Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

גישות כמותיות לניקוד ב-vivo Neuronal Aggregate ו-Organelle הבלטה בוויקות Exopher גדולות ב C. elegans

Published: September 18, 2020 doi: 10.3791/61368
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Rutgers University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר גישות לזיהוי וכמות של הבלטות גדולות של צבירה ו/או אורגנל (~4 μm) המיוצרות על ידי תאי C. elegans בצורה של exophers המאוגדים קרום. אנו מתארים זנים, תנאי גדילה, קריטריונים ניקוד, תזמון, ושיקולי מיקרוסקופ הדרושים כדי להקל על ניתוח של מנגנון גירוש פסולת זה.

Abstract

רעילות של חלבונים מרופקים ותפקוד מיטוכונדריאלי הם גורמים מרכזיים המקדמים ירידה עצבית תפקודית הקשורה לגיל ומחלות ניווניות על פני מינים. למרות אתגרים neurotoxic אלה נחשבו זמן רב להיות תאים פנימיים, ראיות ניכרות כעת תומך כי חלבונים מחלה אנושית misfolded שמקורו נוירון אחד יכול להופיע בתאים שכנים, תופעה המוצעת כדי לקדם פתולוגיה התפשטות במחלה ניוונית אנושית.

ג. elegans נוירונים בוגרים המבטאים חלבונים צבירת יכולים להבלטה גדולה (~ 4 μm) קרום מוקף של שלוקים שיכולים לכלול את החלבון המצטבר, המיטוכונדריה, וlysosomes. שלוקים גדולים אלה נקראים "exophers" והם שונים exosomes (שהם על 100x קטן יותר ויש להם biogenesis שונה). זריקת פסולת תאית באקסופרס עלולה להתרחש על ידי מנגנון שנשמר המהווה בסיסי, אבל בעבר לא מוכר, ענף של פרוטאוסטזיס עצבי ובקרת איכות מיטוכונדריאלי, רלוונטי לתהליכים שבאמצעותם אגרגטים להתפשט במחלות ניווניות אנושיות.

בעוד exophers נחקרו בעיקר בבעלי חיים המבטאים עותק גבוה mCherry transgenic בתוך נוירונים מגע, פרוטוקולים אלה שימושיים באותה מידה במחקר של exophergenesis באמצעות organelles מתויג פלורסנט או חלבונים אחרים של עניין מסוגים שונים של נוירונים.

מתואר להלן התכונות הפיזיות של C. elegans exophers, אסטרטגיות לזיהוי שלהם, קריטריוני זיהוי, תזמון אופטימלי עבור כמות, פרוטוקולי צמיחה של בעלי חיים לשלוט על לחצים שיכולים לווסת את רמות ייצור exopher. יחד, פרטי הפרוטוקולים המתוארים כאן אמורים לשמש כדי לקבוע תקן לניתוח כמותי של exophers על פני מעבדות. מסמך זה מבקש לשמש משאב בתחום עבור מעבדות המבקשות לפרט מנגנונים מולקולריים שבאמצעותם מיוצרים exophers ועל ידי exophers מגיבים על ידי תאים שכנים ורחוקים.

Introduction

האתגרים neurotoxic של אגרגטים ומיטוכונדריה תפקודית כבר זמן רב נחשבו תאים פנימיים, אבל לאחרונה זה הפך ברור כי חלבונים מחלה אנושית misfolded שמקורם נוירון אחד יכול גם להתפשט לתאים שכנים, קידוםפתולוגיה 1. כמו כן, ניתן לשלוח מיטוכונדריה יונקים מתוך התא של הייצור המקורישלהם עבור השפלה טרנס-תאית 2 או להצלת אוכלוסיות מיטוכונדריאלי בתאים שכנים מאותגרים3. שלוקים בגדלים שונים נצפו בדרך כלל כדי להעביר חומרים סלולריים לתאים סמוכים או לסביבה נוזלית4. כמה שללות בולטות להתקרב לגודל של סומה עצבית ממוצעת (מגע ממוצע נוירון סומה ~ 6 μm) והוא יכול להכיל אגרגטים גדולים organelles.

דוגמה בולטת של הבלטה שלפוחית גדולה שיכולה לשאת אגרגטים חלבון organelles מתרחשת C. elegans מגע קולטן נוירונים המבטאים מספר עותק גבוה כתב לבנות קידוד mCherry נוטה צבירה מזיקה,השפלה עמידיםmCherry 5 . הבלטות מן הנוירונים מגע, הנקרא exophers, הם ~ 4 μm קוטר ממוצע, באופן סלקטיבי כוללים mCherry או אגרגטים אחרים, והם מועברים ישירות לתוך hypodermis השכן, אשר בדרך כלל מקיף את נוירוני קולטן מגע. ההיפודרמיס מנסה לפגוע ביסוסום, אבל כמה תכנים שאינם ניתנים לעיכול כגון אגרגטים mCherry ניתן להבלט מחדש על ידי hypodermis לתוך פסאודוקואלום מלא נוזלים של החיה, שממנו mCherry יכול להיות נלקח על ידי תאי אוכל נבלות מרוחקים הנקראים coelomocytes לאחסון לטווח ארוך (איור 1, איור 2)5.

שלולי exopher exopher גדולים בולטים לעזוב את התא מוקף קרום פלזמה קולטן מגע והוא יכול להכיל חלבוני מחלה אנושית מצטברת, מיטוכונדריה, ליזוזומים. התהליך של ייצור exopher נראה כרוך מיון של מינים רעילים פוטנציאליים (למשל mCherry נוטה צבירה הוא מופרד מסיס, חלבונים לא מופרך כמו GFP שנשאר בעיקר בסומה העצבית). בדרך זו, גירוש מכוון של הישויות המאיימות מושגת על ידי נוירון5. אתגר פרוטאוסטזיס, כגון מתח המושרה על ידי נוק-דאון autophagy, MG132-בתיווך פרוטאואזום, או ביטוי טרנסגני של חלבוני מחלה אנושית כגון מחלת הנטינגטון הקשורים פוליגלוטמין Q128 או אלצהיימר של מחלת מעורב שבר Aβ1-42, יכול להגדיל את מספר הנוירונים המייצרים exophers5.

כפי שרק לאחרונה תועדו אקסופרים, מה שידוע בתיאור הביולוגיה שלהם ראוי לתיאור. Exophers התגלו ב, והם הנחקרים היטב ב, C. elegans מגע קולטן נוירונים. ישנם שישה נוירונים מגע c. elegans mechanosensory כי יש גופים תא מופץ ברחבי הגוף(איור 3A)ונקראו תאי microtubule כי ultrastructure שלהם תכונות ייחודי 15 microtubules protofilament. תאי העצב קולטן המגע הם ה-AVM הקדמי (נוירון מיקרוטובולה גחוני קדמי), ALMR ו-ALML (תאי עצב מיקרוטובולה קדמיים ימינה ושמאל), הנוירונים המרכזיים יותר (נוירון מיקרוטובולה אחוריים), וה-PLMR האחורי ו-PLML (המיקרוטובולה הרוחבית השנייה של הנוירונים מימין ושמאל) בזנב. מעניין, ששת הנוירונים קולטן מגע לייצר exophers בשיעורים שונים, למרות הבעת אותו transgene התקפי(איור 3C). מתוך שישה נוירונים קולטן מגע mechanosensory, נוירון ALMR עובר exophergenesis לעתים קרובות יותר מאשר נוירונים מגע אחרים. כמות של מספרי exopher מנויר מגע הוא בדרך כלל נקבע על ידי התמקדות ALMR.

Exophergenesis הוא תהליך דינמי שמתחיל בדרך כלל עם נפיחות של ציות עצבית (איור 1A-B). תכולת תאית, אורגנלים או אגרגטים חלבון נאספים לצד אחד של סומה עצבית, בדרך כלל לכיוון הקצה האחורי של נוירון ALMR (הרחק מן neurite הקרנה), ויוצרים תחום pre-exopher (PED) (איור 1B). הבלטה המוקדמת נצפתה כאשר PED מתחיל להקרין כלפי חוץ, ויוצר ניצן בולט מוכר. ניצן מאוחר מוגדר כאשר הקוטר הרחב ביותר של תחום pre-exopher הוא כ 1/3 גדול יותר מאשר הקוטר של כוומת הצוואר סומה-exopher (איור 1C). Exophers ניתן לפלוט כמעט בכל כיוון מן soma, אבל רוב exophers לצאת האחוריים מגוף התא ולהישאר בערך באותו מישור מוקד כמו סומה המקור.

האקסופר יכול להתרחק מהסומה המקורית כאשר צוואר הניצן מצטמצם לבינוי דק. Exophers יכול להישאר מחובר לסומה באמצעות נימה זו (איור 1D, חץ) ומאוחר יותר יכול להיות מנותק. ניתן להעביר תכנים תאיים כגון סידן, אגרגטים ומיטוכונדריה באמצעות נימהזו אל האקסופר המצורף 5, אם כי רוב החומר ההבלטה מוכנס לתא האקסופר על ידי אירוע הניצנים המסיבי. Exophers נחשבים בוגרים כאשר אין צינור חיבור גלוי או נימה דקה exopher מופרד באופן מלא מן השולח soma(איור 1E).

Exophers המיוצר על ידי C. elegans לגעת נוירונים מיד להיתקל hypodermis, הרקמה המקיפה את הנוירון מגע. בדרך כלל, vesicle exopher נראה לנסוע בתוך האחורי hypodermis לכיוון הזנב, והוא יכול להיות רחוק למדי מן סומה לפני תוכן exopher נראה ממוקד להשפלה (לדוגמה, המרחק יכול להיות ~ 100 μm מן סומה(איור 1F)). שלפוחית האקסופר הפלואורסצנטית מתפרקת לשלפוחיות קטנות יותר בתוך ההיפודרמיס, ולוקחת על פעולה המכונה "לילהכוכב" (איור 1G ואיור 2). בשלב "לילה כוכבים", חומר פלואורסצנטי דייקן ניתן לצפות מפוזר על פני סינכרון hypodermal לתוך נקודות קטנות רבות יותר של פלואורסצנטי בהשוואה exopher הבודד המקורי. לילה כוכב יכול להיראות דייקן תחת הגדלה נמוכה עם הגדלה גבוהה יותר, יכול להיראות דייקן ו / או ברשת בתוך hypodermis. אות הפלורסנט של הלילה המנצנץ הוא בדרך כלל עמעם מאשר exopher ואת הפלואורסצנטיות הביע הנוירונלית(איור 2B-C). הפיזור של mCherry לתוך שלפוחיות דייקן רבים נחשב לערב התבגרות phagosome היתוך עם הרשת אנדוזומלית / lysomal של התא hypodermal. חלק מחומרי האקסופר כנראה מושפלים ברשת הליזומלית ההיפודרמלית, אך מינים שיורית העמידים בפני השפלה (כגון אגרגטים של mCherry) נזרקים מהתודרמיס אל הפסאודוקואלום, תא נוזלים שיכול להכיל פסולת תאית. חומר הפלורסנט נלקח מאוחר יותר על ידי תאי אוכל נבלות מרוחקים הנקראים coelomocytes (איור 2C), אשר יכול להתרכז, לאחסן, ושוב לנסות השפלה של mCherry.

התופעה של הבלטה מצטברת והעברה נראית שנוצלת על פני פילה, לאחר שדווח במודלים גנטיים כגון C. elegans5,6,7 ו D. מלנוגסטר8,9, כמו גם במודלים יונקים מרובים., שבלטים דמויי Exopher דווחו עבור תאיםיונקים 10, תצפית המצביעה על כך שמנגנונים שנצמרים עשויים להיות בבסיס צבירה וגירוש organelle. ייצור Exopher עשוי אפוא להיות מנגנון שנשמר של ניהול פסולת תאית המהווה בסיסי, אבל בעבר לא מוכר, ענף של פרוטאוסטזיס עצבי ובקרת איכות מיטוכונדריאלי, אשר, כאשר לא מאוזן, עשוי לתרום באופן פעיל למחלה ניוונית. זיהוי המולקולות המעורבות באפליה ומיון פסולת, הובלה לאזור תת-תאי מובהק, שבלט, היווצרות/מספריים של החיבור צינורי המקשר בין הסומה לבין ההתלהמות המאוחרת, והכרה בשלפוחית הגדולה של ההבלטה להשפלה מרחוק על ידי תא סמוך נותרים לעבודה עתידית. מחקרים במודלים נמטודה וזבוב יהיה חשוב באופן קריטי להגדרת מנגנונים של איסוף והעברה של אורגנל, תוך שימוש בגישות גנטיות לא משוחדות וכלים ביולוגיים רבי עוצמה של תאים המוצעים על ידי מודלים אלה כדי לזהות מולקולות משתתפות בהקשר פיזיולוגי.

צעדים ראשונים קריטיים במנגנוני פענוח אופרטיביים בביולוגיה exopher כרוכים בהגדרת פרוטוקולים לשחזור ב כימות vivo exopher. מודל C. elegans מציע יתרון מסוים למאמצים כאלה מאז הגוף הוא שקוף exophers ניתן לצפות בקלות כאשר הם מכילים חלבונים מתויגים פלורסנטים או organelles. Exophers דווחו להיות שנוצר על ידי C. elegans דופאמין נוירונים PDE ו CEP, ASE ו ASER נוירונים חושיים, ונוירונים אמפיאדמילוי צבע 5. בגלל exophers המיוצר על ידי נוירונים קולטן מגע מאופיינים בצורה הטובה ביותר, ההתמקדות כאן היא על השימוש בנוירונים מגע לניתוח exopher. עם זאת הגישה הבסיסית ניתן להחיל כדי למדוד ייצור exopher מכל תא. פרוטוקולים כדי לזהות וכמות exophers המיוצר על ידי C. elegans מגע נוירונים קולטן כי transgengen להביע חלבון mCherry מתוארים, עם דגש על cargoes שניתן לפקח על אילוצים זמניים בניקוד. מאמר זה מגדיר גישות לקראת זיהוי vivo exopher, ואת הכמות של תנאים סביבתיים וגנטיים לווסת את ייצור exopher. הפרוטוקולים מדגישים תשומת לב קריטית לתנאים קבועים ללא מתח לקביעת ייצור אקסופר בסיסי ולהשוואות בין גנוטיפים.

Protocol

1. זנים שימושיים לזיהוי אקסופר

  1. בחר זן המבטא קרגו פלורסנט בתוך הנוירונים של C. elegans כדי לדמיין בקלות exophers.
    הערה: טבלה 1 מפרט זנים ששימשו להדמיה exophers המיוצרים נוירוניםקולטן מגע 5,11,12. באופן עקרוני, כל סוג תא או נוירונלי יכול להיבדק לייצור exopher באמצעות תא או רקמה ספציפית מקדם כדי לנהוג ביטוי של חלבון פלורסנט שמצטבר או נבחר אחרת להבלטה.
  2. לחלופין, השתמשו במאכל מילוי צבע כדי לדמיין אקסופרים בנוירונים הראש אמפיד, אשר פתוחים לסביבה, ומותנים למילוילאחור 5,13.

2. אמצעי צמיחה

  1. הכן את אמצעי הצמיחה הסטנדרטיים של נמטודה (NGM) לזני תרבותבהתאם לשיטות סטנדרטיות 14,15.
    הערה: מחסור במזון, או פלואורו-deoxyuridine (FuDR), משמש בדרך כלל כדי לחסום את ייצור צופי, והוא יכול להשפיע באופן דרמטי על ייצור exopher. לשמור על האוכלוסייה ברציפות מוזנת (להימנע אפילו תקופות קצרות של תשישות מזון חיידקי) ולשמור על בעלי חיים בטמפרטורה קבועה.

3. בעלי חיים בעלי חיים קריטיים לייצור אקסופר עקבי

  1. לגדל בעלי חיים על מדיה עקבית עם מקורות מזון חיידקיים עקביים. אסור שלעלי חיים ייגמר המזון החיידקי, אפילו לפרקי זמן קצרים, שכן הגבלת מזון יכולה לשנות באופן דרמטי את רמות הייצור של אקסופר.
  2. שמור מתכונים תקשורתיים ומדי הכנה לאורך כל המחקר.
    הערה: שינוי מדיה יכול להשפיע על רמות בסיס של ייצור exopher. אצוות Agar יכולות להשפיע על רמות exopher בסיסיות, כך כאשר הרבה אספקה משתנה, רשום לעצמך את התאריך. לזרוק צלחות מלאי לאחר שבועיים כדי להבטיח מזון חיידקי בריא כדי למנוע אגר מיובש, אשר גורם לשינויים osmolarity אגר המשפיעים על רמות exopher.
  3. בתנאי בסיס, לשמור על בעלי חיים בטמפרטורה קבועה של 20 מעלות צלזיוס. גידול בעלי חיים בטמפרטורות משתנות (אפילו שינויים זמניים בטמפרטורה) יכול לגרום לווריאציות בתזמון של ייצור אקסופר מקסימלי.
    הערה: השתנות הטמפרטורה אינה מוגבלת לתנאי תרבות. שינויים בטמפרטורות במהלך ניסויים או על ספסל המעבדה יכול להיות השפעה. לדוגמה, טמפרטורות בתוך חדר מיקרוסקופ לא צריך להיות שונה באופן דרמטי חממת התרבות או ספסל מעבדה.
  4. אין להשתמש בהתערבויות תרופתיות נגד פוריות, משום שביצים מופרות הן קריטיות לייצור מוקדם של אקסופרים.
    הערה: יש להימנע משימוש בפלואורו-דוקסיורידין (FuDR)16 או C2217. בעת ביצוע ניסויים בבעלי חיים תוחלת חיים או בגיל מבוגר, אוכלוסיות מסונכרנות בגיל צריך להישמר על ידי הסרה פיזית של מבוגרים מן הצבי הקטן שלהם על ידי לקטוף אותם על צלחות טריות להפיץ עם חיידקים במקום באמצעות התערבויות תרופתיות נפוצות נגד פוריות.
  5. אין להשתמש בתרבויות מזוהמות; לערוך מחדש ניסויים במקרה של פשרה ביולוגית של האוכלוסייה או הצלחת. זיהום חיידקי או פטרייתי יכול לגרום ללחצים ושינויים מטבוליים בבעלי חיים וחייב להיעדר מאוכלוסיות ניסיוניות.
    1. כדי למקסם את התוצאות הניתנות לשחזור, שמרו על תרבויות לפחות שני דורות בריאים, מוזנים היטב, ללא זיהום ב-20°C לפני הניסויים כדי למנוע שינויים אפיגנטיים פוטנציאליים הנגרמים על-ידי הסביבה.

4. סינכרון גיל עבור ניקוד exopher על ידי הלבנת, ציפה סוכרוז, או לקטוף זחלי L4

  1. לשמור על אוכלוסיות ניסיוניות באותו גיל ביולוגי, כמו דפוסי זיהוי exopher להשתנות עם גיל מבוגר והשוואה של בעלי חיים של אוכלוסיות בגיל מעורב יכול לבלבל את התוצאות. תמיד להבטיח סנכרון מוצלח של אוכלוסיות בעלי חיים ניסיוניים על ידי בדיקת מורפולוגיה "הסהר הלבן" הפות בשלב L4.
    הערה: בדרך כלל, ייצור exopher שיא עבור C. elegans mechanosensory ALMR נוירונים מתרחשת ביום הבוגר 2-3 (איור 3D), כפי שנמדד מימים פוסט L4 שלב. יום מבוגר 1 הוא 24 שעות לאחר שלב זחל L4 כי הוא נבדל על ידי מורפולוגיה "סהר לבן" פות (איור 5E).
  2. הכן אוכלוסיות ביצים מסונכרנות על-ידי הלבנת מבוגרים.
    1. לאסוף מבוגרים gravid מלא ביצים על ידי שטיפת בעלי חיים גדל על צלחת NGM. כדי לשטוף, להציף את הצלחת עם 1 מ"ל של M9 חוצץ, צינור למעלה ו למטה כדי לאסוף נוזל עם בעלי חיים תלויים צינור לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. חיות כדוריות על ידי יישוב כבידתי או צנטריפוגה עדינה עם צנטריפוגה קטנה ולהסיר את supernatant.
    2. להוסיף 150 μL של 5M NaOH ו 150 μL של 6% נתרן hypochlorite (אקונומיקה) ב 1 מ"ל ב H2O ולערבב על ידי היפוך במשך כ 5 דקות.
      הערה: פתרון הלבנה טרי מבטיח כי ניתן לשבש את הציור של בעלי החיים עבור קציר ביצים. התקדמות בשיבוש ציפר ניתן לפקח תחת מיקרוסקופ לנתח; מבוגרים צריכים לשבור ולשחרר ביצים בנקודה שיש לעצור את ההלבנה.
    3. צנטריפוגה בעדינות עם צינור מיניצנטריפוגה במשך 20 s ולהסיר את supernatant. להוסיף 1 מ"ל של M9 מאגר צנטריפוגה שוב, עוזב על 100 μL על גבי הכדור.
    4. חזור על שלבים 4.2.3 פעמיים כדי להסיר עקבות של תמיסת אקונומיקה.
    5. תוסתמו מחדש את הביצים בנפח הנותר והעבירו לצלחת NGM טרייה שנזרעה. מבוגרים יהיו בריאים, אבל ביצים רבות קיימא צריך להיות בהכנה.
  3. הכן אוכלוסיות מסונכרנות לפי ביצית מתוזמנות.
    1. בחר 20 מבוגרים גרבידים לצלחת NGM זריעה באמצעות פרוטוקולי העברהסטנדרטיים 14.
    2. לאפשר לבעלי חיים לזחול ולהטיל ביצים בחופשיות במשך 1.5 שעות (זנים מוטנטים עם גדלים נמוכים של מהורהרים עשויים לדרוש הכנסת בעלי חיים בוגרים יותר).
    3. מוציאים את כל החיות הבוגרות מהצלחת על ידי קטיף, ומשאירים מאחור את אוכלוסיית הביצים המסונכרנות. בדוק צלחות כמה שעות מאוחר יותר כדי לוודא כי לא מבוגרים קיימא לא החמיץ במהלך הסרת מבוגר.
  4. להכין אוכלוסיות ביצים מסונכרנות על ידי מבחר ציפה סוכרוז של ביצים.
    1. לאסוף בעלי חיים וביצים מחמש צלחות NGM שעליהן חיות גרביד כבר מטילות ביצים במשך 24 שעות לפחות על ידי הצפה צלחות עם פתרון M9 עם 0.1% חומרי ניקוי (כגון Tween 20 או Triton X-100) ואיסוף לתוך צינור 15 מ"ל. מבוגרים כדוריים על ידי צנטריפוגציה עדינה בטמפרטורת החדר (2,000 x גרם עבור 30 s).
    2. הסר את supernatant ולשטוף בעלי חיים ב 15 מ"ל של M9 טרי שלוש פעמים, השלכת supernatant לאחר כל שטיפה, הקפד לשמור על הכדור מועשר בבעלי חיים וביצים.
    3. שמור על 2 מ"ל של סופרנטנט ופנס את הכדור. להוסיף 2 מ"ל של 60% משקל על ידי סוכרוז נפח.
    4. צנטריפוגה ב 2000 x g עבור 5 דקות. הפתרון יציג כעת שלב עליון מועשר מאוד בביצים.
    5. להעביר על 2.5 מ"ל של השלב העליון צינור חדש 15 מ"ל ולהוסיף 10 מ"ל של M9.
    6. מערבבים לפי היפוך במשך דקה אחת ולאחר מכן צנטריפוגה 2000 x g במשך 1 דקות.
    7. מוציאים את הסופרנטנט ושוטפים את הגלולה המועשרת בביצים ב-M9. 10-15 μL של כדור הביצה ניתן להפיץ לצלחת NGM חדשה OP50 זרעים.
      הערה: שיטה זו מכינה מספר רב של ביצים; אל תאפשר לבעלי חיים שנאספו להיגמר מזון OP50 E. coli.
  5. הכן אוכלוסיות מסונכרנות על-ידי איסוף בעלי חיים בשלב הפיתוח של L4.
    1. לגדל בעלי חיים על צלחות NGM זריעה כמתואר לעיל.
      הערה: ג. אלגנס מתפתחים בארבעה שלבים נפרדים. ב-20 מעלות צלזיוס, ביצה חדשה שהונחה אורכת כ-9 שעות לבקוע(איור 5א). צוהר פוסט, בעל חיים עובר דרך שלב זחל 1 (L1) אל זחל שלב 4 (L4), עם כל שלב משך 8-12 שעות בין כל מוליך(איור 5A-F). לכן, צלחת שהוכנה על ידי לחסן עם ביצים צריך להיות בעלי חיים L4 רבים לקטוף כ 40 שעות לאחר הביצים הם הציגו.
    2. זהה בעלי חיים בשלב L4 על ידי איתור צורת חצי הירח הלבן של הפות המתפתח (איור 5E).
      הערה: בעלי חיים בשלב L4 הם אחידים בגודל ובפיגמנטציה של הגוף. בחר בעלי חיים עם הסהר הלבן לצלחת צמיחה טרייה לבדיקה של בעלי חיים מבוימים. למחרת (כ-24 שעות מאוחר יותר) יש לספור כיחסם הבוגר 1.
    3. ציון אוכלוסייה של בעלי חיים מדי יום ביום הבוגר 2.
      הערה: Exophers הם בדרך כלל הבקיע ביום 2 של הבגרות, שהוא ייצור exopher שיא בתנאים בסיס. עם זאת, מכיוון שהשיא והתזמון של exophergenesis עשויים להשתנות על ידי שינויים סביבתיים או גנטיים הנחקרים, מומלץ להבקיע אוכלוסייה של בעלי חיים בוגרים מדי יום על פני ארבעה ימים כדי ליצור את התמונה המקיפה ביותר(איור 3D).

5. זיהוי אקסופרים באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט

  1. שימו לב לצופים באמצעות מיקרוסקופ ניתוח פסאודו-סטריאו-סטריאוי בעל הגדלה גבוהה, המותאמו למיקרוסקופ פלואורסצנטרי.
  2. לשתק בעלי חיים על לוחות NGM על ידי pipetting 100-200 μL של 10-100 mM levamisole / tetramisole פתרון על פני משטח צלחת agar NGM. לאחר 2-4 דקות, בעלי החיים הופכים למשותקים ותו לא ניתן לצפות בהם ישירות על צלחת הגר.
    הערה: טיפולי אימוביליזציה אינם נדרשים לחלוטין, כך שעם עין מיומנת, זיהוי עצבי ונוכחות exopher ניתן להבקיע על ידי חזותית בעקבות בעלי חיים זוחלים מתחת למיקרוסקופ על הצלחת בעת קביעת אם exopher הופק או לא.
  3. צפה נוירונים פלורסנט באמצעות הגדלה כוללת של 100x כדי לבצע זיהוי מיקרוסקופ לנתח של exophers.
    הערה: הניקוד של אירועי אקסופר באמצעות מיקרוסקופית פירוק מאפשר תצפית של מספר גדול של בעלי חיים בקלות יחסית ישירות על לוחות אגר שבו הם גדלו.
  4. הדמיה חיה והצטברות של כתבים לחקר אקסופר באמצעות מיקרוסקופית קונפוקאלית
    1. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לדינמיקה תאית של תמונה חיה ומאפיינים של אקסופרגנזה.
      הערה: הדמיה חיה היא גישה יתרון להתבוננות בפרטים עדינים של ייצור exopher מכיוון שייצור exopher הוא תהליך דינמי.
    2. להגביל את תנועת בעלי חיים עבור הדמיה חיה ברזולוציה גבוהה באמצעות שיטות נוחות, כולל ניצול של levamisole או tetramisole ב 10-100 mM או היישום של microbeads פוליסטירן הידרוג'ל (עם קוטרים של 15 μm, 30 μm או 40 μm)18.
  5. הכנת שקופיות למיקרוסקופיה מורכבת וקונוקלית
    1. הר 20-50 בעלי חיים לתוך סוכן משתק על מגלשת מיקרוסקופ. שקופיות ציטולוגיה טבעתיות לשימוש חוזר הצבועות בטבעות מוגבהות בקוטר 13 מ"מ שימושיות להרכבה.
    2. בחר בעלי חיים חיים לתוך 5-20 μL של משתק כגון 10-100 mM levamisole או tetramisole בתוך המעגל הצבוע או על משטח אגר.
    3. המתן 4 דקות לשיתוק ולאחר מכן כסה את השקופית עם כיסוי (מומלץ על מס' 11/2 (0.16 – 0.19 מ"מ) או על מס' 2 (0.17 - 0.25 מ"מ).
  6. הרכבה של מספר קטן של בעלי חיים
    1. אין למחוץ בעלי חיים רכובים; כאשר צופים רק כמה (פחות מ 20) בעלי חיים לכל שקופית, יהיה סיכון של ריסוק חלק מבעלי החיים בשל לחץ לא שוויוני של כיסוי. ניתן למזער סיכון זה באמצעות משטח agarose באחוזים נמוכים להרכבה.
    2. בצע שקופית כרית agarose 2-4% ולאחר מכן להוסיף 2-15 μL של פתרון משתק למשטח. זכור levamisole ו tetramisole לפזר לתוך המשטח, הפחתת הריכוז היעיל שלהם.
    3. הר על ידי בחירת בעלי חיים לתוך 2-15 μL טיפה של פתרון משתק או microbeads נח על כרית אגר. מניחים את הכיסויים למעלה ובדקו שבעלי החיים שלמים18.
  7. הכנת כרית אגר
    1. כדי להכין 2% רפידות אגר, לחמם 2% agarose בתמיסת M9 ומיקרוגל עד agarose הוא במצב הומוגני ומותך.
    2. כדי להשיג כרית אגר באיכות מספקת, ערבוב חלופי ומיקרו-גרירה בהדחת ם נמוך במשך פחות מ-20 שניות. הימנע מהכללה של בועות אוויר בתוך המשטח על ידי הצבת אגר רותח על בלוק חימום ומאפשר בועות לעלות על פני השטח.
    3. השתמש פיפטה פסטר לצייר אגר עמוק בתוך הפתרון מותך מתחת בועות עלו.
    4. הכן שתי שקופיות מודבקות והכן משני צדי מיקרוסקופ זכוכית נקייה על משטח שטוח. כדי להפוך את השקופיות המודבקות למקם שני רצועות 5 ס"מ של קלטת מעבדה על כלשקופית (איור 6A).
    5. באמצעות צינור פסטר, מניחים טיפה אחת של אגר על שקופית מיקרוסקופ נקי כריך בין שקופיות מודבקות(איור 6B).
    6. בזהירות ובמהירות, לכסות את הטיפה של אגר מותך עם החלקה נקייה רביעית על ידי הצבת על פני שקופיות מודבקות (איור 6עותק).
      הערה: השקופית צריכה ללחוץ בעדינות את הגר המותך לתוך עיגול שטוח בעובי של כ-0.4 מ"מ (עובי הסרט)(איור 6D). הגאר אמור להתקרר במהירות.
    7. הסר את השקופית העליונה על-ידי הזזתה(איור 6E).. רפידות אגר מתייבשות במהירות והן משמשות בצורה הטובה ביותר בתוך דקות. לאחר הסרת השקופית העליונה, השתמש במשטח הג'ל באופן מיידי להרכבת בעלי חיים. הימנע משימוש רפידות עם בועות אוויר.
    8. אחסן רפידות אגר עד 30 דקות הנצוות בין שתי מגלשות הזכוכית. אגר מיובש גורם לבעלי חיים להתקבץ יחד ולהתייבש. הר בעלי חיים בתוך 2-15 μL של פתרון משתק או microbeads ולכסות עם כיסוי; מסך השקופית בתוך 20 דקות של שיתוק והרכבה (איור 6).
      הערה: מכיוון שתנאי מתח יכולים לשנות את שיעורי האקסופר, להימנע משיתוק שיכול לגרום סטרס חמצוני (לדוגמה: נתרן אזיד) בעת הקרנה עבור exophers.
  8. זיהוי אקסופרים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל של דיסק מסתובב
    1. שים לב תכונות ביולוגיות תא כגון organelles ותכולים אחרים עם 1.4 מטרות צמצם מספרי ב 63x ו 100x.
    2. השתמש בתוכנה המסוגלת לבצע שליטה בשלבים ורכישת תמונות תוך ניצול הרכישה הרב-מימדית. מיקרוסקופים ותוכנות לעיבוד תמונות צריכים להיות מתאימים גם להדמיה ואיסוף נתונים, מכיוון שצעדים אלה כרוכים בגישות הדמיה סטנדרטיות.

6. זיהוי תאי עצב מגע וניקוד עבור exophers עם בעלי חיים רכוב

  1. הר בעל חיים בוגר משותק (איור 6).
  2. זהה את מטוס הזי הרצוי. השתמש בשדה בהיר הגדלה נמוכה (10-40x) כדי לזהות את מטוס ה-Z המתאים של בעל החיים, לשים לב למיקום של בעל החיים, כיוון זנב הראש, ומיקום הפות - המהווים ציוני דרך לזיהוי עצבי ואקסופר מאוחר יותר(איור 3A & איור 5E).
  3. תתמקדי באות הפלואורססטי של הכתב הנבחר. להישאר באותו מטוס Z, לעבור לפלואורסצנס שדה רחב צפייה ב 10-40x לכתב cytosolic שנבחר.
    הערה: בדוגמה זו ביטוי פלורסנט מונע על ידי mec-4 mechanosensory מגע נוירון ספציפי יזם. מערכי העתקה גבוהים, ופלואורופורים שונים יש שונות בביטוי ולכן עוצמת פלורסנט משתנה. התאם במידת הצורך.
  4. גלול בתוך ציר Z כדי לצפות בעומק הבעת בעלי החיים והפלואורסצנטים במטוס המוקד. בעת כך, אשר את כיוון הזנב-ראש; הראש / לוע יהיה טבעת עצב פלורסנט ובמקרה זה, הזנב יכיל 1-2 נגלה PLM somas(איור 3A).
  5. זיהוי תאי עצב מגע
    1. זהה אם בעל החיים מותקן בצד שמאל או בצד ימין(איור 3א).
      הערה: בהתחשב ב3-ממדיות של בעל החיים, רזולוציית ההדמיה הטובה ביותר מושגת בצד הקרוב ביותר לאופטיקה.
    2. זהה את soma (ALM, ALMR, AVM) על ידי התבוננות - להתחיל בראש כדי לזהות את טבעת העצבים ותהליכים עצביים לעיבי.
    3. בהגדלה של פי 10-40, גלול באיטיות בציר Z כדי לזהות את התהליך המצורף.
    4. לאחר התהליך מזוהה, בצע אותו לרוחב בכיוון האחורי לכיוון הפות, שם סומה יהיה ברור, מסומן על ידי גוף תא עגול בסוף התהליך. ברגע שהסומה העצבית בפוקוס ביותר נמצאת, ניתן לזהות אותה באמצעות ציוני דרך עצביים אחרים כדלקמן:
    5. השתמש AVM, נוירון גחני בקרבת מקום, כדי לעזור להקצות אוריינטציה בעלי חיים. אם נוירון AVM הוא באותו מישור כמו ALM אז החיה נחה על צידו ואת הנוירון מחוץ למטוס הוא ALMR . אם נוירון AVM הוא לא באותו מטוס כמו ALM המדובר, הנוירון מגע הקרוב ביותר למטוס המוקד הוא ALML.
    6. זהה את נוירון PVM, נוירון מגע גחני אחר הממוקם ליד הזנב, כדי לציין אם נוירון מגע קדמי הוא באותו מישור. אם כן, הנוירון מגע שנצפה הוא ALML.
    7. קבל תחושה של המיקום של גופים אחרים של סומה, ליד תחום העניין (נוירונים פלורסנט ממוקם משני צידי הסומה), ובכל Z-מטוסים, גם אם זה לא אפשרי לקבל את הנוירון העמוק ביותר להגדיר במוקד ברור.
      הערה: הזיהוי של כל מגע נוירון somas חשוב כי החוצה ממוקד סומה יכול להיות בטעות exophers.

7. זיהוי וניקוד עבור exophers

  1. ברגע שנמצא נוירון מגע, לבדוק אותו לבליטות גדולות (תחומי exopher) גדול מספיק כדי להיחשב exopher ניצן, (להגיע לפחות1/5 הגודל של סומה המקורה)(איור 1C).
    הערה: exopher הממוצע מודד סביב 2-8 μm קוטר, בעוד סומה הממוצע של (ZB4065 bzIs166[Pmec-4::mCherry]) בעלי חיים מודד 6-10 μm ביום 2 מבוגרים(איור 7B).
  2. אם אין ניצן או תחום exopher נצפתה, לבדוק את סומה עצבית עבור נימה דקה מצורף הנבוע מהסומה. exophers מחוברים נוטים להיות ממוקמים קרוב יותר לסומה המקורית ובמוטוס Z דומה.
    הערה: Exophers לא תמיד להישאר מחוברים soma. זיהוי של נימה מצורפת הוא אינדיקציה מוחלטת לכך שהאובייקט הוא אקסופר.
  3. כדי לזהות אקסופר לא מחובר, חפש את התוכן של אקסופר. Exophers יכול לרכז חלבוני פלורסנט מגורשים ולכן הם לעתים קרובות בהירים יותר מאשר הסומה.
    הערה: התוכן של exophers הם הטרוגניים ומשתנים. אורגנלים תאיים כגון ליזוזומים ומיטוכונדריה ניתן גם להבלטה בתוך exophers(איור 4C-E).
  4. חפשו אקסופרים לא מחוברים במטוסי מוקד שונים מהמטוס שבו נמצאה הומה המקורית. למרות exophers כבר ראו לבלט מן Soma ALM בכל כיוון, זה אופייני כי exophers לבלט הרחק מהסומה, בכיוון האחורי מן התהליך העצבי.
  5. בדוק אם יש עצמים כדוריים גדולים שלא ממוקמים ומזדהים כסומסים עצביים. Exophers יכול להיות בצורה לא סדירה, אבל הם בדרך כלל מבנים כדוריים. אקסופרים הופכים מושפלים עם הזמן, כך שלאקסופרים מבוגרים נוטים להיות בעלי צורה לא סדירה יותר.
    הערה: exophers בוגר או מבוגר נבדלים מהשלב מפוזר "לילה כוכב" באמצעות עוצמת פלואורסץ בהיר יותר של exophers ואת צורתם כדורית.
  6. לחקור את פנוטיפ "לילה כוכבים" כעדות אקסופרגנזה מוקדמת יותר. אקסופרים מתקדמים לתוך "לילהכוכב" שלב כמו exopher מתפרק לתוך שלפוחיות קטנות יותר ואת hypodermis שמסביב מנסה לבזות את תכולת exopher(איור 1G,2B, 3B & 7A).
    הערה: שלב הלילה הנוהר מסומן על ידי ישויות פלואורסצנטיות מפוצלות ומפוזרות (לעתים ברשת) שאיבדו את השלמות המבנית ומציגות פלואורסצנטיות עמומה בהשוואה לנוירונים מגע ומבני אקסופר.
  7. חפש מקרים של "אירועים אקסופר מרובים". Exophers מיוצרים בדרך כלל כהתרחשות יחיד (1 exopher הנואף מסומה 1) אבל בנסיבות מסוימות יותר מאקסופר אחד יכול להשתחרר מסומה אחת(איור 7D).
    הערה: exophers בוגר יכול להשפיל לתוך שלפוחיות מרובות כפי שהם מושפלים hypodermis. הבחנה אם כל exopher נוצר על ידי אירוע exophergenesis עצמאי או אם פיצול exopher מקורי אחד כדי ליצור שלל נוסף ניתן לקבוע רק על ידי תצפית זמן לשגות.
  8. זכור כי לא כל החריגות המורפולוגיות להבשיל ל exophers.
    1. אל תבקיעמה נפוחה כאקסופר. ניתן לצפות בסומה מורחבת או מחודדת מדי פעם (במיוחד עם גיל או תחת לחץ), אך הרחבה ללא אתר כווית ברור אינה מבקיעה כאקסופר.
    2. דחה ניצנים קטנים שנפתרו שלא מגיעיםל-1/5 מגודלה של הומה בכימות אירוע אקסופר.
    3. אל תחבו את ההתהפויות של נורייט כאקסופרים. נורייטים בוגרים יכולים להתרחב באופן דרמטי עם הגיל (בדרך כלל בכיוון ההפוך של התהליך העצבי) וחלבון פלורסנט יכול לנדוד לתוך הקצה הדיסטלי של מבניםכאלה 19.
      הערה: בליטות נורייט אלה אינן אקסופרים מכיוון שיש להן דפוס התפתחותי מובהק לאורך ימים ושבועות, אינן יוצרות ניצנים, ולא מתנתקות(איור 7E).
  9. זהה ישויות פלורסנט שאינן אקסופרים.
    הערה: חשוב לקבל מושג של פלואורסצנטיות רקע כדי להבטיח זיהוי נכון של ישות פלורסנט בולט לעומת השפעה אוטומטית.
    1. ביטוי פלואורסצנטי טרנסגני לעומת שפעת אוטומטית. אל תבלבל בין שפעת אוטומטית לביטוי טרנסגני. אות exopher האמיתי לא יהיה במעי או בבטן (אישור DIC יכול לשמש כדי לזהות רקמות אלה) אות exopher יהיה בהיר יותר באופן משמעותי מאשר השפעה אוטומטית ברקע.
      הערה: Autofluorescence נגרמת על ידי פיגמנטציה פלורסנט מעיים מעיים ומצטבר עם הגיל. זה הטרוגני, במיוחד כפי שהוא נצפה עם אורכי גל שונים.
    2. אות מהעוברים. אל תבלבל בין אות העובר לאסופיה. לאשר חשדות של אות עובר על ידי מעבר מפלואורסצינטיות להארה ברייטפילד ובדיקה של אסוציאציות של אות עם ביצים ברחם.
    3. מחוץ למטוס או גופות סומה סמוכות. הימנע מטעות של סומה מחוץ למטוס עבור exopher על ידי זיהוי כל הגופים הסמוכים סומה, אפילו מחוץ לפוקוס somas בתחילת התצפית.
      הערה: אם הבקיע עבור exophers מ- ALMR, לזהות ובחשבון את המיקום של AVM ו- ALMR somas. פרטים נוספים על זיהוי גוף סומה מתוארים באות 3A.

8. ניקוד וסטטיסטיקה

  1. ציון exophers כמו בינארי (כן, יש exopher / לא, אין exopher).
  2. שקול זיהוי exopher כ"exopher-אירוע" לנוירון נתון. אירוע exopher יכול להוות תצפית של exopher יחיד ליד סומה או exophers מרובים.
    הערה: כדי לכמת מספרים של אירועים exophergenesis בודדים להשתמש תצפית זמן לשגות.
  3. ספירת אירועי exopher לכל תא מזוהה מסוים מכיוון תאים שונים אינם מייצרים exophers באותו קצב (ראה לדוגמה איור 3C). נוירונים ALMR לייצר exophers הבסיסית ביותר זנים המתוארים בזאת ולכן לעתים קרובות זהו התא שנבחר לכמת exopher מנוירים קולטן מגע.
  4. עבור נתונים סטטיסטיים, באופן כללי, לנהל לפחות 3 ניסויים ביולוגיים, של לפחות 30 בעלי חיים הבקיע לכל ניסוי עם מספר התצפיות המתאים הנדרש לניתוח של השיבוש.
    1. עבור ניסויים מרובים מעורבים מוטציות / טיפולים אחד או שניים בהשוואה לשליטה, מבחן Cochran-Mantel-Haenszel מתאים כדי לקבוע ערכי p.
    2. עבור ניסויים מעורבים יותר משני מוטציות של טיפולים לעומת שליטה, זה גם מתאים להשתמש בניתוח רגרסיה לוגיסטית בינארית כדי להעריך משמעות עבור כל מספר של מנבאים קטגוריים.

Representative Results

ניתן להשתמש במספר כתבים פלורסנטים כדי למדוד אקסופלס. Exophers נוירון מגע הם בקלות הדמיה vivo באמצעות תיוג פלורסנט של חלבונים שניתן לבחור להבלטה, על ידי תיוג של organelles שניתן להבלטה, או על ידי תיוג קרום התא. טבלה 1 מזהה נוירון מגע הביע כתבים פלורסנט ששימשו לניטור exophers, עם דוגמאות מייצגות הכלולות איור 4. Cargoes הידועים להיות מובלט exophers כוללים היתוך של תחום N-מסוף של הנטינגטון אנושי פוליגלוטמין מורחב (Q128) (איור 4B),ליזוזומים כי הם GFP מתויג עם lysomal הקשורים קרום (LMP-1) (איור 4C), ומיטוכונדריה מתויג עם מטריצה מקומית GFP (איור 4D). GFP Cytoplasmic אינו מגורש מאוד והוא נשמרעדיףבסומה 5 , למרות GFP יכול לדמיין חלש exophers (איור 4A). כאשר GFP מותך חלבונים מגורשים, תג זה יכול לשמש כדי לדמיין exophers. נקודה חשובה היא כי על ידי תיוג חלבונים שונים, מגוון רחב של שאלות על גירוש של cargoes ספציפיים organelles, כמו גם על חלבונים וממברנות שהמציאו exophers, ניתן לטפל.

התקנה פסאודו-סטריאומיקרוסקופ הוא כלי יעיל לצפייה exophers בבעלי חיים על צלחות agar. הגדרה זו היא הכלאה של טכנולוגיה מורכבת וסטריאוסקופית הכוללת אופטיקה גבוהה של צמצם מספרי על כל הגדלה, טכנולוגיית פסאודו-סטריאו (מטרות דיסקרטיות על בסיס סטריאוסקופי) ומתג הפעלה זום לצפייה בהגדלות ביניים ליעדים מותקנים. מיקרוסקופ כזה צריך להיות מצויד 10x eyepieces ויעדים חזקים מספיק להתבוננות מורפולוגיה עצבית וייצור exopher עבור ניקוד בתפוקה גבוהה (2x המטרה המשמשת לסריקה / איסוף, 10x המטרה המשמשת לזיהוי וניקוד).

בעוד יכולות הגדלה של stereomicroscopes סטנדרטי בדרך כלל יש רזולוציה גבוהה מספיק כדי לראות את הרשת של נוירונים מגע המביעים חלבוני פלורסנט, מיקרוסקופים לנתח סטנדרטי אינם מספיקים להתבוננות בפרטים תת תאיים של exophers כמו חיבורים צינוריים של סומה כדי exopher. תצפיות כאלה מחייבות מיקרוסקופיה קונפוקאלית (עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטי ציוד).

מחקרי כמות Exopher דורשים בקרות קפדניות כדי למנוע לחצים ניסיוניים. תחזוקה קשובה של תנאי צמיחה עקביים נדרשת לייצור exopher לשחזור. באופן ספציפי יותר, ייצור exopher הוא מגיב ללחץ כך האכלה עקבית, טמפרטורה קבועה, וצמיחה ללא זיהום על פני דורות הם קריטיים לרבייה. בתנאי צמיחה בסיס עם ביטוי עצבי גבוה של mCherry, ייצור exopher הוא נמוך יחסית (5-25% של ALMRs לייצר exophers) אבל כמה לחצים, כולל סטרס אוסמוטי וחמצוני, יכול להגדיל את שיעורי exopher. בעוד ביטוי mCherry יכול להיחז כמתח, corollary של רגישות הלחץ של רמות exopher הוא, אם נשלט כראוי, הקדמה מתח ניסיוני יכול להיות אסטרטגיה כדי לגרום בקלות רבה יותר ולהתבונן exophergenesis.

תזמון ורמות ייצור אקסופר צפויות. אקסופרים נעדרים כמעט במהלך פיתוח הזחלים. התקופה של ייצור exopher שיא בחיים מבוגרים צעירים נראה מוגבל מאוד בימים מבוגרים 1-4, הנפוץ ביותר להיות ניכר ביום מבוגר 2 או 3. מכיוון שהשיא יכול לעבור קדימה או אחורה קצת, ההערכה המלאה ביותר של פרופיל ייצור exopher היא להבקיע ניסויים מרובים מדי יום על פני ימים בוגרים 1-4. באופן כללי, ALMR מייצרת exopher אחד גדול, עם שלל נמשך לפחות 24 שעות. Exopher ניתן לייצר די מהר (על סדר הדקות במהירות הגבוהה ביותר שלה). בדרך כלל, רק exopher אחד גדול מיוצר לכל נוירון בתחילת החיים הבוגרים, אבל ייצור של exophers מרובים אפשרי.

באופן כללי ייצור exopher על ידי ALMRs הבעת mCherry בתנאים בזליים נע בין 5-25% של ALMRs שנבדקו במסגרת הזמן האופטימלית של יום מבוגר 2-3(איור 3D). משברי פרוטאוסטזיס5, כמו גם חשיפה ללחצים אחרים יכולים לווסת את רמת האקסופר. מתח או הפרעות גנטיות יכול להגדיל את ייצור exopher שיעורי זיהוי גבוה ככל 90% של נוירונים ALMR לייצר שבלטים exopher.

RNAi מבוסס האכלה לבדיקת תפקידים של גנים ספציפיים exophergenesis. הנמטודה C. elegans הוא נתון בדרך כלל RNAi להפיל על ידי האכלת בעלי חיים שהפכו E. coli זן HT115 המבטא RNA תקוע כפול (dsRNA) מיקוד גן שלעניין 20. HT115 חיידקים ניתן להשתמש בעת ניקוד עבור exophers בהזנת RNAi5. בעוד תעתיקים ברוב הרקמות יכול להיות ממוקד על ידי RNAi באמצעות טכניקה זו, נוירונים הם יותר עיקלים. רגישות RNAi ניתן לכייל באמצעות בעלי חיים לבטא את טרנסגני dsRNA טרנסגני טרנסיטור SID-1 תחת יזם ספציפי לנוירון. בדרך זו רקמה עצבית ניתן לחוש RNAi21.

נוק-דאון ספציפי לרקמות של גן של עניין יכול להתבצע על ידי הבעת רכיב של חילוף החומרים האנדוגני RNAi בתוך מוטציה כי הוא חסר ברכיב זה. לדוגמה: חלבון Argonaute RDE-1 יכול לבוא לידי ביטוי במיוחד בנוירונים של בעלי חיים מוטציה rde-1 כדי להשיג נוקאאוט של גן של עניין רק בנוירונים כאשר בעלי חיים נחשפים התערבות RNAi מיקוד גן זה.

באמצעות פרוטוקולי נמטודה RNAiסטנדרטיים 20,22, חשיפה של ההורים בשלב L4 RNAi ומאפשרים צולהם לפתח צריכת חיידקי HT115 טרנספורמציה עד הבגרות מייצרת את הנוקאאוט הגנטי חזק אבל להיות קשוב לעיכובים התפתחותיים פוטנציאליים המושרה על ידי RNAi כמו בעלי חיים ניסיוניים עשויים לגדול באופן שונה מאשר שליטה וקטורית ריקה. חשוב לכלול תמיד את הפקד הווקטורי הריק להשוואת בקרה שלילית. HT115 חיידקים ניתן להשתמש בעת הבקיע עבור exophers בהזנת RNAi. עם זאת, שים לב כי גנים מסוימים יעילים בשינוי שיעורי exophergenesis גם בתקופות קצרות יותר של חשיפה RNAi5. אם מיקוד של גנים מסוימים מוביל לכשל התפתחותי, להימנע מחשיפת בעלי חיים לנוק-דאון לכל החיים, בעלי חיים יכולים פשוט להיבחר בשלב L4 על לוחות RNAi לחשיפה מ L4 למבוגרים D2 או D3.

שם מתח גנוטיפ (גנוטיפ) תיאור אחוז אקסופר הפניה
סק4005 (113) ב-2015, לאחר שmec-4 ביטוי ציטוסולי של GFP בנוירונים מגע. 1-8% אל-אם איור 4א, מלנטייביץ' 2017
ת"א 4065 ב-2016, לאחר ש-1999,הואיהיה בן 16, דיכוי יתר של mCherry (bzIs166) בנוירונים מגע, מייצר הן אות ציטוסולי והן אגרגט mCherry. bzIs166 הוא תמיסת אקסופר. אגרגטים של mCherry הם מנבאים של exophergenesis והם מובלטים באופן מועדף באקסופרים. 3-20% ALM (תנאים רגילים). 20-80% ALM (תנאי צום). איור 4B, מלנטייביץ' 2017
זי-בי-4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; ב-2015, לאחר ש-15, 15, 15, ת"א 15 ת"א 15 תודח, ת"א 15 תודח, ת"א 15 ת"א 15 תודח, ת"א 15 ת"א 15 ת"א 15 ת"א 15 תודח, ת"א 15 ת"א 15 תmec-7mec-3 YFP cytosolically תוויות mec-7 לגעת נוירונים. Q128::CFP מצטבר וגורם לאקסוצרים. CFP משתיק באופן מועדף. ~ 25% איור 4C, מלטייביץ' 2017
ת.ב. 4509 ב-2016, לאחרש-1999, ה-190,הוא יהיה בן 16, ב-1999,לאחר ש-1999,ה-100, ה-100, ה-100, ה-100, ה-100, ה-10 00:00:00:0 bzIs168 LMP-1::GFP תוויות קרום פלזמה וממברנות lysomal. bzIs168 יכול לשמש לזיהוי קרום עצבי, exophers (כפי שהם ממברנה כבול), ומבנים lysomal-קרום. 3-20% ALM איור 4D, מלנטייביץ' 2017
ת.ב. 4528 ב-2016, לאחרש-1999, ה-190,הוא יהיה בן 16, ג'יזקס17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] Allele zhsEx17 הוא כתב מקומי מיטוכונדרית שמשנה את אורך גל העירור שיא שלה מ 405nm (מחומצן) כדי 476nm (מופחת) על פי הסביבה החמצונית המקומית. זה בא לידי ביטוי בנוירונים מגע, ניתן להשתמש בכוחות עצמו כדי לזהות מיטוכונדריה בנוירונים מגע ומיטו-exophers. 3-20% אל.אם פרוטאו-אקסופר. % כמות מיטו-אקסופר ALM מתבצעת. איור 4E , מלנטייביץ' 2017, קנון 2008, Ghose 2013

שולחן 1 . זנים ששימשו להדמיה של תאי עצב מגע, מגע נוירון-exophers, ותכולת exopher.

Figure 1
איור 1: שלבי אקסופרגנזה. תהליך היצירה וההסרה של אקסופר נקרא "אקסופר-בראשית". התהליך הדינמי של היווצרות exopher יכול לקחת כמה דקות עד כמה שעות. מתוארים דוגמאות של מורפולוגיה של סומה ואקסופר בשלבים ספציפיים במהלך תהליך exophergenesis דינמי בזן ייצור exopher גבוה, ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. כל התמונות הן של היום 2 נוירונים למבוגרים ALM שצולמו עם מטרה 100x. סומהרגילה. מינוזה למבוגרים לגעת נוירון ALM באופן טרנסגני מבטא Pmec-4mCherry. מורפולוגיה סומה המתוארת אופיינית נוירונים צעירים בוגרים בזן זה, עם ריכוזי mCherry בצימופלסמה. שלבBניצן מוקדם. הצעד הנצפה הראשון של exophergenesis כרוך קיטוב של חומר צטופלסמי נבחר לקצה קרום סומה. צעד זה מלווה לעתים קרובות בהרחבה או נפיחות של סומה. במקרה של תאי העצב מגע, תחום pre-exopher (PED) משתרע לתוך hypodermis שמסביב (לא נראה כאן). שים לב לריכוז גדול יותר של חומר mCherry לתוך תחום ניצן מוקדם. שלבCניצן מאוחר. עם קיטוב תאי נוסף והרחבה של התחום טרום exopher, התבססות בין soma ו exopher (חץ) הופך ברור. אירוע זה מסמן את המעבר לשלב הניצן המאוחר. למרות שבשלב הניצן המאוחר התא מציג אתר כווית ברור ותחומים נפרדים של סומה ואקסופר, הוא עדיין לא צבט לחלוטין מהסומה; exopher ניצנים עשוי להיות מחובר על ידי גבעול עבה (חץ). התחום ניצנים נחשב exopher מוקדם כאשר הקוטר של תחום exopher הנדון הוא בערך 1/3 גדול יותר מאשר הקוטר של אתר הבנייה / גבעול. שלבDאקסופר מוקדם. אקסופרים מוקדמים יכולים להיות מחוברים על ידי גבעול מהסומה היוצאת – הקוטר של חיבור זה יכול להצטמצם ככל שהאקסופר מתרחק מהסומה. חומר ציטופלסמי ניתן להעביר מהסומה exopher באמצעות צינור זה, למרות שרוב החומר נטען במהלך תהליך של ניצנים החוצה. אקסופרים יכולים לנתק מהסומה כפי שמתואר ב(ה),exophers פרודים נחשבים exophers בוגר (F). האקסופר הבוגר יכול לעבור דרך הרקמה התת עורית שמסביב, מתרחק מהסומה היוצאת. (ז)פירוט של exopher mCherry מתויג לתוך שלפוחיות קטנות יותר בתוך hypodermis תוצאות מראה דייקן מפוזר של החומר mCherry, ככל הנראה כפי שהוא נכנס לרשת אנדו-יסומלית hypodermal. אות הדייקן המפוזר נקרא שלב "ליל הכוכבים". השפלה של כמה תוכן exopher מושגת ככל הנראה על ידי ליזומה תת עורית, אבל חומר מסוים אינו מושפל באופן מלא, הוא לעתים קרובות מחדש הובלט על ידי hypodermis לתוך פסאודוקואלום. המעבר שלאחר exophergenesis mCherry מתואר בפירוט רב יותר איור 2. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: mCherry הובלט מנויונים מגע exophers עוסק ברשת הליזומלית ההיפודרמלית שמסביב, אבל מאוחר יותר ניתן להיסרט לתוך פסאודוקואלום שבו coelomocytes יכול לאחסן / להשפיל את mCherry. (א)סיכום קריקטורה של איך mCherry הבלט exophers תולה את הגוף לאחר גירוש על ידי נוירונים. במהלך exophergenesis תוכן סלולרי נבחר כגון mCherry להיות מקומי ולניצן מן השליחה של סומה עצבית בסוטרית עצמאית מוקף קרום פלזמה עצבית תת עורית. מאז תאי העצב מגע מוטבעים ברקמה hypodermal, כמו ניצני תחום exopher כלפי חוץ זה נע עוד יותר לתוך hypodermis. האקסופר יכול לעבור את ההיפודרמיס, ואחרי שעות עד ימים, תכולת אקסופר יכולה להתפרק בתוך הרשת הונדוליזומלית של ההיפודרמיס. mCherry יכול להופיע כמו פינקטה מפוזרת לאורך hypodermis, במה שנקראת "לילה כוכבים". לאחר כמה ימים, חלק mCherry יכול לעבור את hypodermis לתוך פסאודוקואלום שמסביב, שבו תאי אוכל נבלות הנקראים coelomocytes יכול לקבל גישה, ולקחת, mCherry שניתן לאחסן. (ב)דוגמה להופעתו של של שלל mCherry לילה כוכבים. תמונה של סומה ALM מתויג עם mCherry עם שברי exopher גדולים של שלוק לילה כוכבים. זן הוא ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. (ג)דוגמה לריכוז mCherry בקולומוציטים מרוחקים. Sideview של יום בעלי חיים בוגרים 10 של זן ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] מראה mCherry מרוכז coelomocytes (חצים). שלטי לילה כוכבים ניכרים גם כן. באופן כללי ריכוז coelomocyte הופך ניכר לאחר על יום מבוגר 5 של החיים. (תחתיתB) רבייה מצוירת של (B), עם נוירונים מגע ותהליכים המתוארים באדום, כמו גם שברי exopher הבהירים ביותר; שלוקים קטנים מפוזרים של עומקי Z שונים מוצגים בוורוד בהיר יותר. (תחתיתC) גרסה מצוירת של תמונה של (C), מראה תהליך עצבי באדום, לילה כוכב ורוד coelomocytes בירוק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: נוירונים מגע mechanosensory לייצר exophers ברמות שונות עם פרופיל זמני מדויק. (א)תיאור קריקטורה של נוירונים מגע mechanosensory ביחס מרחבי ציוני דרך אנטומיים מפתח של C. elegans כולל הלוע שאיבה טבעת העצבים צפופה נוירון בראש החיה, הפות בגוף האמצעי, ואת הזנב מחודד. (למטה) אני לא יודע. נוירונים מגע מתויגים פלורסנטית המבטאים GFP כפי שצפה מהצמרת והימנית (תמונות מותאמות WormAtlas). הקופסה האדומה מתארת את האזור שבו ALM exophers ממוקמים בדרך כלל. (ב)השקפת הגדלה גבוהה של אזור הגוף האמצעי שבו מיוצרים אקסופרים הנגזרים מ-ALM בזן המביע [Pmec-4mCherry]. AVM ונוירון ALMR מתוארים, ומוצג הוא exopher ALMR יחד עם mCherry לילה כוכב. תאי העצב של אלמר מייצרים בקלות את האקסופרים. (ג)נוירונים מגע mechanosensory ALMR בקלות רבה יותר לייצר exophers בהשוואה לנוירונים מגע אחרים באנדרוגינוסים בתנאים בסיסיים. Mechanosensory לגעת ייצור exopher נוירון ביום מבוגר 2, כפי שציון עבור נוירונים קולטן מגע בודדים מצוין. זן: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], N>150, קווי שגיאה הם SEM. (ד) ALMR מגע נוירונים לייצר יותר exophers בימים 2 ו 3 של בגרות לעומת שלב L4 בגיל ההתבגרות או עם בעלי חיים בגיל מתקדם. זן: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], N>150, קווי שגיאה הם SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 4
איור 4: דוגמאות של כתבים פלורסנט מסוימים המתייגים תוכן אקסופר. דרך פשוטה לצפות באקסופרס היא על ידי יצירת בעלי חיים טרנסגנים המביעים פלואורופורים מיזמים עצביים. הפלואורופורים מאפשרים הדמיה של האקסופר והביטוי הטרנסגני גורם צבירה ו/או פרוטאוסטר שמגבירה אקסופרגנזה. Exophers המיוצר על ידי נוירונים אמפיים ניתן גם לצפות בתנאים מקומיים, באמצעות מילוי צבע להדמיה. מוצגות דוגמאות של זנים נפוצים שניתן להשתמש בהם כדי לצפות exophers, (ה) exopher, (S) soma. (א)Soma ו exopher מ ALM של מבוגר של זן SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP],100x המטרה המשמשת לצילום, סרגל קנה מידה 3μm. בזן זה, exophers הכוללים GFP מסיס נמדדים, אבל ייצור exopher מתרחש לעתים רחוקות. התזת GFP לחלבונים שניתן להבלטה עדיף exophers במחקרים אחרים מאשר כי היתוך GFP ניתן לזהות exophers בוגר. (ב)ALM soma ו exopher של מבוגר של זן ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], אשר מבטא mCherry וגורם לגעת בייצור exopher נוירון. 100x המטרה המשמשת לצילום, סרגל קנה מידה 5 μm. (ג)ALM soma ו exopher של מבוגר של זן ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]; ערוץ כחול סלקטיבי המשמש לתמונה של htt57Q128::CFP. exopher מכיל htt57Q128::CFP אגרגטים (חצים), המופיעים מרוכזים יותר exopher מאשר בסומה. 40x המטרה המשמשת לצילום, סרגל קנה מידה 5μm. (D-E) מה אתה עושה? Exophers יכול להכיל organelles תיוג ספציפי organelle עם חלבונים פלורסנט מאפשר ניטור של הבלטת organelle. (D)תג קרום Lysomal LMP-1::GFP מתאר את קרום סומה exopher ותגיות קרום פלזמה חלש (לוקליזציה קרום פלזמה הוא צעד סחר בדרך פילוח lysomal) ותוויות איברים lysomal מאוד. מוצג הוא מבוגר ALM soma שיתוף לבטא Pmec-4mCherry ו Pmec-7LMP-1::GFP כי מיקום לממברנות וליזומים. בסומה יש exopher מצורף עם שבלטים קטנים אחרים סביר להיות שברי exopher (חצים). מבנים חיוביים GFP כלולים בסומה והם נוכחים exopher גדול, זן: ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]. 100x המטרה המשמשת לצילום, סרגל קנה מידה 5 μm. E) סמן GFP מיטוכונדריאלי יכול לשמש לזיהוי המיטוכונדריה בסומה ואקסופרים. מוצגת זו ALM סומה בוגרת המביעה Pmec-4mCherry ו- mito::ROGFP, אשר באופן מקומי למטריצת המיטוכונדריה. מיטו::ROGFP מבוטא לבד, ללא mCherry, יכול לשמש גם בקלות כדי לזהות נוירונים וציון עבור exophers הכוללים מיטוכונדריה. זן: ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]. יעד 100x המשמש לצילום; סרגל קנה מידה 5μm. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: מחזור התפתחותי של זיהוי C. elegans ו- L4. (א)ב 20 מעלות צלזיוס ביצה לוקח כ 9 שעות לבקוע פעם אחת הניח על ידי האם. (ב)חיה שזה עתה בקעה נמצאת בשלב זחל 1 (L1) ומולט לתוך זחל L2 לאחר 12 שעות. (ג)בעלי חיים נשארים בשלבי הזחלL2וה-L3 למשך כ-8 שעות כל אחד. (ה)בעלי חיים מתבגרים נחשבים לשלב הזחל הרביעי (L4) מסומנים על ידי פות מתפתח בולט המופיע בסהר לבן ליד הגוף האמצעי. הנוכחות של זה בעוד הסהר מאפשר זיהוי קל ואיסוף של בעלי חיים מבוימים L4 להקים תרבויות מסונכרנות כי מאוחר יותר להקל על הבקיע עבור exophers. בעלי חיים נשארים בשלב L4 כ-10 שעות לפני ההטות הסופיות שלהם למבוגרים, F) המזוהים על ידי פיתוח ביצים, זרעון גלוי, וחניכה של הטלת ביצים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: הכנת משטח אגר שקופית מיקרוסקופ. (A)הכן שתי שקופיות עם רצועה אחת של סרט מעבדה הממוקם לאורך על פני החלק העליון. מקם שקופית מיקרוסקופ לא מודבקת באמצע כתמונה. ב)מניחים טיפה של אגרוז מותך על גבי המגלשה. (ג)מניחים שקופית נקייה בעדינות על גבי הטיפה, לוחצים על ה-agarose לתוך משטח עיגול מנופח. (ד)הסר את השקופיות המודבקות, אשר פועלות כדי לבצע שיטוח שווה של agar הדרוש כדי ליצור משטח שווה. (ה)הסר את השקופית העליונה לאחר כרית agarose התייבש. (F)פיפטה פתרון משתק (levamisole או טטרמיסול) על גבי כרית אגר. בחרבעליחיים מבוימים כראוי לתוך המשתק. (H)לכסות בעדינות את בעלי החיים עם כיסוי ולוודא בעלי חיים בחיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: תווים של אקסופרים וקריטריוני זיהוי אקסופר. (א)קריטריונים כלליים המזהים אקסופר. (ב)השוואות קוטר בין סומה השולח exopher exophed, נמדד μm. מבוגר ALM somas, N = 35, זן: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] - 6.53 μm גודל ממוצע של soma ו 3.83 μm גודל ממוצע של exopher. (ג)הגדרת קריטריונים להבדיל בין תחום אקסופר לבין ניצן ניצנים. (ד)בדרך כלל, נוירונים בודדים לעשות exopher אחד גדול, אשר מאוחר יותר פיצולים או שברים כמו hypodermis מנסה לבזות את תוכנו. עדיין, exophers מרובים ניתן לצפות ליד נוירון מגע אחד שעשוי להפיק או אירועים exopher מרובים מנוירן אחד או לחילופין, exophers יכול גם ניצן או שבר עצמם. ניתן לקבוע את המקור של ישויות מרובות הדומה ל exopher רק באמצעות מיקרוסקופית זמן לשגות. העליון מתאר ALMR מגע נוירון סומה עם exopher רחוק אחד. התחתית מתארת סומה נוירון מגע ALMR עם שבלטים כמו exopher מרובים. (ה)תכונות מורפולוגיות נפוצות בסומס נוירון מגע ALM למבוגרים כי ייתכן בטעות עבור אירועים exopher. למעלה משמאל - Soma ALM נפוח, ללא תחום exopher ברור או אתר כווית. אמצע עליון - נוירונים יכולים להיות בלטות חוץ תאיות קטנות שעשויות להיות מקבילות exophers, אבל לא עומדים בקריטריונים דרישת גודל להיחשב exopher. למעלה ימין – עם הגיל, נוירונים מגע יכול לפתח outgrowths לאורך neurite קטין שלהם. לעתים קרובות ניתן לאסוף חומר mCherry בקצה הנורייט outgrowth. זה לא הבקיע כאקסופר אם mCherry שנאספו אינו עומד בדרישות גודל exopher-to-soma. תחתון מתאר נוירונים ALM למבוגרים בעלי קריטריונים מגדירים עבור תחום exopher או exopher. בוטום משמאל - ALM סומה בעל תחום exopher בולט הכולל באופן סלקטיבי mCherry cytosol ו mCherry מתויג אגרגטים. אתר ההתכוויות של קבוצת התחום exopher מסומן בחצים ועונה על קריטריוני הגודל(לפחות 1/5 בגודל של סומה). הקוטר הגדול ביותר של תחום exopher הוא כמעט 1/3 גדול יותר מאשר הקוטר של אתר ההתכוחלות, עמידה בקריטריונים עבור אירוע exopher. תחתית באמצע - ALM soma בעל exopher ניצנים בולט העומד בקריטריונים גודל. יש אתר כווית ברור. מימין למטה. ALM soma בעל exopher mCherry מצורף שעונה על דרישות גודל exopher. האקסופר מחובר על ידי נימה חיבור דקה. כל התמונות הן מזן ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

האפיון של המנגנונים המולקולריים vivo של חיסול צבירה אורגנל בצורה של exophers גדול הוא בחיתוליו. שאלות לגבי ייעוד המטענים לגירוש, האיסוף המקוטב של מטענים אלה בתוך התא, הרגולציה של ההחלטה לייצר exophers, המכונות המתווכות שבלטים, ואת האינטראקציה של exophers עם מכונות משפילות בתא השכן כל להישאר לטפל. יתר על כן, הדמיית vivo של קשרים צינוריים שיכולים להעביר חומרים ביולוגיים הכוללים סידן, אגרגטים, ומיטוכונדריה היא ביולוגיה מעניינת ולא מבוקרת בזכות עצמה. שאלות מדוע תאים מסוימים נוטים יותר exopher ייצור מאשר אחרים גם אינם פתורים, אבל יכול להתחיל להיות גנטית לנתח עם הגישות המתוארות בפרוטוקול זה.

מתואר בפירוט בפרוטוקול זה הם הגישות להשגת ניקוד לשחזור של ייצור exopher, עם תשומת לב להבחנה exophers מסומס תא סמוך, תזמון של ניתוחים כדי ללכוד שיא של ייצור exopher, ושליטה קפדנית של תנאי צמיחה כדי לחסל לחצים לא מכוונים שיכולים לווסת את רמות exopher. שתי ההבחנה של exopher מוקדם גדול, או "לילה כוכב" פיזור ב hypodermis שמסביב יכול להיות כמותי כעדות של ייצור exopher. עם זאת, נוירונים המביעים mCherry בתנאים בסיסיים קשורים בדרך כלל עם 5-25% של נוירונים מסוג מסוים לייצר exopher. מבוא מבוקר של תנאי מתח יכול להיות מיושם כדי להגדיל את ייצור exopher לזיהוי גבוה ככל 90% של נוירונים לייצר שחוליות, שימושי במיוחד עבור מסכים גנטיים או תרופתיים עבור משנה.

במחלה ניוונית אנושית, אגרגטים גדולים יכולים לעבור מנויונים מונתיים ים לתאים סמוכים כדי לקדם התפשטות פתולוגיה. מנגנון האקסופר עשוי לעבור באמצעות מנגנון שומר המשמש להבלטה מצטברת על פני פילה. הגדרת מולקולות vivo כי גם לשפר את היעילות של תהליך זה (נחשב שליטה פרוטאוסטזיס יעיל יותר) או לחסום אותו עשוי להיות רתום כדי להשפיע על עיצוב אסטרטגיות חדשניות למאבק במחלות ניווניות מרובות. ככזה, הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש עבור מסכי מוטגנזה גנטית קלאסית, מסכי RNAi הגנום כולו כי באופן שיטתי להפיל גנים כדי לזהות משפרי ומדכאים, או עבור מחקרים התערבות סמים המזהים משנה פרמקולוגי מועמד של תהליך זה. הגישה היא פשוטה, אם כי קצת מייגעת. Exophers הם כל כך גדולים שהם יכולים לצפות עם מיקרוסקופ ניתוח הגדלה גבוהה. ובכל זאת, C. elegans נוירונים הם קטנים יחסית ומסתכלים organelles שלהם או קרום שלהם דורשים תמונות קונפוקליות כוח גבוה יותר והוא תהליך איטי. אפשרויות לתפוקה גבוהה יותר עשויות לכלול גישות הדמיית תוכן גבוהות בתבנית צלחת מרובת בארות.

היישום של גישה מתוקננת לניקוד exopher צריך בבסיס ניתוח גנטי מתואמות של התהליך שבו נוירונים יכולים לארגן ולחסל פסולת תאית.

Disclosures

ללא

Acknowledgments

אנו מכירים במענקי NIH הבאים: R01AG047101 ו- R37AG56510. חברי מעבדות דריסקול וגרנט תרמו רבות לפיתוח ולכוונון עדין של פרוטוקולים המתוארים, עם ניסויים קפדניים ותקשורת חזקה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
95B Scientific CMOS camera Photometrics Prime
1,000 μL low retention tips Sarstedt
10 mL serological pipette Appleton Woods CC214
10 μL low retention tips Sarstedt 70.1130.105
13% sodium hypochlorite Acros Organics AC219255000
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-12
2 L erlenmeyer flasks Scientific Laboratory Supplies FLA4036
25 mL serological pipette Appleton Woods CC216
300 μL low retention tips Sarstedt 70.765.105
50 mL serological pipette Appleton Woods CC117
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% Alfa Aesar L16497.ME
9 cm sterile Petri dishes Fisher Scientific 11309283
absolute ethanol Vwr 20821.33
Agar Sigma Aldrich A1296
C. elegans strain wild type Supplied by CGC N2 C. elegans strain
calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C3881
cholesterol Acros 110190250
dibasic sodium phosphate Sigma Aldrich S3264
E. coli strain OP50 Supplied by CGC Op50 E coli strain
FBS10 Standard microscope Meyer Instruments KSC 410-1-100-1 FBS10 Standard with Plate Base, 100/100 Trinocular Head and Flip zoom
glass pipette 270 mm Fisherbrand FB50255
Heraeus Multifuge X3R Thermofisher scientific 75004515
Inoculating Spreaders Fisher Scientific 11821741
LB medium capsules MP biomedicals 3002-031
LDI – Laser Diode Illuminator 89 North
levamisole Sigma Aldrich 16595-80-5
M4 multipette Eppendorf 4982000012
magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
monobasic potassium phosphate Sigma Aldrich P0662
Multitron Standard shaking incubator Infors HT INFO28573
Nalgene 1 L Centrifuge pots Fisher Scientific 3120-1000
P10 pipette Eppendorf Research Plus 3123000020
P1000 pipette Eppendorf Research Plus
P200 pipette Eppendorf Research Plus 3123000055
pipeteboy 2 VWR 612-0927
Polystyrene microbeads Sigma Aldrich MFCD00131491
RC5C plus floor mounted centrifuge Sorvall 9900884
Reusable ringed cytology slides ThermoFisher Scientific 22037242
SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP] contract Driscoll lab GFP expressed in touch neurons
sodium chloride Sigma Aldrich 13422
Sodium hydroxide Fisher Chemical S/4880/53
Tactrol 2 Autoclave Priorclave
Triton-X Thermofisher scientific 28313
Tween 20 Sigma Aldrich 9005-64-5
X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit CrestOptics
ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] contract Driscoll lab mCherry expressed in touch neurons
ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+] contract Driscoll lab Q128 expressed in touch neurons
ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] contract Driscoll lab mitoROGFP expressed in touch neurons
ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] contract Driscoll lab autophagy marker expressed in touch neurons
ZEISS Axio Vert.A1 Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davis, A. A., Leyns, C. E. G., Holtzman, D. M. Intercellular Spread of Protein Aggregates in Neurodegenerative Disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 545-568 (2018).
  2. Davis, C. H., et al. Transcellular degradation of axonal mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9633-9638 (2014).
  3. Torralba, D., Baixauli, F., Sanchez-Madrid, F. Mitochondria Know No Boundaries: Mechanisms and Functions of Intercellular Mitochondrial Transfer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 107 (2016).
  4. Stahl, P. D., Raposo, G. Extracellular Vesicles: Exosomes and Microvesicles Integrators of Homeostasis. Physiology (Bethesda, Md.). 34 (3), 169-177 (2019).
  5. Melentijevic, I., et al. C-elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress. Nature. 542 (7641), 367 (2017).
  6. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 9 (3), 1003351 (2013).
  7. Tyson, T., et al. Novel animal model defines genetic contributions for neuron-to-neuron transfer of alpha-synuclein. Scientific Reports. 7, (2017).
  8. Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 5427-5433 (2015).
  9. Pearce, M. M. P., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain. Nature Communications. 6, 6768 (2015).
  10. Fu, H., Li, J., Du, P., Jin, W., Cui, D. Metabolic wastes are extracellularly disposed by excretosomes, nanotubes and exophers in mouse HT22 cells through an autophagic vesicle clustering mechanism. bioRxiv. 10 (1), (2019).
  11. Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2. PLoS Genetics. 9 (12), 1004063 (2013).
  12. Cannon, M. B., Remington, S. J. Redox-sensitive green fluorescent protein: probes for dynamic intracellular redox responses. A review. Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2008).
  13. Perkins, L. A., Hedgecock, E. M., Thomson, J. N., Culotti, J. G. Mutant sensory cilia in the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 117 (2), 456-487 (1986).
  14. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).
  15. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  16. Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of Gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
  17. Weicksel, S. E., et al. A novel small molecule that disrupts a key event during the oocyte-to-embryo transition in C. elegans. Development. 143 (19), 3540-3548 (2016).
  18. Dong, L., et al. Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms. PloS One. 13 (3), 0193989 (2018).
  19. Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
  20. Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. RNA Interference in Caenorhabditis elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 109, (2015).
  21. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  22. Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. Large-scale gene knockdown in C. elegans using dsRNA feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50693 (2013).

Tags

מדעי המוח גיליון 163 אקסופרס C. elegans ביולוגיה מזדקנת פרוטאוסטזיס התפשטות מצטברת שידור נוירון לנוירון ניוון עצבי מיטוכונדריה ליזוזה העברת אורגנל
גישות כמותיות <em>לניקוד ב-vivo</em> Neuronal Aggregate ו-Organelle הבלטה בוויקות Exopher גדולות <em>ב C. elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. … More

Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans. J. Vis. Exp. (163), e61368, doi:10.3791/61368 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter