, yabani tip bulutuna kıyasla daha yüksek euobalo ifadesi sergilediği için izolasyon için seçildi. euobalo: x ekseni, hctBbalo: y ekseni. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 2: Temsili mutant B3-6-62 erken konak hücre lisisine neden olur. B3-6-62 enfekte konak hücrelerinin hızlandırılmış canlı hücre mikrografı erken lysis (~40 HPI) geçirilir. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosyalar. Bu dosyaları indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Klamydial gelişim döngüsünü kontrol eden mekanizmaların incelenmesi, mevcut genetik araçların sınırlamaları nedeniyle engellenmiştir. Canlı hücreli otomatik mikroskopi ile birlikte organizatör-muhabirkla Klamidya'yı istihdam eden bir sistem, 24 saatlik bir süre içinde bireysel içermelerde hücre tipi gelişimin izlenmesini sağlayan bir sistem inşa edilmiştir. Bu sistem, kimyasal mutagenez ve doğrudan dahil izolasyon ile birlikte hızlı ve klonsal klamidya değiştirilmiş gelişimsel profilleri ifade seçmek için bir yöntem kurmuştur(Şekil 5).

Klamydial EBs hücre içi iyonik koşullar ve bir enerji^kaynağı,5,¹²ile sağlandığında konak dışında metabolik olarak aktiftir. Bu EB axenic metabolizması ev sahibi hücrelerin dışında saflaştırılmış EBs mutagenize için kaldıraçlı oldu. Bu protokolde metabolize eden EB'ler doğrudan EMS ile mutajenize edildi. EMS tedavisinin EB canlılığını etkili bir şekilde azalttığı ve beklendiği gibi değişken gelişimsel kinetik üreten EB'ler ürettiği gözlenmiştir.

Açıklanan EMS mutagenez protokolünün ~5-20 DNA değişimi/EB ürettiği tahmin edilmektedir. Açıklanan canlı hücre mikroskopi iş akışı görüntüleme yeteneğine sahiptir ~ 8 görüntüleme alanı başına dahil (FOV) ve 72 FOVs her 30 dk aralıklarla. Bu nedenle, ~ 3000-10.000 mutasyonların etkileri nin her koşu da görselleştirilebildiği tahmin edilmektedir. Çoklu çalıştırmalar (3-5) 9.000-50.000 mutasyonun etkilerinin görselleştirilmesiyle sonuçlanır. Ctr-L2 genomu ~850 genleri kodlar ve bu protokolün gen başına >10 mutasyonun görüntülenmesiyle sonuçlanacağını düşündürür. Bu tahminler genom kapsamının tamamlanmamakla birlikte yeterli olması gerektiğini göstermektedir.

Bu protokolün gücü, tek bir katılım çözümünde birden fazla organizatör-muhabirin ifade kinetiklerini neredeyse gerçek zamanlı olarak izleme ve kaydetme yeteneğidir. İleri genetik gözlemlenebilir fenotipler ve klonal izolasyon dayanır. Klamidya ileri genetik için geçmiş yöntemler statik gözlemler dayanıyordu ve agar bindirmeleri ile plaquing⁸. Metodolojimiz ile dinamik organizatör aktivitesi gelişim döngüsü boyunca kaydedilir ve daha sonra değiştirilmiş gen ekspresyonu kinetiği ile Klamidya içeren dahil leri tanımlamak için görselleştirilmiştir. Birden fazla parametre (yani, belirli bir zaman noktasında yarı maksimal ifade ve toplam floresan yoğunluğu için zaman) kullanarak aday eklemeler belirlenmesi farklı gelişimsel kinetik gösteren farklı mutant havuzları ile sonuçlanır. Bu Klamidya ayrı genetik yolların düzenlenmesini etkileyen benzersiz mutasyonlar olması muhtemeldir. Bu profillerin birkaç saat sonra canlı olarak kaydedilebiliyor ve görselleştirilebiliyor olması, enfekte monolayer'ın ilgi içermelerini bulmak ve izole etmek için zaman sağlar. Geliştirme sırasında gen ekspresyonu dinamiklerine odaklanmış olsak da, alternatif gen muhabirleri diğer düzenleyici yolları araştırmak için kullanılabilir.

Sorgulanan genetik yollara bağlı olarak, siklohekmidin hücre barındırmak için eklenmesi ile dikkatli alınmalıdır. Siklohekmid ile inkübasyon konak hücrelerin inreplik engelleyerek monolayer görüntüleme özelliklerini geliştirir rağmen; bu etki konak protein sentezini inhibe ederek elde edilir. De novo konak protein sentezinin inhibisyonu sorulan soruya bağlı olarak genetik ekranın sonuçlarını etkileyebilir.

Fototoksisite ve fotobeyaztma uzun süreli hızlandırılmış mikroskopide en önemli engellerdir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, her floresan proteinin belirli özellikleri deneme den önce göz önünde bulundurulmalıdır. Yonca ve mKate2 kısa olgunlaşma süreleri var (20-30 m) fotostabtable, ve sergi nispeten büyük kuantum verimleri^17,18. Bu özellikler uyarma yoğunluğunun ve maruz kalma süresinin azaltılmasına olanak sağlayarak fototoksisite ve fotobeyaztasyon miktarının azaltılmasını sağlar. Faz / DIC beyaz ışık kanalı ışık bu spektrum klamidya için daha az fototoksik olduğu gibi otofokus için kullanılmıştır.

Bu protokol için EMS kimyasal mutajen olarak kullanılmıştır. EMS, g:C'den A:T geçişlerine guanin alkililasyon¹⁹ile neden olur. Ancak, bu protokol genomik mutasyonlar diğer tür neden olabilir alternatif mutajenler içerecek şekilde genişletilebilir. Örneğin, akridinler indels neden DNA intercalating bileşiklerin bir sınıf, çerçeve vardiya ve bu nedenle null mutasyonlar şansını artırarak²⁰.

Klamydial dönüşüm tekniklerindeki gelişmelerle, fenotipik kompleman grupları ile ilişkili mutasyona uğramış genler, genofional gen bozulması ve genotip-fenotip bağlantısının doğrulanması için genetik tamamlayıcılık yoluyla nakavt edilebilir⁹. RB'den EB gelişimine engel olan mutantların kurtarılması sorunlu olabilir, çünkü ilgi mutasyonları konak hücreleri yeniden enfekte edemeyen Klamidya'ya neden olabilir. Bu teknik, gelişimsel genleri istatistiksel çağrışımlarla (GWAS) tanımlamak için değiştirilebilir. Klamidya'nın izole inklüzumlardan genomları genişleme ve doğrulama olmadan doğrudan sıralanabilir. Bu tekniğin yüksek iş yapma yapısı istatistiksel çağrışımları mümkün kınır. Yine, bu derneklerin doğrulama gen bozulması ve tamamlayıcılık yoluyla test edilebilir⁹.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well polystyrene plates	Corning	3524	Cell culture growth for reinfection of isolates
6-well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N	Cell culture growth for imaging
96-well glass bottom plates	Nunc	165305	Cell culture growth for imaging
Bold line CO2 Unit	OKO Labs	CO2 UNIT BL	Stage incubator CO2 control
Bold line T Unit	OKO Labs	H301-T-UNIT-BL-PLUS	Stage incubator temperature control
Borosilicate glass capillary tubes	Sutter Instrument	B1005010	Capillary tubes
BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm)	Semrock	FF01-514/30-25	Fluoescent filter cube
BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm)	Semrock	FF02-641/75-25	Fluoescent filter cube
CellTram Vario	Eppendorf	5196000030	Microinjector
Chlamydia trachmatis serovar L2	ATCC	VR-577	Chlamydia trachomatis
CIP-1 media	In house	NA	Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house.
Cos-7 cells (ATCC)	ATCC	CRL-1651	African green monkey kidney cell (host cells)
Cycloheximide	MP Biomedicals	194527	Host cell growth inhibitor
Ethyl methanesulfonate, 99%	Acros Organics	AC205260100	Mutagen
Fetal Plex	Gemini Bio-Products	100-602	Supplement for base growth media
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/Fiji	NA	Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji
Galaxy 170 S CO2 incubator	Eppendorf	CO1700100X	Cell culture incubation
gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2)	Integrated DNA Technologies	NA	gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2
Gentamycin 10mg/ml	Gibco	15710-064	Antibiotic for growth media
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)	Corning	21-020-CM	Host cells rinse
Heparin sodium	Amersham Life Science	16920	inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs
HEPES 1M	GE Life Sciences	SH30237.01	pH buffer for growth media
InjectMan	Eppendorf	5179 000.018	Micromanipulator
Jupyter Notebook	https://jupyter.org/	NA	Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/
Lambda 10-3	Sutter Instrument	LB10-3	Filter wheel controler
Oko Touch	OKO Labs	Oko Touch	Interface to control the Bold line T and CO2 Unit
Prior XY stage	Prior	H107	Motorized XY microscope stage
PrismR Centrifuge	Labnet	C2500-R	Temperature controlled microcentrifuge
Problot Hybridization oven	Labnet	H1200A	Rocking Incubator for infection with Chlamydia
Proscan II	Prior	H30V4	XYZ microscope stage controler
Purifier Class 2 Biosafety Cabinet	Labconco	362804	Cell culture work
RPMI-1640 (no phenol red)	Gibco	11835-030	Base growth media for imaging
RPMI-1640 (phenol red)	GE Life Sciences	SH30027.01	Base growth media
scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm)	scopeLED	F140	Excitation light
Sonic Dismembrator Model 500	Fisher Scientific	15-338-550	Sonicator, resuspending chlamydial pellet
Stage incubator	OKO Labs	H301-K-FRAME	Cluster well plate incubation chamber
sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG)	In house	NA	Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4)
T-75 Flasks	Thermo Scientific	156499	Cell culture growth
TE 300 inverted microscope	Nikon	16724	microscope
THOR LED	Thor Labs	LEDD1B	White light
Trypsin	Corning	25-052-CI	Dislodges host cells from flask for seeding into plates
Zyla sCMOS	Andor	ZYLA-5.5-USB3	imaging camera
µManager 2.0gamma	https://github.com/micro-manager/micro-manager	NA	Open sourse automated microscope control software package