Summary
Detta protokoll beskriver tillvägagångssätt för detektion och kvantisering av stora ballast- och/eller organellextruder (~4 μm) som produceras av C. elegansceller i form av membranbundna exophers. Vi beskriver stammar, tillväxt villkor, poängkriterier, timing och microscopy överväganden som behövs för att underlätta dissekering av denna skräp utvisning mekanism.
Abstract
Toxicitet av felvikta proteiner och mitokondriell dysfunktion är avgörande faktorer som främjar åldersrelaterade funktionella neuronal nedgång och neurodegenerativa sjukdomar över arter. Även om dessa neurotoxiska utmaningar har länge ansetts vara cell-inneboende, betydande bevis stöder nu att felvikta mänskliga sjukdomar proteiner med ursprung i en neuron kan visas i angränsande celler, ett fenomen som föreslås för att främja patologi spridning i mänskliga neurodegenerativa sjukdom.
C. elegans vuxna nervceller som uttrycker aggregerande proteiner kan extrudera stora (~ 4 μm) membran-omgiven vesiklar som kan omfatta det aggregerade proteinet, mitokondrier, och lysosomer. Dessa stora vesicles kallas "exophers" och skiljer sig från exosomer (som är ca 100x mindre och har olika biogenes). Kasta ut cellulära skräp i exophers kan uppstå genom en bevarad mekanism som utgör en grundläggande, men tidigare okända, gren av neuronala proteostas och mitokondriell kvalitetskontroll, relevant för processer genom vilka aggregat sprids i mänskliga neurodegenerativa sjukdomar.
Medan exophers har studerats mest hos djur som uttrycker hög kopia transgena mCherry inom beröring nervceller, dessa protokoll är lika användbara i studien av exophergenesis med hjälp av fluorescerande taggade organeller eller andra proteiner av intresse i olika klasser av nervceller.
Beskrivs här är de fysiska egenskaperna hos C. elegans exophers, strategier för deras upptäckt, kriterier identifiering, optimal tidpunkt för kvantisering, och djur tillväxt protokoll som styr för påfrestningar som kan modulera exopher produktionsnivåer. Tillsammans bör uppgifter om protokoll som beskrivs här tjäna till att fastställa en standard för kvantitativ analys av exophers över laboratorier. Detta dokument syftar till att fungera som en resurs på området för laboratorier som försöker utarbeta molekylära mekanismer genom vilka exophers produceras och genom vilka exophers reageras på av angränsande och avlägsna celler.
Introduction
Den neurotoxiska utmaningar aggregat och dysfunktionella mitokondrierna har länge ansetts vara cell-inneboende, men på senare tid har det blivit tydligt att felvikta mänskliga sjukdomar proteiner med ursprung i en neuron kan också sprida sig till angränsande celler, främja patologi1. Likaså kan däggdjursmitokondrierna skickas ut ur cellen av sin ursprungliga produktion för transcellulär nedbrytning2 eller för räddning av mitokondriella populationer i utmanade angränsande celler3. Vesiklar av olika storlekar har i allmänhet observerats för att överföra cellulära material till angränsande celler eller till flytande omgivning4. Vissa extruderade vesiklar närma sig storleken på den genomsnittliga neuronala soma (genomsnittlig touch neuron soma ~ 6 μm) och kan rymma stora aggregat och organeller.
Ett slående exempel på stora vesicle extrusion som kan bära protein aggregat och organeller förekommer i C. elegans touch receptor nervceller som uttrycker en hög kopia nummer reporter konstruera kodning en skadlig aggregering-benägen, nedbrytningsresistenta mCherry5. Utsprång från beröringsnerverna, så kallade exophers, är ~4 μm genomsnittlig diameter, selektivt inkluderar mCherry eller andra aggregat, och levereras direkt in i den angränsande hypodermis, som normalt omger touch receptor nervceller. Hypodermisförsöken lysosomebaserad nedbrytning, men vissa icke-lättsmälta innehåll såsom mCherry aggregat kan åter extruderas av hypodermis i vätskefyllda pseudocoelom av djuret, från vilken mCherry kan tas upp av avlägsna asätare celler kallas coelomocyter för lång tid lagring (Figur 1, Figur 2)5.
De stora extruderade exopher vesiklarna lämnar cellen omgiven av touch receptor plasmamembran och kan innehålla aggregerade mänskliga sjukdomar proteiner, mitokondrier, och lysosomer. Processen för exopher produktion verkar innebära sortering av potentiellt giftiga arter (till exempel en aggregering-benägen uttryckt mCherry är segregerad från lösliga, oförargliga proteiner som GFP som fortfarande mest i neuronala soma). På detta sätt, riktad utvisning av de hotfulla entiteter åstadkoms av neuron5. En proteostas utmaning, såsom stress framkallas genom autofagi knockdown, MG132-medierad proteasom hämning, eller transgena uttryck för mänskliga sjukdomar proteiner såsom Huntingtons sjukdom-associerade expanderat polyglutamine Q128 eller Alzheimers sjukdom-inblandade fragment Aβ1-42, kan öka antalet nervceller som producerar exophers5.
Som exophers har först nyligen dokumenterats, vad som är känt om deras biologi meriter beskrivning. Exophers upptäcktes i, och är de mest väl studerade i, C. elegans touch receptor nervceller. Det finns sex C. elegans mechanosensory touch nervceller som har cellkroppar fördelade runt kroppen ( Figur3A) och kallas mikrotubuliceller eftersom deras ultrastruktur funktioner särskiljande 15 protofilament mikrotubuli. Den beröring receptorn nervceller är den främre AVM (främre ventrala microtubule neuron), ALMR, och ALML (främre laterala microtubule nervceller höger och vänster), den mer centrala PVM (posterior ventrala microtubule neuron), och den bakre PLMR och PLML (posterior laterala microtubule nervceller höger och vänster) i svansen. Intressant, de sex touch receptor nervceller producerar exophers i olika takt, trots att uttrycka samma offensiva transgena (Figur 3C). Av de sex mechanosensory touch receptor nervceller, genomgår ALMR neuron exophergenesis oftare än de andra touch nervceller. Quantitation av exopher nummer från beröring nervceller är alltså vanligtvis fastställts genom att fokusera på ALMR.
Exophergenesis är en dynamisk process som typiskt börjar med svullnad av neuronal cytoplasman (Figur 1A-B). Cellulära innehåll, organeller, eller protein aggregat samlas in på ena sidan av neuronala soma, oftast mot den bakre änden av ALMR neuron (bort från den utplanande neurit), bildar en pre-exopher domän (PED) (Figur 1B). Den tidiga utskjutningen observeras när PED börjar projicera utåt och bildar en igenkännlig utstickad knopp. Den sena knoppen definieras när den bredaste diametern på domänen före exopher är ungefär 1/3 större än diametern på förträngningen av soma-exopher-halsen (Figur 1C). Exophers kan kastas ut i nästan vilken riktning som helst från soma, men de flesta exophers avsluta posteriorly från cellen kroppen och förbli i ungefär samma fokalplan som den ursprungliga soma.
Exopheren kan flytta bort från den påbörjande soma som halsen av knoppen smalnar in i en tunn glödtråd. Exophers kan förbli fäst vid soma via denna glödtråd (Figur 1D, pil) och kan senare bli fristående. Cellulära innehåll som kalcium, aggregat, och mitokondrierna kan överföras via denna glödtråd i den bifogade exopher5, även om huvuddelen av extruderade material sätts in i exopher facket av den massiva spirande händelsen. Exophers anses mogna när det inte finns något synligt anslutningsrör eller tunt glödtråd och exopher är helt skild från den sändande soma (bild 1E).
Exophers produceras av C. elegans touch nervceller omedelbart stöter på hypodermis, den vävnad som omger touch neuron. Vanligast verkar exopher vesikeln att resa inom hypodermis posteriort mot svansen, och kan vara ganska långt från soma innan exopher innehåll visas riktade för nedbrytning (till exempel, avståndet kan vara ~ 100 μm bort från soma (Figur 1F)). Den fluorescerande exopher vesikel bryts upp i många mindre vesiklar inom hypodermis, ta på ett utseende som kallas "stjärnklar natt" (Figur 1G och figur 2). I "starry night" scenen, punktat fluorescerande material kan observeras utspridda över hypodermal syncytium i många mindre punkter av fluorescens jämfört med den ursprungliga ensamma exopher. Stjärnklar natt kan se punktat under låg förstoring och med högre förstoring, kan se punktat och / eller nätverk inom hypodermis. Den stjärnklara nattens lysrörssignal är typiskt dimmer än exophern och den neuronalt uttryckta fluorescensen (Figur 2B-C). Spridningen av mCherry i många punktat vesiklar är tänkt att involvera phagosome mognad och fusion med endosomal/lysosomal nätverket av hypodermal cellen. Vissa exopher material är sannolikt försämras i det hypodermala lysosomalt nätverk, men kvarvarande arter som är resistenta mot nedbrytning (såsom mCherry aggregat) kastas ut ur hypodermis i pseudocoelom, en vätska fack som kan innehålla cellulära skräp. Det fluorescerande materialet tas senare in av avlägsna asätare celler som kallas coelomocyter (Figur 2C), som kan koncentrera sig, lagra, och återigen försök nedbrytning av mCherry.
Fenomenet med ballast extrudering och överföring verkar bevaras över phyla, har rapporterats i genetiska modeller som C. elegans5,6,7 och D. melanogaster8,9 samt i flera däggdjur modeller. Exopher-liknande extruderingar har rapporterats för däggdjursceller10, en observation som tyder på att bevarade mekanismer kan stödja aggregerade och organelle utvisning. Exopher produktion kan alltså vara en bevarad mekanism för cellulära skräp förvaltning som utgör en grundläggande, men tidigare okända, gren av neuronala proteostas och mitokondriell kvalitetskontroll, som, när obalans, kan aktivt bidra till neurodegenerativ sjukdom. Identifiering av de molekyler som är inblandade i skräp diskriminering och sortering, transport till en distinkt subcellulär lokal, extrudering, bildning / sax av den rörformiga anslutningen som förbinder soma och sen exopher, och erkännande av de stora extruderade vesikel för avlägsna nedbrytning av en angränsande cell kvar för framtida arbete. Studier i nematod och flyga modeller kommer att vara avgörande för att definiera mekanismer för aggregat och organell insamling och överföring, utnyttja opartiska genetiska metoder och kraftfulla cellbiologiska verktyg som erbjuds av dessa modeller för att identifiera deltagande molekyler i fysiologiska sammanhang.
Kritiska första stegen i dechiffrera mekanismer avgörande i exopher biologi innebär att definiera protokoll för reproducerbara in vivo exopher kvantifiering. C. elegans modellen erbjuder en särskild fördel för sådana insatser eftersom kroppen är transparent och exophers kan lätt observeras när de innehåller fluorescerande taggade proteiner eller organeller. Exophers har rapporterats genereras av C. elegans dopaminerga nervceller PDE och CEP, ASE och ASER sensoriska nervceller, och färgämne-fyllning amphid nervceller5. Eftersom exophers produceras av touch-receptorn nervceller är bäst kännetecknas, fokus här är på användning av beröring nervceller för exopher analys. Men den grundläggande metoden kan tillämpas för att mäta exopher produktion från någon cell. Protokoll för att upptäcka och kvantifiera exophers produceras av C. elegans touch receptor nervceller som transgeniskt uttrycka mCherry protein beskrivs, med betoning på laster som kan övervakas och tidsmässiga begränsningar i scoring. Denna artikel definierar tillvägagångssätt mot in vivo exopher identifiering, och kvantifiering av miljömässiga och genetiska förhållanden som modulerar exopher produktion. Protokoll betona kritisk uppmärksamhet på konstant icke-stress villkor för bestämning av baslinjen exopher produktion och för jämförelser över genotyper.
Protocol
1. Stammar användbara för exopher upptäckt
- Välj en stam som uttrycker fluorescerande laster inom neuronerna i C. elegans för att lätt visualisera exophers.
OBS: Tabell 1 listar stammar som har använts för att visualisera exophers produceras i touch receptor nervceller5,11,12. I princip kan någon cell eller neuronal typ testas för exopher produktion genom att använda en cell eller vävnad specifik promotor att driva uttryck för ett fluorescerande protein som aggregat eller på annat sätt väljs för strängsprutning. - Alternativt, använd en färgämne-fyllning assay att visualisera exophers i amphid huvudet nervceller, som är öppna för miljön och mottagliga för återfyllning5,13.
2. Tillväxt media
- Förbered standard nematodtillväxtmedia (NGM) till odlingsstammar enligt standardmetoder14,15.
OBS: Brist på mat, eller fluoro-deoxyuridin (FuDR), används vanligen för att blockera avkomma produktion, och kan dramatiskt påverka exopher produktion. Håll befolkningen kontinuerligt utfodras (undvika även korta perioder av bakteriell matutmatning) och underhålla djur vid en konstant temperatur.
3. Djurhållning kritisk för konsekvent exopher produktion
- Höj djur på konsekvent media och med konsekvent bakteriell matkällor. Djuren får inte få på bakteriemat, inte ens under korta perioder eftersom begränsning av livsmedel dramatiskt kan förändra exopherproduktionsnivåerna.
- Håll media recept och beredning enhetlig under hela en studie.
OBS: Att byta media kan påverka basala nivåer av exopher produktion. Agar partier kan påverka baslinjen exopher nivåer, så när utbudet partier förändras, göra en anteckning om datumet. Kasta ut lager plattor efter två veckor för att säkerställa hälsosam bakteriell mat och för att förhindra torkad agar, vilket orsakar förändringar i agar osmolaritet som påverkar exopher nivåer. - För basala förhållanden, håll djuren vid en konstant temperatur på 20 °C. Uppfödning av djur vid variabla temperaturer (även tillfälliga förändringar i temperatur) kan orsaka variationer i tidpunkten för maximal exopher produktion.
OBS: Temperaturvariabiliteten är inte begränsad till odlingsförhållanden. Temperaturer variationer under experiment eller på labbet bänken kan vara effektfulla. Till exempel bör temperaturer inom ett mikroskop rum inte skilja sig dramatiskt från kulturen inkubator eller lab bänk. - Använd inte farmakologiska anti-fertilitet interventioner eftersom befruktade ägg är kritiska för tidig vuxen produktion av exophers.
OBS: Användning av Fluoro-deoxyuridin (FuDR)16 eller C2217, måste undvikas. När man utför livslängden eller gamla djurförsök bör ålderssynkronerade populationer upprätthållas genom att fysiskt avlägsna vuxna från deras mindre avkomma genom att plocka dem på färska plattor som sprids med bakterier i stället för att använda vanliga farmakologiska anti-fertilitetsinterventioner. - Använd inte förorenade kulturer; återitiera experiment i händelse av biologisk kompromiss av populationen eller plattan. Bakterie- eller svampkontaminering kan framkalla påfrestningar och metaboliska förändringar hos djur och måste vara frånvarande från experimentella populationer.
- För att maximera reproducerbara resultat, bibehålla kulturer för minst två friska, välnärda, kontamineringsfria generationer vid 20 °C före experiment för att undvika potentiella miljöinducerade epigenetiska förändringar.
4. Ålderssynkronisering för exopher scoring genom blekning, sackaros flotation, eller L4 larver plockning
- Håll experimentella populationer i samma biologiska ålder, eftersom exopher detektionsmönster varierar med vuxen ålder och jämförelse av djur av blandade ålderspopulationer kan förvirra resultat. Säkerställ alltid framgångsrik synkronisering av experimentella djurpopulationer genom att kontrollera om "vit halvmåne" vulva morfologi på L4-scenen.
OBS: Generellt sker toppexopherproduktion för C. elegans mechanosensory ALMR nervceller på vuxen dag 2-3 (Figur 3D), mätt från dagar efter L4-stadium. Vuxen dag 1 är 24 timmar efter L4 larvstadiet som utmärks av "white crescent" vulvamorfologi (Figur 5E). - Förbered synkroniserade äggpopulationer genom blekning gravid vuxna.
- Samla gravid vuxna fylld med ägg genom att tvätta djur som växer på en NGM tallrik. För att tvätta, översvämma plattan med 1 mL M9 buffert, pipet upp och ner för att samla vätska med upphängda djur och pipet i en 1,5 mL microcentrifug röret. Pelletdjur genom gravitationssvängning eller mild centrifugering med en minicentrifug och avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 150 μL av 5M NaOH och 150 μL av 6% natriumhypoklorit (blekmedel) i 1 mL i H2O och blanda genom inversion i cirka 5 minuter.
OBS: Färsk blekningslösning säkerställer att djurets nagelband kan störas för ägg-skörd. Framsteg i att störa nagelbanden kan övervakas under en dissekera mikroskop; vuxna ska bryta och släppa ägg vid den punkt som blekning bör stoppas. - Försiktigt centrifugera med ett minicentrifugrör i 20 s och ta bort supernatanten. Tillsätt 1 mL M9 buffert och centrifugera igen, och lämna ca 100 μL ovanpå pelleten.
- Upprepa steg 4.2.3 två gånger för att avlägsna spår av blekmedelslösning.
- Resuspend äggen i den återstående volymen och överför till en färskfrö NGM tallrik. Vuxna kommer att lysed, men många livskraftiga ägg bör vara i beredningen.
- Förbered synkroniserade populationer genom tidsansed ägg-lay.
- Plocka 20 gravid vuxna till en sådd NGM platta med hjälp av standard överföringsprotokoll14.
- Tillåt djur att fritt krypa och lägga ägg i 1,5 h (mutantstammar med låga yngelstorlekar kan kräva att fler vuxna djur införs).
- Ta bort alla vuxna djur från plattan genom att plocka, lämnar synkroniserade äggpopulationen bakom. Kontrollera plattor några timmar senare för att kontrollera att inga livskraftiga vuxna har missats under vuxen borttagning.
- Förbered synkroniserade äggpopulationer genom sackaros flotation urval av ägg.
- Samla djur och ägg från fem NGM-plattor på vilka graviddjur har lagt ägg i minst 24 timmar genom att översvämma plattor med M9-lösning med 0,1% tvättmedel (såsom Tween 20 eller Triton X-100) och samla in i ett 15 mL-rör. Pellet vuxna genom skonsam centrifugering vid rumstemperatur (2 000 x g i 30 s).
- Ta bort supernatant och tvätta djur i 15 mL färsk M9 tre gånger, kassera supernatanten efter varje tvätt, se till att hålla pelleten berikad i djur och ägg.
- Behålla 2 mL supernatant och resuspend pelleten. Tillsätt 2 mL av 60% vikt i volym sackaros.
- Centrifugera vid 2000 x g i 5 min. Lösningen kommer nu att visa en övre fas som är berikad i ägg.
- Överför ca 2,5 mL av den övre fasen till ett nytt 15 mL-rör och tillsätt 10 mL M9.
- Blanda genom inversion i 1 min, och sedan centrifug 2000 x g i 1 min.
- Ta bort supernatanten och tvätta den äggberikade pelleten i M9. 10-15 μL av ägg-pelleten kan distribueras till en färsk OP50-seedad NGM-platta.
OBS: Denna metod förbereder ett stort antal ägg; inte låta insamlade djur få på OP50 E. coli-mat.
- Förbered synkroniserade populationer genom att plocka djur i L4-utvecklingsstadiet.
- Odla djur på sårade NGM-plattor enligt ovan.
OBS: C. elegans utvecklas i fyra diskreta etapper. Vid 20 °C tar ett nylagt ägg ca 9 timmar att kläckas (Bild 5A). Postlucka, ett djur passerar genom larvstadiet 1 (L1) till larvstadium 4 (L4), med varje stadium som varar 8-12 timmar mellan varje molt (Figur 5A-F). Därför bör en tallrik som bereds genom inokulering med ägg ha många L4-djur att plocka ca 40 timmar efter det att ägg införs. - Identifiera L4-iscensatta djur genom att lokalisera den vita halvmånehalvmåneformen på den utvecklande vulva (Figur 5E).
OBS: Djur på L4-stadiet är enhetliga i storlek och i kroppspigmentering. Plocka djur med den vita halvmånen till en ny tillväxtplatta för undersökning av iscensatta djur. Följande dag (~ 24 timmar senare) ska räknas som vuxendag 1. - Betyg en population av djur dagligen på vuxen dag 2.
OBS: Exophers är vanligtvis poäng på dag 2 i vuxen ålder, vilket är toppen exopher produktion under basala förhållanden. Men eftersom exophergenesis topp och timing kan förskjutas av miljömässiga eller genetiska förändringar som studeras, det rekommenderas att värdering en population av vuxna djur dagligen under fyra dagar för att generera den mest omfattande bild (Figur 3D).
- Odla djur på sårade NGM-plattor enligt ovan.
5. Detektion av exophers med hjälp av ett fluorescerande mikroskop
- Observera exophers med hjälp av en hög förstoring pseudo-stereo dissekera mikroskop som är utrustade för fluorescens mikroskopi.
- Immobilisera djur på NGM-plattor genom pipettering av 100-200 μL av 10-100 mM levamisole/tetramisolelösning på NGM agarplattas yta. Efter 2-4 minuter blir djuren förlamade och kan observeras direkt på agarplattan.
OBS: Immobilisering behandlingar är inte absolut krävs, så att med ett tränat öga, neuronal identifiering och exopher närvaro kan poängsas genom att visuellt följande krypande djur under mikroskopet på plattan vid fastställandet av om en exopher har producerats eller inte. - Observera fluorescerande nervceller med hjälp av en total förstoring av 100x att åstadkomma dissekera mikroskop upptäckt av exophers.
OBS: Scoring exopher händelser med hjälp av dissekering mikroskopi möjliggör observation av stort antal djur med relativ lätthet direkt på agar plattorna på vilka de föds upp. - Live imaging och montering reporter stammar för exopher studier med confocal mikroskopi
- Använd en confocal mikroskop till live-bild intracellulära dynamik och egenskaper hos exophergenesis.
OBS: Live imaging är ett fördelaktigt tillvägagångssätt för att observera subtila detaljer i Exopher produktion eftersom Exopher produktion är en dynamisk process. - Begränsa djurrörelse för hög upplösning live imaging med hjälp av bekväma metoder, inklusive utnyttjande av levamisole eller tetramisole vid 10-100 mM eller applicering av hydrogel polystyren mikropärlor (med diametrar på 15 μm, 30 μm eller 40 μm)18.
- Använd en confocal mikroskop till live-bild intracellulära dynamik och egenskaper hos exophergenesis.
- Glidberedning för sammansatt och konfokal mikroskopi
- Montera 20-50 djur i ett immobiliserande medel på ett mikroskopglas. Återanvändbara ringade cytologi diabilder målade med 13 mm diameter höjd-ringar är användbara för montering.
- Plocka levande djur i 5-20 μL av en paralytisk som 10-100 mM levamisole eller tetramisole inom den målade cirkeln eller på agarpaden.
- Vänta 4 minuter för förlamning, och täck sedan täck in objektglaset med ett täckskydd (rekommendera nr 11/2 (0,16 – 0,19 mm) eller nr 2 (0,17 - 0,25 mm).
- Montering av litet antal djur
- Krossa inte monterade djur; vid observation av endast ett fåtal (mindre än 20) djur per objektglas finns risk för att vissa av djuren krossas på grund av ojämnt tryck från täckslipet. Denna risk kan minimeras genom att använda en låg procentuell agarose pad för montering.
- Gör en 2-4% agarospadsglas, och tillsätt sedan 2-15 μL paralytisk lösning till dynan. Tänk levamisole och tetramisole diffusa i dynan, minskar deras effektiva koncentration.
- Montera genom att plocka in djur i en 2-15 μL-droppe paralytisk lösning eller mikropärlor som vilar på agardynan. Placera täckslipet ovanpå och kontrollera att djuren är intakta18.
- Agar pad förberedelse
- För att förbereda 2% agar kuddar, värme 2% agarrose i M9 lösning och mikrovågsugn tills agarrose är i ett homogent och smält tillstånd.
- För att uppnå en agar pad av tillräcklig kvalitet, suppleant blandning och microwaving vid låg effekt i mindre än 20 sekunder. Undvik införandet av luftbubblor i dynan genom att placera kokande agar på ett värmeblock och låta bubblorna stiga till ytan.
- Använd en Pasteurpipett för att dra agar från djupt inne i den smälta lösningen nedanför de uppståndna bubblorna.
- Förbered två tejpade diabilder och placera på vardera sidan av en ren glasmikroskop glida på en plan yta. För att göra de tejpade diabilderna placera två 5 cm remsor av laboratorietejp på varje objektglas (Bild 6A).
- Med hjälp av en Pasteur pipet, placera en enda droppe agar på den rena mikroskop glida inklämt mellan de tejpade diabilder (Figur 6B).
- Täck försiktigt och snabbt över den smälta agarens droppe med en fjärde ren glidning genom att placera in tvärs över de tejpade rutschbanorna (Bild 6Cc).
OBS: Glidbanan ska försiktigt trycka in den smälta agaren i en tillplattad cirkel ca 0,4 mm tjock (tejpens tjocklek) (Bild 6D). Agaren bör snabbt svalna. - Ta bort den övre bilden genom att skjuta av den (Bild 6E). Agar kuddar torka snabbt och används bäst inom några minuter. När den övre bilden är borttagen, använd gelpaden omedelbart för montering av djur. Undvik att använda dynor med luftbubblor.
- Förvara agar kuddar upp till 30 minuter inneslutna mellan de två glasglas. Torkad agar får djur att klumpa ihop sig och torka. Montera djur inom 2-15 μL av paralytisk lösning eller mikropärlor och täck med täckskydd; skärmen bilden inom 20 minuter av förlamning och montering (Bild 6).
OBS: Eftersom stress villkor kan förändra exopher priser, undvika paralytiker som kan framkalla oxidativ stress (ex: natriumazid) vid screening för exophers.
- Detektion av exophers med hjälp av en spinning-disk confocal mikroskop
- Observera cellbiologiska funktioner som organeller och annat innehåll med 1,4 numeriska bländarmål vid 63x och 100x.
- Använd programvara som kan steg-kontroll och bild förvärv utnyttja flerdimensionella förvärvet. Mikroskop och bildbehandling programvara bör också vara lämpliga för bildbehandling och datainsamling eftersom dessa steg innebär standard bildframställning metoder.
6. Identifiera touch nervceller och scoring för exophers med monterade djur
- Montera förlamade vuxna djur (Figur 6).
- Identifiera det önskade Z-planet. Använd låg förstoring bright-field (10-40x) för att identifiera den lämpliga Z-plan av djuret, ta del av placeringen av djuret, huvud-svans orientering, och placering av vulva - som är landmärken för senare neuronal och exopher identifiering (Figur 3A & Figur 5E).
- Fokusera på fluorescenssignalen från den valda reportern. Bo i samma Z-plan, byta till widefield fluorescens visning på 10-40x för den valda cytosolic reporter.
OBS: I detta exempel fluorescerande uttryck drivs av mec-4 mechanosensory touch neuron-specifika promotorn. Hög kopia arrayer, och olika fluoroforer har variabilitet i uttryck och därför variabel fluorescerande intensitet. Justera om det behövs. - Bläddra inom Z-axeln för att observera djurets djup och fluorescerande uttryck i fokalplanet. Medan du gör det, bekräfta huvud-svans orientering; huvudet/svalget kommer att ha lysrörsnerven ring och i detta fall kommer svansen innehålla 1-2 synliga PLM somas (Figur 3A).
- Identifiera touch nervceller
- Identifiera om djuret är monterat till vänster eller på höger sida (Bild 3A).
OBS: Med tanke på djurets 3-dimensionalitet åstadkommer man den bästa bildupplösningen på den sida som ligger närmast optiken. - Identifiera soma (ALM, ALMR, AVM) genom att observera - börja vid huvudet för att identifiera nervringen och laterala neuronala processer.
- Vid 10-40x förstoring, bläddra långsamt igenom Z-axeln för att identifiera den bifogade processen.
- När processen är identifierad, följ den i laterled i den bakre riktningen mot vulva, där soma kommer att vara uppenbart, märkt med en rund cellkropp i slutet av processen. När den mest i-fokus neuronal soma finns, Det kan identifieras genom att använda andra neuronala landmärken enligt följande:
- Använd AVM, en närliggande ventral neuron, för att tilldela djurorientering. Om AVM neuron är i samma plan som ALM då djuret vilar på sin sida och neuron utanför det planet är ALMR . Om AVM neuron inte är i samma plan som ALM i fråga, den närmaste touch neuron till fokalplanet är ALML.
- Identifiera PVM neuron, en annan ventral touch neuron ligger nära svansen, för att ange om den främre touch neuron är i samma plan. Om så är så är berörings-neuron observerats ALML.
- Få en känsla av positionen för andra soma organ, nära området av intresse (fluorescerande nervceller som ligger på vardera sidan av soma), och i alla Z-plan, även om det inte är möjligt att få den djupaste neuron som i tydligt fokus.
OBS: Identifieringen av alla touch neuron somas är viktigt eftersom out-of-fokus soma kan misstas för exophers.
- Identifiera om djuret är monterat till vänster eller på höger sida (Bild 3A).
7. Identifiera och poängsättning för exophers
- När en touch neuron hittas, inspektera den för stora utsprång (exopher domäner) tillräckligt stor för att betraktas som en bud exopher, (nå minst 1/5th storleken på den ursprungliga soma) (Figur 1C).
OBS: Den genomsnittliga exopher åtgärder runt 2-8 μm i diameter, medan den genomsnittliga soma av en (ZB4065 bzIs166[Pmec-4::mCherry]) djur åtgärder 6-10 μm i dag 2 vuxna (Figur 7B). - Om ingen knopp eller exopher domän observeras, inspektera neuronal soma för en bifogad tunn glödtråd som härrör från soma. Bifogade exophers tenderar att vara belägna närmare den ursprungliga soma och i ett liknande Z-plan.
OBS: Exophers inte alltid förbli fäst vid soma. Detektering av en bifogad glödtråd är en definitiv indikation på att objektet är en exopher. - För att identifiera en oansenterad exopher, leta efter innehållet i en exopher. Exophers kan koncentrera utstötta fluorescerande proteiner och är därför ofta ljusare än somaen.
OBS: Innehållet i exophers är heterogena och varierande. Cellulära organeller som lysosomer och mitokondrier kan också extruderade inom exophers (Figur 4C-E). - Leta efter obundna exophers i olika fokalplan än det plan där den ursprungliga soma hittades. Även exophers har setts att sticka ut från ALM soma i någon riktning, är det typiskt att exophers sticker bort från soma, i en bakre riktning från den neuronala processen.
- Kontrollera om det finns stora, sfäriska objekt som inte är placerade och identifieras som neuronala somas. Exophers kan vara oregelbundet formade men är typiskt sfäriska strukturer. Exophers blir försämrade med tiden, så äldre exophers tenderar att ha en mer oregelbunden form.
OBS: Mogna eller äldre exophers är åtskiljda från den spridda "starry night" scenen via ljusare fluorescens intensitet av exophers och deras sfäriska form. - Undersöka "starry night" fenotyp som bevis på tidigare exophergenesis. Exophers framsteg in i en "stjärnklar natt" skede som exopher bryter upp i mindre vesicles och den omgivande hypodermis försök att försämra exopher innehåll (Figur 1G, 2B, 3B & 7A).
OBS: Den stjärnklara natt scenen är märkt av fragmenterade och spridda (ibland nätverksanslutna) fluorescerande enheter som har förlorat strukturella integritet och visar en dim fluorescens i jämförelse med touch nervceller och exopher strukturer. - Leta efter förekomster av "flera exopher-händelser". Exophers produceras vanligtvis som en singular förekomst (1 exopher som utgår från 1 soma) men under vissa omständigheter mer än en exopher kan frigöras från en enda soma (Figur 7D).
OBS: Mogna exophers kan försämras till flera vesicles som de bryts ned i hypodermis. Skilja om varje exopher genererades av en oberoende exophergenesis händelse eller om en ursprungliga exopher split för att skapa en ytterligare vesicle kan endast fastställas genom time-lapse observation. - Tänk på att inte alla morfologiska avvikelser mognar till exophers.
- Gör inte poäng en utspänd soma som en exopher. En förlängd eller spetsig soma kan observeras vid tillfälle (särskilt med ålder eller under stress), men en förlängning utan en tydlig förträngning webbplats inte poäng som en exopher.
- Förkasta små lösta knoppar som inte uppnår1/5-th storleken på soma i exopher händelsekvantifiering.
- Räkna inte neuritutväxter som exophers. Mogna neuriter kan sträcka sig dramatiskt med åldern (vanligtvis i motsatt riktning av den neuronala processen) och fluorescerande protein kan migrera in i den distala änden av sådanastrukturer 19.
OBS: Dessa neurit utväxt är inte exophers eftersom de har en distinkt utvecklingsmönster över dagar och veckor, inte bildar knoppar, och inte lossnar (Figur 7E).
- Identifiera fluorescerande entiteter som inte är exophers.
OBS: Det är viktigt att få en uppfattning om bakgrund fluorescens för att säkerställa korrekt identifiering av extruderad fluorescerande enhet vs. autofluorescens.-
Transgen fluorescerande uttryck vs autofluorescens. Missta inte autofluorescens för transgena uttryck. Den sanna exopher signalen kommer inte att vara i tarmen eller tarmen (DIC bekräftelse kan användas för att identifiera dessa vävnader) och exopher signal kommer att vara betydligt ljusare än bakgrund autofluorescens.
OBS: Autofluorescens orsakas av tarmgranulat intestinal fluorescerande pigmentering och ackumuleras med åldern. Det är heterogent, särskilt som betraktas med olika våglängder. - Signal från embryon. Missta inte embryo signal för exophergenesis. Bekräfta misstankar om embryosignal genom att byta från fluorescens till belysning i Brightfield och kontroll av sammanslutningar av signal med ägg i livmodern.
-
Slut på plan eller närliggande soma kroppar. Undvik att ta miste på en ur plan soma för en exopher genom att identifiera alla närliggande soma organ, även out-of-fokus somas i början av observationen.
OBS: Om scoring för exophers från ALMR, identifiera och redogöra för platsen för AVM och ALMR somas. Mer detaljer om soma kroppsidentifiering beskrivs i figur 3A.
-
Transgen fluorescerande uttryck vs autofluorescens. Missta inte autofluorescens för transgena uttryck. Den sanna exopher signalen kommer inte att vara i tarmen eller tarmen (DIC bekräftelse kan användas för att identifiera dessa vävnader) och exopher signal kommer att vara betydligt ljusare än bakgrund autofluorescens.
8. Poängsättning och statistik
- Betyg exophers som binära (ja, det finns en exopher/no, det finns inte en exopher).
- Betrakta exopher upptäckt som en "exopher-händelse" för en viss neuron. En exopher händelse kan utgöra observation av en enda exopher nära en soma eller flera exophers.
OBS: För att kvantifiera antalet enskilda exophergenesis händelser använder time-lapse observation. - Räkna exopher-händelser per en viss identifierad cell eftersom olika celler inte producerar exophers i samma takt (se till exempel Figur 3C). ALMR nervceller producera mest baslinjen exophers i de stammar som beskrivs häri och därmed ofta är detta den cell som valts ut för exopher kvantifiering från beröring receptor nervceller.
- För statistik, i allmänhet, genomföra minst 3 biologiska försök, av minst 30 djur som poäng per försök med motsvarande antal observationer som krävs för analys av störningen.
- För flera försök som omfattar en eller två mutanter/behandlingar jämfört med kontroll är Cochran- Mantel- Haenszel-testet lämpligt för att bestämma P-värden.
- För försök som omfattar mer än två mutanter av behandlingar jämfört med kontroll, Är det också lämpligt att använda en binär logistisk regressionsanalys för att utvärdera betydelse för valfritt antal kategoriska prediktorer.
Representative Results
Flera fluorescerande reportrar kan användas för att mäta exophers. Touch neuron exophers är lätt visualiseras in vivo via fluorescerande märkning av proteiner som kan väljas för extrudering, genom märkning av organeller som kan extruderas, eller genom märkning cellmembran. Tabell 1 identifierar touch neuron uttryckt fluorescerande reportrar som har använts för att övervaka exophers, med representativa exempel som ingår i figur 4. Laster som är kända för att extruderas i exophers inkluderar en fusion av N-terminal domän av mänskliga huntingtin till expanderat polyglutamin (Q128) (Figur 4B), lysosomer som är GFP-taggade med lysomal associated membran protein (LMP-1) (Figur 4C), och mitokondrier taggade med matris-lokaliserade GFP (Figur 4D). Cytoplasmatiska GFP inte starkt utvisas och är företrädesvis behållas i soma5, även om GFP kan svagt visualisera exophers (Figur 4A). När GFP är smält till proteiner som utvisas, kan denna tagg användas för att visualisera exophers. En viktig punkt är att genom att tagga olika proteiner kan man ta upp ett stort antal frågor om utvisning av specifika laster och organeller samt om de proteiner och membran som utgör exofer.
En pseudo-stereomicroscope setup är ett effektivt verktyg för visning exophers i djur på agar plattor. Denna setup är en hybrid av förening och stereoskopisk teknik som innehåller hög numerisk bländare optik på varje förstoring, pseudo-stereo teknik (diskreta mål över en stereoskopisk bas), och en zoom driftsbrytare för visning vid förstoringar mellanliggande till installerade mål. Ett mikroskop som detta bör vara utrustade med 10x okular och mål kraftfull nog för att observera neuronal morfologi och exopher produktion för hög genomströmning scoring (2x mål som används för skanning / plockning, 10x mål som används för att identifiera och scoring).
Medan förstoring kapacitet standard stereomikroskop har vanligtvis tillräckligt hög upplösning för att se nätverket av touch nervceller uttrycker fluorescerande proteiner, standard dissekera mikroskop är inte tillräckliga för att observera subcellulära detaljer i exophers som de tubulära anslutningar av soma till exopher. Sådana observationer nödvändiggör konfokalmikroskopi (se tabellen över material för utrustningsdetaljer).
Exopher quantitation studier kräver strikta kontroller för att eliminera experimentella påfrestningar. Det uppmärksamma upprätthållandet av konsekventa tillväxtförhållanden krävs för reproducerbar exopherproduktion. Mer specifikt är exopher produktionen stress-lyhörd så att konsekvent utfodring, konstant temperatur, och förorening-fri tillväxt över generationer är avgörande för reproducerbarhet. Under basala tillväxtförhållanden med hög neuronal uttryck för mCherry, exopher produktionen är relativt låg (5-25% av ALMRs producerar exophers) men vissa påfrestningar, inklusive osmotisk och oxidativ stress, kan öka exopher priser. Medan mCherry uttryck kan ses som stress, en följd av stress-känslighet av exopher nivåer är att, om de kontrolleras på rätt sätt, experimentell stress introduktion kan vara en strategi för att lättare inducera och observera exophergenesis.
Timing och förväntade exopher produktionsnivåer. Exophers är praktiskt taget frånvarande under larvutveckling. Perioden av topp exopher produktion i ung vuxen liv verkar vara mycket begränsad till under vuxna dagar 1-4, oftast är uppenbart på vuxen dag 2 eller 3. Eftersom toppen kan skifta framåt eller tillbaka lite, är den mest kompletta utvärderingen av en exopher produktionsprofil att göra mål flera försök dagligen under vuxna dagar 1-4. I allmänhet producerar en ALMR en större exopher, med vesikel kvarstår i minst 24 timmar. Den exopher kan produceras ganska snabbt (på storleksordningen minuter som snabbast). Vanligast, endast en större exopher produceras per neuron i tidigt vuxenliv, men produktion av flera exophers är möjligt.
I allmänhet exopher produktion av ALMRs uttrycker mCherry under basala förhållanden varierar från 5-25% av ALMRs undersökt inom den optimala tidsramen för vuxen dag 2-3 (Figur 3D). Proteostasis kriser5, liksom exponering för andra påfrestningar kan modulera exopher nivå. Stress eller genetiska perturbations kan öka exopher produktionen till detektionsgrad så hög som 90% av ALMR nervceller producerar exopher extruderingar.
Utfodring-baserade RNAi för testning roller av specifika gener i exophergenesis. Den nematod C. elegans är vanligen utsätts för RNAi knock down genom att mata djur omvandlas E. coli stam HT115 som uttrycker en dubbel strandsatta RNA (dsRNA) inriktning en gen av intresse20. HT115 bakterier kan användas när poängsättning för exophers i utfodring RNAi5. Medan utskrifter i de flesta vävnader kan riktas av RNAi med hjälp av denna teknik, nervceller är mer eldfasta. Känslighet för RNAi kan kalibreras med hjälp av djur som uttrycker den transgena dsRNA-transportören SID-1 under en neuronspecifik promotor. På detta sätt neuronal vävnad kan sensibiliseras till RNAi21.
Vävnadsspecifika knockdown av en gen av intresse kan åstadkommas genom att uttrycka en komponent av endogena RNAi metabolism inom en mutant som är bristfällig i den komponenten. Till exempel: Argonaute proteinet RDE-1 kan uttryckas specifikt i nervcellerna hos rde-1-mutanta djur för att uppnå knockdown av en gen av intresse endast i nervceller när djur utsätts för en RNAi-intervention som riktar sig mot den genen.
Använda standard nematod RNAi protokoll20,22, exponering av föräldrarna på L4-stadiet till RNAi och låta deras avkomma att utveckla konsumera omvandlas HT115 bakterier tills vuxen ålder genererar den starka genetiska knock-down men vara uppmärksam på potentiella utvecklingsmässiga förseningar framkallas av RNAi som försöksdjur kan växa annorlunda än en tom vektor kontroll. Det är viktigt att alltid inkludera den tomma vektorkontrollen för negativ kontrolljämförelse. HT115 bakterier kan användas när poängsättning för exophers i utfodring RNAi. Observera dock att vissa gener är effektiva på att ändra exophergenesis priser även under kortare perioder av RNAi exponering5. Om inriktning på vissa gener leder till utvecklingssvikt, undvika att utsätta djur för livslång knockdown, kan djur helt enkelt plockas på L4-scenen på RNAi plattor för exponering från L4 till vuxen D2 eller D3.
| Stam namn | Genotyp | Beskrivning | Exopher procent | Referens |
| SK4005 | zdIs5[Pmec-4GFP] | Cytosolic uttryck av GFP i beröring nervceller. | 1-8% ALM | Figur 4A, Melentijevic 2017 |
| ZB4065 | bzIs166 [Pmec-4::mCherry] | Överuttryck av mCherry (bzIs166) i beröring nervceller, producerar både cytosolisk signal och mCherry aggregat. bzIs166 är en exopher inducerare. mCherry aggregat är prediktorer för exophergenesis och är företrädesvis extruderade i exophers. | 3-20 % ALM (normala förhållanden). 20-80 % ALM (fasteförhållanden). | Figur 4B, Melentijevic 2017 |
| ZB4067 | bzIs167 [Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]; | YFP cytosolically etiketter mec-7 touch nervceller. Co-uttryckt Q128::CFP aggregat och inducerar exophers. GFP:s företrädesvis tystnad. | ~25% | Figur 4C, Meletijevic 2017 |
| ZB4509 | bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] | bzIs168 LMP-1::GFP etiketter plasmamembran och lysosomala membran. bzIs168 kan användas för att identifiera neuronala membran, exophers (som de är membran bundna), och lysosomal-membran strukturer. | 3-20% ALM | Figur 4D, Melentijevic 2017 |
| ZB4528 | bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] | Allele zhsEx17 är en mitokondriellt lokaliserad reporter som ändrar sin topp excitation våglängd från 405nm (oxiderad) till 476nm (reducerad) enligt den lokala oxidativ miljö. Det uttrycks i beröringen nervceller och kan användas på egen hand för att identifiera mitokondrierna i beröring nervceller och i mito-exophers. | 3-20% ALM proteo-exopher. % ALM mito-exopher quantitation pågår. | Figur 4E, Melentijevic 2017, Cannon 2008, Ghose 2013 |
Tabell 1. Stammar som har använts för visualisering av touch nervceller, touch neuron-exophers, och exopher innehåll.
Bild 1: Stadier av Exophergenesis. Processen att göra och mata ut en exopher kallas "exopher-genesis". Den dynamiska processen för exopherbildning kan ta flera minuter till flera timmar. Skildras är exempel på soma och exopher morfologi vid specifika steg under den dynamiska exophergenesis processen i en hög-exopher producera stam, ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. Alla bilder är av dag 2 vuxna ALM nervceller tagna med en 100x målsättning. (A) Normal soma. Vuxen mechanosensory touch neuron ALM transgeniskt uttrycker Pmec-4mCherry. Den soma morfologi skildras är typiskt för unga vuxna nervceller i denna stam, med mCherry koncentrationer i cytoplasman. (B) Tidig knoppfas. Det första observerbara steget av exophergenesis innebär polarisering av utvalda cytoplasmatiskt material till kanten av soma membranet. Detta steg åtföljs ofta av en expansion eller svullnad av soma. När det gäller beröringsnerverna sträcker sig pre-exopher-domänen (PED) in i omgivande hypodermis (inte syns här). Notera den större koncentrationen av mCherry material i den tidiga knopp domänen. (C) Sen knoppfas. Vid ytterligare cellulära polarisering och en expansion av pre-exopher domän, en förträngning mellan soma och exopher (pil) blir uppenbart. Denna händelse signalerar övergången till den sena budfasen. Även om i den sena knoppen arrangerar cellen ställer ut en klar constrictionplats och avskiljer soma- och exopherdomäner, kläms det inte ännu av fullständigt från somaen; den spirande exophern kan fästas med en tjock stjälk (pil). Den spirande domänen anses vara en tidig exopher när diametern på exopher domänen i fråga är ungefär 1 / 3 större än diametern på byggarbetsplatsen / stjälken. (D) Tidig-exopher fas. Tidiga exophers kan fästas av en stjälk från den avgående soma-diametern på denna anslutning kan tunna som exopher flyttar bort från soma. Cytoplasmatiskt material kan överföras från soma till exopher via detta rör, även om de flesta material laddas under processen för spirande ut. Exophers kan lossna från soma som avbildas i (E), är separerade exophers anses mogna exophers (F). Den mogna exopher kan transit genom den omgivande hypodermal vävnad, flytta bort från den avgående soma. (G) Nedbrytning av mCherry-märkt exopher i mindre vesiklar inom hypodermis resulterar i en utspridd punktat utseende mCherry materialet, troligen eftersom det kommer in i hypodermalt endolysosomalt nätverk. Den spridda punktat signalen kallas "starry night" fas. Nedbrytning av vissa exopher innehåll är sannolikt åstadkoms av hypodermal lysosomer, men vissa material är inte helt försämras och är ofta åter extruderad av hypodermis i pseudocoelom. Post-exophergenesis mCherry transit beskrivs mer i detalj i figur 2. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: mCherry extruderad från beröring nervceller i exophers engagerar omgivande hypodermala lysosomalt nätverk men kan senare extruderade i pseudocoelom där koelomocyter kan lagra / försämra mCherry. (A) Tecknad sammanfattning av hur mCherry extruderade i exophers transiter kroppen efter utvisning av nervceller. Under exophergenesis utvalda cellulära innehåll såsom mCherry bli lokaliserade och knopp av från den sändande neuronala soma i en oberoende vesikel omgiven av den neuronala och hypodermala plasma membran. Eftersom beröringen nervceller är inbäddade i hypodermal vävnad, som exopher domän knoppar utåt den rör sig längre in i hypodermis. Exopheren kan genomresa hypodermisen, och efter timmar till dagar, exopher tillfredsställt kan fragmentera inom den endolysosomal knyter kontakt av hypodermisen. Den mCherry kan visas som spridda puncta hela hypodermis, en scen som kallas "stjärnklar natt". Efter några dagar kan en del av mCherry passera ut ur hypodermis i den omgivande pseudocoelom, där scavenger celler som kallas coelomocyter kan få tillgång till, och ta upp, mCherry som kan lagras. (B) Exempel på utseendet på den stjärnklara natten mCherry vesicles. Bild av en ALM soma taggade med mCherry med stora exopher fragment och stjärnklar natt vesicles. Stam är ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. (C) Exempel på mCherry koncentration i avlägsna koelomocyter. Sidovy av en vuxen djur dag 10 av stam ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] visar mCherry koncentrerad till koelomocyter (pilar). Vissa stjärnklar natt vesicles är också uppenbart. I allmänhet coelomocyte koncentrationen blir uppenbart efter om vuxen dag 5 i livet. (B botten) Tecknad reproduktion av (B), med beröring nervceller och processer som beskrivs i rött, som är ljusaste exopher fragment; spridda små vesicles av olika Z-djup visas i ljusare rosa. (C botten) Tecknad version av bild av (C), som visar neuronal process i rött, stjärnklar natt i rosa och coelomocyter i grönt. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Mechanosensory touch nervceller producerar exophers på olika nivåer med en exakt tidsmässiga profil. (A) (Top) Tecknad skildring av mekanosensoriska touch nervceller i rumslig relation till viktiga anatomiska landmärken av C. elegans inklusive pumpande svalget och neuron-tät nervringen i huvudet på djuret, vulva vid mitten av kroppen, och avsmalnande svans. (Nederst) Fluorescerande märkt touch nervceller uttrycker GFP som visas från toppen och vänster sida (bilder anpassade från WormAtlas). Den röda rutan visar området där ALM-exofer vanligtvis finns. (B) Hög förstoringsvy över den mellankroppsregion vid vilken ALM-härledda exoferer framställs i en stam som uttrycker [Pmec-4mCherry]. AVM och ALMR neuron avbildas, och visas är en ALMR exopher tillsammans med mCherry stjärnklar natt. ALMR nervceller mest lätt producera exophers. (C) ALMR mechanosensory touch nervceller mer lätt producera exophers jämfört med andra touch nervceller i hermafroditer under basala förhållanden. Mechanosensory touch neuron exopher produktion på vuxen dag 2, som gjorde för enskilda touch receptor nervceller är indicerat. Stam: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], N>150, felbarer är SEM. (D) ALMR touch nervceller producera fler exophers under dagar 2 och 3 i vuxen ålder jämfört med den unga L4-stadium eller med djur i hög ålder. Stam: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], N>150, fel barer är SEM. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Exempel på några fluorescerande reportrar som märker exopher-innehåll. Ett enkelt sätt att observera exophers är genom att skapa transgena djur som uttrycker fluorforer från neuronala initiativtagare. De fluoroforer möjliggör visualisering av exopher och transgena uttryck inducerar aggregering och/eller proteostress som ökar exophergenesis. Exophers produceras av amphid nervceller kan också observeras under inhemska förhållanden, med hjälp av färgämne fyllning för visualisering. Visas är exempel på vanliga stammar som kan användas för att observera exophers, (E) exopher, (S) soma. (A) Soma och exopher från en ALM av en vuxen av stam SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP], 100x mål som används för fotografering, skala bar 3μm. I denna stam, exophers som inkluderar lösliga GFP mäts, men exopher produktion sker sällan. Fusing GFP till proteiner som kan vara företrädesvis extruderad i exophers i andra studier bekräftar att GFP fusioner kan detekteras i mogna exophers. (B) ALM soma och exopher av en vuxen av stam ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], som uttrycker mCherry och inducerar touch neuron exopher produktion. 100x mål som används för fotografering, skala bar 5 μm. (C) ALM soma och exopher av en vuxen av stam ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]; selektiv blå kanal som används för bild av htt57Q128::CFP. Den exopher innehåller htt57Q128::CFP aggregat (pilar), som visas mer koncentrerade i exopher än i soma. 40x mål som används för fotografering, skala bar 5μm. (D-E) Exophers kan innehålla organeller och organellspecifik märkning med fluorescerande proteiner möjliggör övervakning av organellextrudering. (D) Lysosomal membran tag LMP-1::GFP konturerna av soma och exopher membranet och taggar plasmamembranen svagt (plasmamembran lokalisering är en människohandel steg på väg till lysosomal inriktning) och etiketter lysosomal organeller starkt. Visas är en vuxen ALM soma co-uttrycker Pmec-4mCherry och Pmec-7LMP-1::GFP som lokaliserar till membran och lysosomes. Den soma har en bifogad exopher med andra mindre extruderingar sannolikt exopher fragment (pilar). GFP positiva strukturer ingår i soma och finns i den stora exopher, stam: ZB4509 bzIs166 [Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]. 100x mål som används för fotografering, skala bar 5 μm. E) En mitokondriell GFP-markör kan användas för att identifiera mitokondrierna hos soma och exophers. Visas är en vuxen ALM soma uttrycker Pmec-4mCherry och mito::ROGFP, som lokaliserar till mitokondriell matris. mito::ROGFP uttryckt ensam, utan mCherry, kan också lätt användas för att identifiera nervceller och poäng för exophers som inkluderar mitokondrierna. Stam: ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]. 100x mål som används för fotografering; skala bar 5μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Utvecklingscykel för C. elegans och L4-identifiering. (A) Vid 20 °C tar ett ägg cirka 9 timmar att kläckas en gång som lagts av modern. (B) Ett nykläckt djur är i larvstadium 1 (L1) och smälter in i en L2-larv efter 12 timmar. (C) Djur kvar i L2 och den (D) L3 larven stadier i ca 8 timmar vardera. (E) Ungdomar djur anses vara den fjärde larvstadiet (L4) och präglas av en iögonfallande utveckla vulva som visas som en vit halvmåne nära mitten kroppen. Förekomsten av detta medan halvmåne möjliggör enkel identifiering och plockning av L4 iscensatta djur för att etablera synkroniserade kulturer som senare underlättar poängsättning för exophers. Djur kvar i L4-stadiet i ca 10 timmar innan deras slutliga molt in gravid vuxna, F) identifieras genom att utveckla ägg, synliga spermatheca, och inledandet av äggläggning. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 6: Beredning av mikroskop slide agar pad. (A) Förbered två objektglas med en enda remsa av laboratorietejp som placerats på längden över ovansidan. Placera en icke-tejpade mikroskop glida i mellan som bilden. B) Placera en droppe smält agaros ovanpå objektglaset. (C) Placera en ren glidning försiktigt ovanpå droppen, trycka på agaros i en deflaterad cirkel pad. (D) Ta bort de tejpade diabilder, som verkar för att åstadkomma en jämn förenkling av agar som behövs för att skapa en jämn pad. (E) Ta bort den övre bilden när agarospaden har torkat. (F) Pipettera en paralytisk lösning (levamisole eller tetramisole) ovanpå agardynan. (G) Plocka lämpligt iscensatta djur i den paralytiska. (H) Täck försiktigt djuren med en täckslip och se till att djuren är levande. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7: Tecken på exophers och exopher kriterier identifiering. (A) Allmänna kriterier som identifierar en exopher. (B) Diameter jämförelser mellan den sändande soma och den extruderade exopher, mätt i μm. Vuxen ALM somas, N=35, stam: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] - 6,53 μm genomsnittlig storlek på soma och 3,83 μm medelstorlek av exopher. (C) Definiera kriterier för att skilja mellan en exopher domän och en spirande exopher. (D) Vanligast, enskilda nervceller gör en stor exopher, som senare delar eller fragment som hypodermis försök att försämra dess innehåll. Fortfarande, flera exophers kan observeras bredvid en touch neuron som kan härröra från antingen flera exopher händelser från en neuron eller alternativt, exophers kan också knopp eller fragmentera sig själva. Ursprunget till flera exopher-liknande enheter kan endast bestämmas med hjälp av time lapse mikroskopi. Top skildrar en ALMR touch neuron soma med en enda avlägsen exopher. Botten skildrar en ALMR touch neuron soma med flera exopher-liknande extruder. (E) Vanliga morfologiska funktioner i vuxna ALM touch neuron somas som kan misstas för exopher händelser. Överst till vänster - En distended ALM soma, utan tydlig exopher domän eller förträngning webbplats. Övre mitten - Nervceller kan ha små extracellulära utsprång som kan vara analoga med exophers, men inte uppfyller kriterier storlek krav för att betraktas som en exopher. Överst till höger – Med åldern, touch nervceller kan utveckla utväxt längs deras mindre neurit. Ofta kan mCherry material samlas vid spetsen av neurit utväxt. Detta poängsätts inte som exopher om den insamlade mCherry inte uppfyller exopher-till-soma storlekskrav. Botten skildrar vuxna ALM nervceller som har definierande kriterier för en exopher domän eller en exopher. Botom vänster - ALM soma som har en framträdande exopher domän som selektivt inkluderar mCherry cytosol och mCherry taggade aggregat. Webbplatsen för exopher-domänförträngningar markeras med pilar och uppfyller storlekskriterierna (minst1/5th storleken på soma). Den största diametern på exopher domänen är nästan 1 / 3 större än diametern på förträngning webbplats, uppfyller kriterier för en exopher händelse. Botten mitten - ALM soma som har en framstående spirande exopher som uppfyller storlekskriterierna. Det finns en tydlig förträngningsplats. Nere till höger - ALM soma som har en bifogad mCherry-fylld exopher som uppfyller exopher storlekskrav. Exophern är fäst med en tunn anslutningsfilament. Alla bilder är från stam ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Discussion
Karakteriseringen av in vivo molekylära mekanismerna för aggregat och organell eliminering i form av stora exophers är i sin linda. Frågor om utnämningen av laster för utvisning, den polariserade insamling av dessa laster inom cellen, regleringen av beslutet att generera exophers, maskiner som förmedlar extruder, och samspelet mellan exophers med de nedbrytande maskiner i en angränsande cell alla återstår att behandlas. Dessutom är in vivo visualisering av rörformiga anslutningar som kan passera biologiska material som inkluderar kalcium, aggregat och mitokondrierna intressant och understudied biologi i sin egen rätt. Frågor om varför vissa celler är mer benägna att exopher produktion än andra också är olösta, men kan börja genetiskt dissekeras med de metoder som beskrivs i detta protokoll.
Beskrivs i detalj i detta protokoll är de metoder för att uppnå reproducerbara scoring av exopher produktion, med uppmärksamhet på att skilja exophers från närliggande cell somas, tidpunkten för analyser för att fånga toppen av exopher produktion, och strikt kontroll av tillväxtvillkor för att eliminera oavsiktliga påfrestningar som kan modulera exopher nivåer. Båda åtskillnad av den stora tidiga exopher, eller "starry night" spridning i den omgivande hypodermis kan kvantifieras som bevis på exopher produktion. Med detta sagt, nervceller uttrycker mCherry under basala förhållanden är oftast associerade med 5-25% av nervceller av en specifik typ producerar en exopher. Kontrollerad introduktion av stress villkor skulle kunna tillämpas för att öka exopher produktionen till upptäckt så hög som 90% av nervceller som producerar extruderingar, särskilt användbar för genetiska eller farmakologiska skärmar för modifierare.
I mänskliga neurodegenerativa sjukdom, kan stora aggregat överföra från sjuka nervceller till angränsande celler för att främja patologi spridning. Exopher mekanismen kan spira via en bevarad mekanism som används för aggregerad extrudering över phyla. Definiera in vivo molekyler som antingen öka effektiviteten i denna process (anses effektivare proteostas kontroll) eller blockera det kan utnyttjas för att påverka utformningen av nya strategier för att bekämpa flera neurodegenerativa sjukdomar. Som sådan, det protokoll som beskrivs här kan användas för klassisk genetiska mutagenes skärmar, genomet hela RNAi skärmar som systematiskt slå ner gener för att identifiera förstärkare och suppressors, eller för läkemedelsintervention studier som identifierar kandidat farmakologiska modifierare av denna process. Tillvägagångssättet är enkelt, men något mödosamt. Exophers är så stora att de kan ses med en hög förstoring dissekera mikroskop. Fortfarande, C. elegans nervceller är relativt små och titta på deras organeller eller deras membran kräver högre effekt confocal bilder och är en långsam process. Alternativ för högre dataflöde kan innebära hög innehållsavbildning metoder i flera brunnsplåt format.
Tillämpningen av en standardiserad strategi för exopher scoring bör understiga en samordnad genetisk dissekering av processen genom vilken nervceller kan organisera och eliminera cellulära skräp.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Vi erkänner följande NIH-bidrag: R01AG047101 och R37AG56510. Medlemmar av Driscoll och Grant labs har bidragit mycket till utveckling och finjustering av protokoll som beskrivs, med rigorösa experiment och stark kommunikation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95B Scientific CMOS camera | Photometrics Prime | ||
| 1,000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
| 10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
| 10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
| 13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| 2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
| 25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
| 300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
| 50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
| 9 cm sterile Petri dishes | Fisher Scientific | 11309283 | |
| absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
| C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
| calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
| cholesterol | Acros | 110190250 | |
| dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
| E. coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
| FBS10 Standard microscope | Meyer Instruments | KSC 410-1-100-1 | FBS10 Standard with Plate Base, 100/100 Trinocular Head and Flip zoom |
| glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | |
| Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
| Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
| LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
| LDI – Laser Diode Illuminator | 89 North | ||
| levamisole | Sigma Aldrich | 16595-80-5 | |
| M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
| magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
| Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
| Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
| P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
| P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
| P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
| pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
| Polystyrene microbeads | Sigma Aldrich | MFCD00131491 | |
| RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
| Reusable ringed cytology slides | ThermoFisher Scientific | 22037242 | |
| SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP] | contract Driscoll lab | GFP expressed in touch neurons | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
| Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
| Triton-X | Thermofisher scientific | 28313 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit | CrestOptics | ||
| ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] | contract Driscoll lab | mCherry expressed in touch neurons | |
| ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+] | contract Driscoll lab | Q128 expressed in touch neurons | |
| ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] | contract Driscoll lab | mitoROGFP expressed in touch neurons | |
| ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] | contract Driscoll lab | autophagy marker expressed in touch neurons | |
| ZEISS Axio Vert.A1 | Zeiss |
References
- Davis, A. A., Leyns, C. E. G., Holtzman, D. M. Intercellular Spread of Protein Aggregates in Neurodegenerative Disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 545-568 (2018).
- Davis, C. H., et al. Transcellular degradation of axonal mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9633-9638 (2014).
- Torralba, D., Baixauli, F., Sanchez-Madrid, F. Mitochondria Know No Boundaries: Mechanisms and Functions of Intercellular Mitochondrial Transfer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 107 (2016).
- Stahl, P. D., Raposo, G. Extracellular Vesicles: Exosomes and Microvesicles Integrators of Homeostasis. Physiology (Bethesda, Md.). 34 (3), 169-177 (2019).
- Melentijevic, I., et al. C-elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress. Nature. 542 (7641), 367 (2017).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 9 (3), 1003351 (2013).
- Tyson, T., et al. Novel animal model defines genetic contributions for neuron-to-neuron transfer of alpha-synuclein. Scientific Reports. 7, (2017).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 5427-5433 (2015).
- Pearce, M. M. P., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain. Nature Communications. 6, 6768 (2015).
- Fu, H., Li, J., Du, P., Jin, W., Cui, D. Metabolic wastes are extracellularly disposed by excretosomes, nanotubes and exophers in mouse HT22 cells through an autophagic vesicle clustering mechanism. bioRxiv. 10 (1), (2019).
- Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2. PLoS Genetics. 9 (12), 1004063 (2013).
- Cannon, M. B., Remington, S. J. Redox-sensitive green fluorescent protein: probes for dynamic intracellular redox responses. A review. Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2008).
- Perkins, L. A., Hedgecock, E. M., Thomson, J. N., Culotti, J. G. Mutant sensory cilia in the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 117 (2), 456-487 (1986).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of Gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
- Weicksel, S. E., et al. A novel small molecule that disrupts a key event during the oocyte-to-embryo transition in C. elegans. Development. 143 (19), 3540-3548 (2016).
- Dong, L., et al. Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms. PloS One. 13 (3), 0193989 (2018).
- Toth, M. L., et al. Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).
- Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. RNA Interference in Caenorhabditis elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 109, (2015).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. Large-scale gene knockdown in C. elegans using dsRNA feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50693 (2013).
