Summary
אנו מתארים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה בלייזר של תת-מקטעים של הכליה האנושית, כולל הגלומרולוס, צינורית פרוקסימלית, איבר עולה עבה, צינור איסוף ואינטרסטיציום. לאחר מכן, ה- RNA מבודד מהתאים המתקבלים ורצף ה- RNA מתבצע כדי לקבוע שינויים בחתימה התמלולומית בתוך כל מקטע משנה.
Abstract
ניתוח ביטוי גנים של רקמת כליה אנושית הוא כלי חשוב להבנת הומאוסטזיס ופתופיזיולוגיה של מחלות. הגדלת הרזולוציה והעומק של טכנולוגיה זו והרחבתה לרמת התאים בתוך הרקמה יש צורך. למרות שהשימוש ברצף RNA גרעיני יחיד ותא יחיד הפך נפוץ, חתימות הביטוי של תאים המתקבלים מדיסוציאציה של רקמות אינן שומרות על הקשר מרחבי. מיקרו-דיסקציה בלייזר (LMD) המבוססת על סמנים פלואורסצנטיים ספציפיים תאפשר בידוד של מבנים ספציפיים וקבוצות תאים מעניינות עם לוקליזציה ידועה, ובכך תאפשר רכישה של חתימות תעתיקיות מעוגנות באופן מעוגן במים ברקמת הכליה. יש לנו אופטימיזציה מתודולוגיית LMD, מונחה על ידי כתם מבוסס פלואורסצנטיות מהירה, כדי לבודד חמישה תאים נפרדים בתוך הכליה האנושית ולבצע רצף RNA הבאים מדגימות רקמת כליה אנושית יקרות ערך. אנו מציגים גם פרמטרים לבקרת איכות כדי לאפשר הערכה של הלימות הדגימות שנאספו. זרימת העבודה המתוארת בכתב יד זה מראה את ההיתכנות של גישה זו לבודד חתימות תעתיק תת-מגזריות בביטחון רב. הגישה המתודולוגית המוצגת כאן עשויה לחול גם על סוגי רקמות אחרים עם החלפת סמני נוגדנים רלוונטיים.
Introduction
ההתקדמות הטכנולוגית בחקר דגימות רקמות שיפרה את ההבנה של מצב הבריאות והמחלות באיברים שונים. התקדמות כזו הדגישה כי פתולוגיה יכולה להתחיל באזורים מוגבלים או בסוגי תאים ספציפיים, אך יש לה השלכות חשובות על האיבר כולו. לכן, בעידן הנוכחי של רפואה מותאמת אישית, חשוב להבין את הביולוגיה הן ברמה התאית והן ברמה האזורית ולא רק בעולם1. הדבר נכון במיוחד בכליה, המורכבת מתאים ומבנים מיוחדים שונים היוזמים ו/או מגיבים באופן דיפרנציאלי ללחץ פתולוגי. הפתוגנזה של סוגים שונים של מחלת כליות אנושית עדיין לא מובנת היטב. יצירת מתודולוגיה לחקר שינויים בביטוי גנים במקטעים צינוריים ספציפיים, מבנים או אזורים של interstitium בכליה האנושית תשפר את היכולת לחשוף שינויים ספציפיים באזור שיכולים ליידע על הפתוגנזה של המחלה.
דגימות ביופסיה של כליות אנושיות הן משאב מוגבל ויקר. לכן, טכנולוגיות לחקור transcriptomics ברקמת הכליה צריך להיות אופטימיזציה כדי להציע רקמות. השיטות הזמינות לחקר תעתיקים ברמה התאית והאזורית כוללות ריצוף RNA של תא יחיד (scRNaseq), RNaseq גרעיני יחיד (snRNaseq), בהכלאה מרחבית במקום, ומיקרו-דיסקציה בלייזר (LMD). זה האחרון מתאים היטב לבידוד מדויק של אזורים או מבנים של עניין בתוך מקטעי רקמה, עבור רצף RNA במורד הזרם וניתוח2,3,4,5. ניתן לאמץ LMD כדי להסתמך על זיהוי של סוגי תאים או מבנים ספציפיים המבוססים על סמנים מאומתים באמצעות דימות מבוסס פלואורסצנטיות במהלך הניתוח.
התכונות הייחודיות של מיקרו-דיסקציה בלייזר בסיוע תעתיקים אזוריים כוללות: 1) שימור ההקשר המרחבי של תאים ומבנים, המשלים טכנולוגיות תא יחיד שבהן תאים מזוהים על ידי ביטוי ולא על ידי היסטולוגיה; 2) הטכנולוגיה מודיעה ומעודכנה על ידי טכנולוגיות הדמיה אחרות מכיוון שסמן נוגדנים מגדיר חתימות ביטוי; 3) היכולת לזהות מבנים גם כאשר סמנים משתנים במחלה; 4) איתור תעתיקים בעלי ביטוי נמוך בכ-20,000 גנים; ו-5) כלכלת רקמות יוצאת דופן. הטכנולוגיה מדרגית לביופסיה בכליות עם עובי של פחות מ -100 מיקרומטר של ליבה הדרושה לרכישת RNA מספקת ומאפשרת שימוש ברקמה קפואה בארכיון, הזמינים בדרך כלל במאגרים גדולים או במרכזים אקדמיים6.
בעבודה שלאחר מכן, אנו מתארים בפירוט את טכנולוגיית התמלולים האזורית והתפזורת, הממוטבת עם פרוטוקול מכתים פלואורסצנטי מהיר חדשני לשימוש עם רקמת כליות אנושית. גישה זו משפרת את חקר ה- LMD הקלאסי מכיוון שהיא מספקת נתוני ביטוי נפרדים עבור מקטעי המשנה interstitium ו- nephron לעומת ביטוי tubulointerstitial המצטבר. כלולים אמצעי אבטחת איכות ובקרה המיושמים כדי להבטיח הקפדה ושחזור. הפרוטוקול מאפשר הדמיה של תאים ואזורים מעניינים, וכתוצאה מכך רכישה משביעת רצון של RNA מאזורים מבודדים אלה כדי לאפשר רצף RNA במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר אושר לשימוש על ידי הוועדה לבדיקה מוסדית (IRB) באוניברסיטת אינדיאנה.
הערה: השתמש בפרוטוקול זה עם רקמת כריתת כליות (עד 2 ס"מ בממדי X ו- Y) שהשתמרו בתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) ומאוחסנים בטמפרטורה של -80 °C (60 °F). בצע את כל העבודה באופן המגביל זיהום RNA, להשתמש בכפפות חד פעמיות נקיות ומסכת פנים. להבטיח את הניקיון של כל המשטחים. הציוד שעבורו פרוטוקול זה היה אופטימיזציה היא מערכת מיקרודיסציה לייזר שמציעות לייזר UV פעמו.
1. קריוסקציה
- לחשוף 1.2 מיקרומטר LMD PPS-קרום (פולי(p-פנילין סולפיד) שקופיות לאור UV (במכסה המנוע זרימה למינארי תרבית רקמות) במשך 30 דקות, מיד לפני cryosectioning. אחסן את השקופיות בטמפרטורת החדר לצורך הדבקות אופטימלית ברקמות.
- מצננים את ההקפאה ל-20 מעלות צלזיוס. נקה את משטחי העבודה והתקן להב חיתוך חדש.
- מניחים תיבת שקופיות קטנה (ניקה עם פתרון טיהור משטח RNase) בתוך תא cryostat לאחסן שקופיות עם רקמה חתוכה טרי.
- לדבוק את הדגימה ב OCT למחזיק רקמה ולאפשר לו לשוויון במשך כמה דקות כדי להגיע לטמפרטורת התא ולחזק את הדבקות בין בלוק OCT לבין המחזיק. לסייע לתהליך באמצעות מחלץ חום.
- חותכים את הדגימה לעובי של 12 מיקרומטר ומדביקים אותה לשקופית LMD מיוחדת, באמצעות מתאם השקופית. כל שקופית מכילה מקטע כריתת כליות אחד לכל שקופית או עד שני מקטעי ביופסיה בכליות לכל שקופית. אחסן את השקופיות ב-80°C עם מחסנית מיובשת ובתוך שקית ניילון סגורה היטב כדי למנוע הצטברות של לחות עודפת בתוך תיבת השקופית.
- סמן כל שקופית בתווית עם מזהה דגימה, תאריך ומספר שקופית.
- השתמש בשקופיות עם דגימות בתוך 10 ימים מהתאריך הראשוני של cryosectioning.
2. מיקרו-דיסקציה בלייזר
- מיד לפני הכתם, להכין את תערובת נוגדנים (Ab-Mix) ב 10% BSA ב PBS ללא RNase על ידי הוספת הדברים הבאים: 4 μL של FITC-Phalloidin, 1.5 μL של DAPI, 2 μL של נוגדן חלבון Tamm-Horsfall (THP) הודבק ישירות אלקסה פלואור 546, 3.3 μL של מעכב RNase, ו 89.2 μL של 10% BSA ב- PBS (כדי להגיע לנפח של 100 μL).
הערה: ניתן להשתמש בנוגדנים חלופיים במקום נוגדן THP. לדוגמה, 2 μL של נוגדן megalin / LRP2, ישירות מצומד אלקסה פלואור 568, ניתן להשתמש כדי לתייג את tubule proximal. Ab-Mix מכיל נוגדן LRP2 או THP (כדי לדמיין או צינוריות פרוקסימליות או גפיים עולות עבות, בהתאמה). נוגדנים אחרים עשויים להיות מאומתים בהתאם לצרכי המשתמש. - לשטוף את המגלשה בקרח קר (-20 °C) 100% אצטון במשך 1 דקות ולהעביר אותו לתא הלחות.
- שטפו את החלק העליון של השקופית עם PBS ללא RNase למשך 30 שניות.
- שטפו את החלק העליון של השקופית עם 10% BSA ב-PBS נטול RNase למשך 30 שניות.
- יש למרוח את ה-Ab-Mix למשך 5 דקות.
- שטפו את החלק העליון של השקופית עם 10% BSA ב-PBS נטול RNase למשך 30 שניות.
- אוויר לייבש את השקופית במשך 5 דקות ולהעמיס אותו על פלטפורמת חיתוך microdissection לייזר.
- התקן את צינורות האיסוף (צינורות מיקרוצנטריפוגה אוטומטיים של 0.5 מ"ל) המתאימים לעבודת PCR, המכילים 50 μL של מאגר מיצוי מערכת הבידוד RNA.
- המשך עם LMD. השלם כל הפעלת LMD תוך שעתיים לכל היותר.
- לאסוף תמונות אימונופלואורסצנטיות לפני ואחרי LMD, באמצעות מצלמת המיקרוסקופ כדי לאמת את הניתוח עבור שונות בין מפעילים, כמו גם מטרות ארכיון, אימון והערכת איכות של הפרוטוקול המבוצע. על מנת להשיג 0.5 – 1 ng של RNA, מינימום של 500,000 מיקרומטר2 שטח נדרש. זה לעתים קרובות מחייב את השימוש של עד 8 x12 μm קטעים עבים כדי לקבל כמות מספקת של חומר עבור כל תת מקטעי עניין.
- לזהות אזורים מעניינים על ידי כתמים, מורפולוגיה ומיקום ולגרש אותם באמצעות כוח לייזר גדול מ 40.
הערה: להלן קריטריוני הניתוח. הצינורית הפרוקסימלית מוגדרת על ידי תיוג FITC-פאלודין ו- LRP2. האיבר העולה העבה מוגדר על-ידי תיוג THP. צינור האיסוף מוגדר על ידי מורפולוגיה גרעינית (DAPI) והיעדר כתמים אחרים. הגלומרולוס מוגדר על ידי FITC-פאלודין ומורפולוגיה. האינטרסטיציום מוגדר כאזור שבין צינוריות מוכתמות.
- השג חתימת ביטוי חתך בצובר על-ידי הדבקת שני מקטעי μm של 12 μm בשקופית LMD וניתוח המקטעים כולו למאגר החילוץ.
- עם השלמת תהליך ה- LMD, סגור את צינורות המיקרוצנטריפוגה הנאספים והזז אותו במרץ כדי להבטיח שהתוכן יעבור מהמכסה לתחתית הצינור
- צנטריפוגה הצינורות ב 3,000 x g עבור 30 s.
- דגירה את הצינורות ב 42 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך 30 דקות.
- צנטריפוגה הצינורות ב 3,000 x g במשך 2 דקות.
- להעביר את supernatant לצינור חדש 0.5 מ"ל ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס.
3. בידוד RNA
הערה: עבור פרוטוקול בידוד RNA זה, התאמנו פרוטוקול מערכת בידוד RNA מסחרית. פרוטוקול היצרן השתנה כדי לעמוד בדרישות בקרת האיכות שהוגדרו עבור הפרוייקט.
- הוסף 250 μL של חוצץ מותנה (CB) לכל עמודת טיהור RNA (PC) והדגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה כל המחשבים במשך 1 דקות ב 16,000 x g.
- הוסף 50 μL של 70% אתנול (מסופק בערכה) לתוך הצינורות עם דגימות רקמה. מערבבים היטב את הדגימות על ידי pipetting למעלה ולמטה. אל תעשה מערבולת. אל צנטריפוגה.
- העבר את התערובת למחשבים מותנים וצנטריפוגה למשך 2 דקות ב- 100 x גרם (כדי לאגד RNA), בצע במהירות עם צנטריפוגה במשך 30 שניות ב 16,000 x g (כדי להסיר זרימה דרך). חזור על שלב זה אם יותר מצינור אחד עם דגימות רקמה זמינים עבור כל תת-קטע נתון.
- הוסף 100 μL של חוצץ לשטוף 1 (WB1) למחשבים וצנטריפוגה במשך דקה אחת ב 8,000 x גרם.
- הכן 40 μL של DNase לכל מדגם (הוסף 5 μL של DNase ל 35 μL של מאגר RDD). לאחר מכן להוסיף 40 μL של התערובת ישירות על הממברנה של המחשב ואת הדגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 40 μL של WB1 על הממברנה של המחשב, וצנטריפוגה עבור 15 s ב 8,000 x g.
- הוסף 100 μL של חוצץ לשטוף 2 (WB2) על הממברנה של המחשב, וצנטריפוגה במשך 1 דקות ב 8,000 x גרם.
- הוסף 100 μL של WB2 על הממברנה של המחשב, צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 16,000 xg , מיד אחרי צנטריפוגה במשך 1 דקות ב 16,000 xg .
- העבר את המחשב לצינור חדש של 0.5 מ"ל.
- מוסיפים 12 μL של חוצץ Elution (EB) על הממברנה והדגירה במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר. לכן, הנפח הסופי של כל דגימות רקמה מנותח במאגר הוא 12 μL לכל תת פלח.
- צנטריפוגה הדגימות במשך 1 דקות ב 1,000 x g ולאחר מכן במשך 2 דקות ב 16,000 x גרם.
- העבר 2 μL לתוך צינור טרי לניתוח Bioanalyzer (כדי למנוע אירועי הפשרה בהקפאה).
- יש לאחסן את כל הצינורות ב-80°C עד לקבלת עיבוד נוסף.
4. רצף RNA
- להעריך כל מדגם, המיועד לריצוף, לאיכות באמצעות Bioanalyzer מסחרי שבב המוקדש למדידת כמויות קטנות של RNA.
- פרמטרים הבאים בקרת איכות (QC) לפני הכנה לספריה רצף נדרשים: כמות RNA גדול מ 4 ng עבור בצובר וגדול מ 0.5 - 1 ng עבור כל תת פלח; אחוז התמלילים העולים על 200 נוקלאוטידים (DV200) נדרש להיות גדול מ- 25% עבור דגימות LMD (אופטימלית > 75%).
- בצע הכנת ספרייה עם ערכת הכנה מסחרית לספריית cDNA המיועדת לכמויות קטנות של RNA מושפל. עבור הערכה המסחרית המפורטת בתוספת, אנו מציעים להשתמש באפשרות 2, הדורשת DV200 מינימלי של 25% וללא פיצול. טכנולוגיות רצף מסוימות עשויות לדרוש סף DV200 מינימלי גבוה יותר, כגון 30%7.
- הוסף מתאמים ואינדקסים של cDNA.
- לטהר את ספריות RNAseq באמצעות טכנולוגיית חרוזים מגנטיים.
- רוקן את ה-cDNA הריבוזומלי באמצעות ערכת הסרת rRNA מסחרית לפני שלב ההגברה של ספריית RNAseq.
- לטהר את ספריית RNAseq הסופית באמצעות טכנולוגיית חרוז מגנטי בריכוז ספריית cDNA 2 ng/μL.
- בצע רצף RNA של 75 bp מזווג קצה על מערכת רצף מסחרי עם 30 מיליון קריאות / מדגם עבור בצובר ו 100 מיליון קריאות / מדגם עבור מקטעים תת-מגזריים.
- השתמש RNA הפניה (25 מיקרוגרם) עם כל ריצוף לרוץ כדי לאפשר שליטה על אפקט אצווה. הריכוז הראשוני של RNA הייחוס שלנו הוא 1 מיקרוגרם / μL, בעוד הריכוז הסופי מנוצל ברצף הוא 25 ng/μL. הפעל את RNA הפניה כדוגמה נפרדת במהלך הכנת הספרייה ולהפעיל עם כל דגימות LMD בכל פעם.
- בצע ניתוח נתונים תוך שימוש ביישום FastQC כדי להעריך את איכות הרצף, הקריאות הבין-גניות והמיטוכונדריות ולקבוע קריאות המיוחסות לגן.
- השתמש במציג הגנומיקה האינטגרטיבית (IGV) ליישור ו- edgeR/rbamtools עבור מידות ביטוי תעתיק.
- הסר דוגמאות עם פחות מ- 100,000 קריאות. Quantile לנרמל את הקריאות גלם בערכת הנתונים לאחר סינון החוצה גנים מבוטאים נמוכה על סף מוגדר על ידי המשתמש.
- כימת את הביטוי כיחס בין מקטע המשנה של הריבית לממוצע של כל מקטעי המשנה האחרים וההמרה של log2. ביטוי יחסי של אותו גן ניתן להשוות על פני תת מקטעים ודגימות; עם זאת, אין זה אידיאלי להשוות ביטוי יחסי בין שני גנים שונים בשל הבדלים פוטנציאליים השפלה על פני גנים ומינים RNA.
- בצע ניתוח העשרה כדי להשוות ביטוי גנים עבור קבוצה של יצרנים ספציפיים לכל תת-מקטע של nephron, בעוד שדגימות RNA של Reference מושווות בין אצוות. אפקט אצווה בתוך סטיית תקן אחת של ביטוי ממוצע עם ערך R > 0.9 נחשב מקובל. נדרש נורמליזציה נוספת עבור ציון אפקט אצווה גבוה יותר. ניתן לסמן בדגל כל הפעלה הסוטה מאפקט האצווה המקובל. ה- Q30 צריך להיות גדול מ- >90% עבור כל ריצוף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דגימות
אנו מציגים נתונים מתשעה ניתוחים nephrectomies (3 דגימות שהושגו באוניברסיטת אינדיאנה ו 6 דגימות שהושגו באמצעות פרויקט רפואה דיוק כליות), ניצול פרוטוקול כתמי פלואורסצנטיות מהירה כדי לבודד מקטעי nephron כליות ואזורים ביניים. הסעיפים בהם נוצלו בתהליך זה התקבלו מתורמי כליות שנפטרו או מרמת כליות לא מושפעת. לדגימות אלה לא היו ראיות פתולוגיות למחלות כפי שדמיינו בכתם H&E שנלקח מחלקים רציפים (איור 1A).
בקרת איכות מיקרו-דיסקציה בלייזר
זיהוי של תת מקטעי צינורי בכליה מושגת באמצעות כתמי נוגדנים של סמנים צינוריים ייחודיים, כמו גם מורפולוגיה וציוני דרך מבניים. איור 1B-C מדגים את הכתמים והמיקרו-דיסקציה של תת-מקטעים צינוריים מתוך כריתת כליה מייצגת. זה מושג על ידי הכתמת עם DAPI (גרעינים), FITC-Phalloidin (F-actin), ונוגדן נוסף לפי הצורך. כתמי הפלואורסצנטיות בהם נעשה שימוש אפשרו לדמיין מקטעי משנה של כליות ברמה גבוהה של ביטחון, מונחים עוד יותר על ידי תכונות מורפולוגיות כמו גם מיקום מרחבי של המבנים הממולאים (איור 2). לדוגמה, glomeruli מתגלים על ידי phalloidin ו DAPI כתמים עם מורפולוגיה ייחודית מאוד. באופן דומה, איסוף תעלות הם דמיינו באמצעות מורפולוגיה גרעינית והיעדר כתמים אחרים. הנוגדן megalin / LRP2 (ישירות מצומד אלקסה פלואור 568) משמש כאן כדי לזהות צינוריות פרוקסימליות. האיבר העולה העבה הוא דמיין באמצעות נוגדן חלבון תמם-הורספול (THP) (ישירות מצומד אלקסה פלואור 546). לעומת זאת, האינטרסטיציום נכרת לאורך הממברנה החיצונית של הצינוריות וכולל תאים סטרומה ומערכת החיסון, כמו גם נימים קטנים.
כדי להשיג מספיק RNA של 0.5 – 1 ng לכל תת פלח, אנו מבקשים לנתח שטח מינימלי של 500,000 מיקרומטר2. פעולה זו דורשת בדרך כלל חמישה עד שמונה מקטעים בעובי 12 מיקרומטר (מקטע אחד לכל שקופית) כדי להשיג מספיק חומר עבור כל מקטעי המשנה. ניתוח של כל שקופית הושלם בתוך פחות משעתיים כדי לשמור על איכות RNA המאפשרת לחתוך ~ 4 מקטעים לכל שקופית. רקמה שנרכשה מאותו מקטע משנה מאוגדת משקופיות מרובות לריצוף במורד הזרם. מתקבלת תמונת כשל חיסוני לפני ואחרי LMD כדי לאמת את אוסף מקטעי המשנה המעניינים באמצעות מצלמה מחוברת. איור 3 מציין את שיעורי ההצלחה של אזור הניתוח ואת קלט ה- RNA המינימלי. שיעור ההצלחה של עמידה בקלט האזור המינימלי היה >90% בקבוצת נתונים מייצגת זו. אם רקמת המקור יש כמות קטנה של תקליטור או interstitium, קיימת אפשרות אזור הניתוח יהיה מתחת 500,000 מיקרומטר2 עבור מקטעים אלה לאחר ניצול 8 שקופיות. ניתן לחתוך שקופיות נוספות בהתאם לצרכי המשתמש; עם זאת, כפי שניתן לראות באיור 3, אם האזור קרוב ל-500,000 מיקרומטר2, ספירת הגנים הרצויה שזוהתה היא בעלת שיעור הצלחה גבוה (100%) ושיעור ההצלחה הכולל של ספירת הקריאה הוא 98.6% (דגימה אחת נפלה מתחת למדד QC). לכן, היה מספיק רקמה כדי להשיג מספיק גנים ולקרא ספירות מבלי להשתמש ברקמה נוספת.
רצף בקרת איכות קלט
פלטפורמת ההכנה והרצף של הספרייה המסחרית שנבחרה מאפשרת מדידות הניתנות לשחזור של ביטוי תעתיק, אפילו עם כמויות נמוכות של RNA מושפל מאוד. קלט ה- RNA המינימלי הוא 500 pg וה- DV200 המינימלי (חלק מהקריאות ארוכות מ- 200 נוקלאוטידים) הוא מעל 25%. אין מינימום RIN. רצף עם 100 מיליון קריאות לכל מדגם, אנו מבקשים להרוות את הקריאות הזמינות על מנת לזהות תעתיקים מבוטאים נמוך. ניתן להתאים את סך כל הקריאות בהתאם לצרכי המשתמש.
זה פשוט להשיג מספיק RNA משני חתכים 12 מיקרומטר בתפזורת חתך, ולכן אנו מבקשים להשיג כמות mRNA כוללת מינימלית גבוהה יותר של 4 ng לריצוף בצובר. כפי שהותאם בפרוטוקול, כל מקטע משנה דורש 0.5-1 ng בסך הכל RNA. ריכוז ה-RNA האופטימלי הוא מעל 50 pg/μL לאחר הבידוד. כמויות RNA נמוכות מזה עלול להוביל לגילוי גנים מופחת וספירות קריאה שנצפו. רוב הדגימות מניבות 20,000 גנים שזוהו ו-1 מיליון קריאות. DV200 גדול מ 25% עבור כל הדגימות נדרש על ידי היצרן (>75% נחשב אופטימלי). למרות RIN נמדד, התהליך של microdissection לייזר מפחית RIN ואת פלטפורמות רצף RNA כבר אופטימיזציה עבור RNA מקוטע. כמות ואיכות RNA מוערכים על ידי bioanalyzer לפני הרצף. הכתם המהיר מקטין את משך הזמן שהרקמה נחשפת לטמפרטורת החדר ולתנאי מימית, ובכך מצמצם ככל האפשר את השפלת ה- RNA. מדד בקרת האיכות DV200 לרצף קלט נמצא גם באיור 3.
בקרת איכות פלט רצף
עיבוד נתונים במורד הזרם משתמש בנורמליזציה קוונטית כדי לאפשר השוואה בין דוגמאות באצוות שונות. ספירת גילוי גנים מינימלית של 10,000 וספירת קריאה מינימלית של מיליון מועסקים כסף כדי לכלול דגימות בנורמליזציה קוונטית. דגימות עם ספירת גנים או ספירת קריאה נמוכה יותר אינן נכללות בנורמליזציה קוונטית וניתוחים השוואתיים עוקבים. רק 1 מתוך 98 דגימות תת-מקטעיות שנותחו לא עמדו בסף זה (איור 3). ה-Q30 (שיעור הקריאות הממופות בביטחון של 99.9%)היה גדול מ-93% עבור כל ניסוי רצף (איור 4).
אנו רצף RNA התייחסות אנושית (25 ng) עם כל ריצוף לרוץ כדי לאפשר תיקון עבור אפקט אצווה אם תיקון כזה רצוי או נדרש. אפקט האצווה הנמדד צריך להיות בתוך סטיית תקן אחת של ביטוי ממוצע עם ערך R > 0.9. אם אפקט האצווה גבוה יותר, נדרשת נורמליזציה נוספת להפעלת רצף זו. כאן, אפקט האצווה היה מתחת ל-3% בארבעת ניסויי הרצף המתוארים באיור 4. לכן, אפקט אצווה מטופל בדרך כלל עם נורמליזציה קוונטית עבור כל ריצות רצף, אגנוסטי RNA הפניה. עדיין לא יושם תיקון המבוסס על RNA הייחוס, אך מידע זה זמין וניתן להשתמש בו בהתאם למטרות של ניתוח מסוים.
הקפדה ושחזור
חשוב להדגים הקפדה בזיהוי סוגי תאים ומבנים. לאחר מיקרו-דיסקציה בלייזר, אנו בודקים את העשרת הסמנים הידועים בגלומרולי, PT, TAL, תקליטור ואינטרסטיציום בהשוואה לתאים האחרים(טבלה 1). ניתוח העשרה משמש להשוואת ביטוי גנים עבור סמנים צפויים שנקבעו מראש. ביטוי גנים מועבר כיחסי יומן2 של הביטוי של תת-מקטע העניין בהשוואה למשמעות של מקטעי המשנה האחרים. מדד ביטוי זה נבחר עבור דגימות אנושיות שכן הוא מפחית את השונות הבין-אינדיבידואלית, ומאפשר השוואות בין סוגי תאים ותאים בין דגימות. עם זאת, קריאות גלם קריאות קוונטיות מנורמל ניתן להשוות גם בניתוחים חלופיים. פיגורe 5 מדגים דוגמאות של כתמים אימונוהיסטוכימיים של 5 סמנים ידועים נבחרים אלה, כפי שמוצג אטלס חלבון אנושי.
לפיכך, אנו מציגים מקורות נתונים אורתוגונליים המעניקים ביטחון לתת-פלח השוק הנכון הנאסף: 1) ההדמיה הכוללת את כתם הנוגדנים והמורפולוגיה של המקטע/תא, ו-2) פלט הביטוי המציג סמנים ידועים מתבטא בתת-פלח המקביל.
הניתוח התמלולומי האזורי של גנים המתבטאים בכל תת-פלח מאפשר זיהוי סמן חדשני ולא מוערך. איור 6 מדגים דוגמה לסמן אחד עבור כל תת-פלח שוק שזוהה באמצעות תעתיקים אזוריים של LMD שהניבו גם כתם אימונוהיסטוכימי ספציפי של תת-פלח הנפרון המתאים.
כדי להדגים רבייה ולהבין את ההשפעה של שונות המפעיל, ערכנו ניסוי על מדגם nephrectomy גידול. דגימה זו ניתחה מחדש את הגלומרולי, ה- PT וה- TAL כדי להגביר את הביטחון בתוצאות רצף ה- RNA ומשמשת כעת כשכפול טכני שימושי. בהפרש של חודשים, דגימה זו עברה מופע שני של קריוסקציה, כתמי נוגדנים, ניתוח LMD, מיצוי RNA, הכנת ספרייה, רצף RNA (איור 7) של תאי גלומרולי, PT ו- TAL. שתי הגירסאות (v1 ו- v2) הושוו. התאים גלומרולריים, PT ו- TAL היו בקורלציה רבה עם ערכי r2 >0.95, בדומה לאפקט האצווה המינימלי של RNA הייחוס שלנו.
איור 1: תמונות מייצגות של רקמת הכליה.
(A)כתם H&E של רקמת כליה התייחסות אנושית. (B) תמונה Immunofluorescent של רקמת כליה התייחסות אנושית עם מוכתם עבה עולה קטעים הגפיים לפני LMD ו (C) מיד לאחר ניתוח של מבנה איבר עולה עבה יחיד. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.
איור 2: תמונות מייצגות של מקטעי משנה של כליות ייחוס, הממחשים פי 20 באמצעות גישת כתמים אימונופלואורסצנטית ספציפית.
(A) Glomerulus, (B) פקעת פרוקסימלית, (C) גפיים עולות עבות, (D) צינור איסוף, (E) Interstitium. (*= p < 0.05, **= p < 0.01, ***= p < 0.001 על-ידי ANOVA). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.
איור 3: מדדי בקרת איכות בתעתיקים סגמנטיים.
(A)יותר מ -90% מדגימות הטייס עמדו בסף הקלט של אזור הניתוח של 500,000 מיקרומטר2. (B)כל הדגימות למעט אחת עמדו בקלט ה-RNA הרצוי של לפחות 500 עמודים(C)100% מדגימות הפיילוטעמדו בסף ה-DV200 המינימלי של היצרן של 25% ו-100% מהדגימות עמדו בסף המינימלי שלנו של 10,000 גנים שזוהו. (ה)כל הדגימות למעט אחת הגיעו לספירת קריאה כוללת מינימלית של מיליון. כצפוי, אזורי ניתוח נמוכים יותר מתואמים עם ריכוזי RNA מופחתים, ספירת גנים נמוכה יותר וספירות קריאה נמוכות יותר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: בקרת איכות רצף.
(A) ריצות רצף באמצעות RNA הפניה (לא quantile מנורמל) מושווים לביטוי ממוצע של כל הריצות. קיים מתאם חזק עם אפקט אצווה מינימלי (כל R >0.969). (B)יותר מ-93% מהקריאות שלנו בכל הריצות מופו בביטחון גבוה (Q30 או 99.9%). שים לב שערכי Q30 מסופקים על בסיס לכל נתיב עם נתיבים מרובים בכל הפעלה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: דוגמאות לכתמים אימונוהיסטוכימיים לזיהוי הסמנים הידועים שנבחרו.
תמונות מתוארות עבור (A) NPHS1 (B) LRP2 (C) UMOD (D) SLC4A9 (E) COL6A2. תמונות אימונוהיסטוכימיה מתקבלות מאטלס החלבון האנושי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: דוגמאות לכתמים אימונוהיסטוכימיים להמחשת ביטוי של גנים לא מסורתיים בתת-מקטעים רלוונטיים.
תעתיקים מתוארים עם אימונוהיסטוכימיהמקבילהכוללים ( A ) SHANK3 ב גלומרולוס, (B) ACSM2B ב tubule proximal, (C) RAP1GAP באיבר עולה עבה, ו -( D) L1CAM בצינור האיסוף. תמונות אימונוהיסטוכימיה מתקבלות מאטלס החלבון האנושי. (*= p < 0.0001 על ידי ANOVA) לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: מתאם בין שני ניתוחים נפרדים עם רצף נפרד של אותה דגימה.
רמה גבוהה של קורלציה נצפתה בין קטעים שונים ב- (A) גלומרולוס , (B) צינורית פרוקסימלית, ו - (C) לולאה עולה עבה של הנל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| סמן | קטע | שינוי קיפול | p-ערך |
| NPHS1 | גלומרולוס (לא כולל) | 32.64 | 1.97E-08 |
| LRP2 | טובולה פרוקסימלית | 4.69 | 1.21E-05 |
| משרד האומוד | גפיים עולות עבות | 24.92 | 2.00E-07 |
| SLC4A9 | איסוף צינור אוורור | 4.09 | 0.000133 |
| קול6A2 | אינטרסטיציום | 7.19 | 1.47E-06 |
טבלה 1: ייצוג ערכים ממוצעים עבור כל תת-מקטע עניין בין שלוש דגימות כריתת כליה, בהשוואה לחלקי המשנה הנותרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תעתיקים מבוססי LMD היא טכנולוגיה שימושית המעגנת ביטוי גנים לאזורים ספציפיים בתוך הרקמה. הבסיס של טכנולוגיה זו ואת היישום הפוטנציאלי שלה בכליה תוארה בעבר8. עם זאת, אופטימיזציה, מודרניזציה וייעול של ניתוח מבוסס פלואורסצנטיות שמטרתו במיוחד ניתוח דיוק גבוה עבור רצף RNA במורד הזרם הוא פחות בכל מקום. מכיוון שמתודולוגיה זו מעוגנת באופן מעופש בתוך הרקמה, יש לה פוטנציאל לחשוף סמנים חדשניים או לא מוערכים במבני רקמות, במיוחד במצבי מחלה. למעשה, סמנים נפוצים רבים של תאים עשויים להשתנות עם המחלה, ומכאן להסתמך רק על סמני ביטוי RNA התא עבור שיפוט זהות ללא ההקשר המרחבי עשוי להיות מאתגר במצבי מחלה. לכן, הגישה LMD מעוגנת spatially עשוי להשלים ולספק פלטפורמת האמת הקרקע עבור טכנולוגיות תמלול רבות אחרות כמו תא יחיד רצף RNA גרעיני יחיד, אשר מגדירים תאים על ידי בעיקר על ידי פרופיל ביטוי הגנים שלהם9. יתר על כן, עומק ביטוי הגנים המסופק על ידי LMD (עד 20,000 גנים לדגימה) מספק יתרון נוסף ומקום חשוב להצליב נתונים ממקורות מרובים ולחשב שינויים בביטוי גנים שלא ניתן לראות ללא עומק מסוים. השיקול של כלכלת רקמות הוא תכונה חיובית נוספת של טכנולוגיה זו, לפיה עובי של פחות מ -100 מיקרומטר בסך הכל מבלוק קפוא יכול להספיק עבור ערכת נתונים LMD שלמה. זה מאפשר שאריות רקמה לשמש למטרות אנליטיות אחרות.
ל- LMD יש מגבלות. מגבלה צפויה אחת של רכישת נתונים מיקרו-דיסקציה בלייזר היא אופי התפוקה הנמוך שלה. אוטומציה עתידית עשויה להיות חשובה בשיפור המדרגיות10,11. שתי מגבלות נוספות של תעתיקי LMD כוללות את התלות במומחיות ואת ההשפעה של איכות הרקמות על תוצאות הנתונים. איסוף לא מכוון של תאים וחומרים מחוץ למקטע העניין הוא מגבלה ידועה מכיוון שתאים מועשרים נאספים, ולא תא אחד. LMD מסתמך על מיומנות המשתמש בהבנת מבנה הרקמות ולכן דורש מומחיות מסוימת בתחום. לכן, אנשים חייבים להיות מאומנים לזהות אזורים רלוונטיים בכליה עם וללא כתמי נוגדן. לבסוף, ההשפעה של איכות הרקמות עשויה להשפיע על איכות הנתונים במורד הזרם. פרוטוקול LMD מוביל לפגיעה ברקמות, ולכן איכות החומר ההתחלתי חשובה. עם זאת, פרוטוקול זה היה אופטימיזציה על ביופסיות בארכיון עם מספר דגימות באיכות מתונה בלבד. הנתונים הכלולים מראים כי הפלטפורמה התמלולומית שנבחרה היא איתנה.
שימו לב, ערכת הבידוד המשמשת ואת המתודולוגיה במורד הזרם של רצף RNA חייב להיות מותאם במיוחד עבור מידת השפלה RNA הצפוי. פרוטוקול הכתמים המתואר כאן אומץ מכיוון שהייתה לו השפעה חיובית ביותר על מזעור השפעה כזו. בפרוטוקול זה, רקמה הוטמעה ב- OCT על מנת להקל על השוואות עתידיות בין טכנולוגיות תמלוליות אחרות. עם זאת, רקמה קבועה פורמלין עשוי להיות חלופה.
הנתונים המוצגים בכתב יד זה חושפים את היתרונות של תעתיקים אזוריים, כולל אופטימיזציה, מדדי בקרת איכות ותוצאות טכנולוגיות. הקמת קריטריונים קפדניים לבקרת איכות טרום-אנליטית ואנליטית, וכן הקמת ראיות מוצקות להקפדה ולשחזור חיוניים לכל מתודולוגיה. יישומים עתידיים של תעתיקים אזוריים יכולים להיות מקובצים באופן נרחב ליישומים ביולוגיים, פיתוחים טכניים והתקדמות אנליטית. יישומים ביולוגיים עתידיים עשויים להיות מכוונים לחקירה של רקמה מצינורות לא פצועים, פצועים ומתחדשים, כמו גם צינוריות בסמיכות לדלקת. תאים אלה יכולים להיות מזוהים באותה ביופסיה הן על ידי סמנים מורפולוגיים מסורתיים, כמו גם כתמי נוגדנים עבור סמנים ספציפיים "מסלול". שני סמני הנוגדנים שאומתו לשימוש בטכנולוגיה זו, מגלין וארומודולין, באים לידי ביטוי רב ב tubule proximal וגפה עולה עבה בהתאמה. עם זאת, ייתכן כי סמנים אלה עשויים להיות מופחתים רקמה חולה קשות. במצבים אלה, אימות נוגדנים נוסף של סמנים ספציפיים למסלול או סמנים חדשניים שאינם משנים את רמת הביטוי שלהם עשוי להתגבר על בעיה זו.
LMD עשוי להיות שיטה מתאימה לשימוש בחקירה תעתיקית של איברים אחרים. הבחירה ואופטימיזציה של נוגדנים הפועלים עבור כתמים מהירים יהיה הכרחי. נוגדן שעובד בפרוטוקול כתמים רגיל לא בהכרח עובד עבור פרוטוקול הכתם המהיר, אשר ככל הנראה דורש נוגדנים זיקה גבוהה. נוגדן מצומד ראשי ימזער את הצעדים הדרושים ועשוי להציע יתרונות. עם זאת, הטיה של נוגדן לפלואורופורים עשויה לשנות את הכריכה, ויש לבצע ניסויי פיילוט לפני שילוב ריאגנטים אלה בפרוטוקול.
לסיכום, אנו מתארים צינור למיקרו-דיסקציה לייזר מבוססת פלואורסצנטיות כדי לבודד אזורים ומבנים ספציפיים בכליה האנושית כדי לאפשר ניתוח תמלולומי. גישה זו מציעה יתרונות חשובים וניתן להרחיב אותה לרקמות אחרות כדי לספק חקירה מולקולרית מבוססת רקמות. תעתיקים אזוריים משלימים טכנולוגיות תמלולומיות אחרות על ידי מתן עוגן היסטופטולוגי להבנת הביטוי, סיוע בפרשנות הביולוגיה וחתימת הבריאות והמחלה. טכנולוגיה זו מתאימה באופן טבעי בתוך החזון לבניית אטלס תעתיק של הכליה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
כללי: המחברים מבקשים להודות לחוקרי פרויקט הרפואה המדויקת בכליות (www.kpmp.org) על תמיכתם ואדיבותם וייעוץ.
מימון ומימון: תמיכה בעבודה זו ניתנה על ידי NIH / NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). מחקר שדווח בכתב יד זה נתמך על ידי המכון הלאומי לסוכרת ועיכול ומחלות כליות (NIDDK) פרויקט רפואת דיוק כליות (KPMP), (www.kpmp.org), תחת מספר הפרס U2CDK114886.
זמינות נתונים וחומרים: הנתונים מאוחסנים בארכיון ב- Omnibus ביטוי גנים (GEO # ממתין)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
- Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance. , Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016).
- Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
- Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).
