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Biology

मानव गुर्दे के ऊतकों में क्षेत्रीय ट्रांसक्रिप्टोमिक्स को उजागर करने के लिए लेजर माइक्रोडिसेक्शन का आवेदन

Published: June 9, 2020 doi: 10.3791/61371
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 4, 1, 1, 1, For The Kidney Precision Medicine Project,
1Department of Medicine, Indiana University School of Medicine, 2Department of Cellular & Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine, 3Division of Nephrology, Department of Medicine, Ohio State University Wexner Medical Center, 4Division of Pathology, Indiana University School of Medicine

Summary

हम मानव गुर्दे के उप-खंडों के लेजर माइक्रोडिसेक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें ग्लोमेरुलस, समीपस्थ ट्यूबल, मोटी आरोही अंग, डक्ट और इंटरस्टिटियम इकट्ठा करना शामिल है। आरएनए को प्राप्त डिब्बों से अलग किया जाता है और प्रत्येक उप-खंड के भीतर ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षर में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए आरएनए अनुक्रमण किया जाता है।

Abstract

मानव गुर्दे के ऊतकों का जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण होमोस्टेसिस और रोग रोगविज्ञान को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। संकल्प और इस तकनीक की गहराई बढ़ाने और ऊतक के भीतर कोशिकाओं के स्तर तक विस्तार की जरूरत है । हालांकि एकल परमाणु और एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण का उपयोग व्यापक हो गया है, ऊतक वियोजन से प्राप्त कोशिकाओं की अभिव्यक्ति हस्ताक्षर स्थानिक संदर्भ को बनाए नहीं रखते हैं। विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्कर के आधार पर लेजर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) ज्ञात स्थानीयकरण के साथ विशिष्ट संरचनाओं और ब्याज के सेल समूहों के अलगाव की अनुमति देगा, जिससे गुर्दे के ऊतकों में स्थानिक रूप से लंगर डाले गए ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षरों के अधिग्रहण को सक्षम किया जा सकेगा। हमने मानव गुर्दे के भीतर पांच अलग-अलग डिब्बों को अलग करने और मूल्यवान मानव गुर्दे के ऊतक नमूनों से बाद में आरएनए अनुक्रमण का संचालन करने के लिए तेजी से फ्लोरेसेंस-आधारित दाग द्वारा निर्देशित एक एलएमडी पद्धति को अनुकूलित किया है। हम एकत्र नमूनों की पर्याप्तता के आकलन को सक्षम करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण मापदंड भी प्रस्तुत करते हैं। इस पांडुलिपि में उल्लिखित कार्यप्रवाह उच्च आत्मविश्वास के साथ उप-खंडीय प्रतिलिपि हस्ताक्षरों को अलग करने के लिए इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता को दर्शाता है। यहां प्रस्तुत पद्धतिगत दृष्टिकोण को प्रासंगिक एंटीबॉडी मार्कर के प्रतिस्थापन के साथ अन्य ऊतक प्रकारों पर भी लागू किया जा सकता है।

Introduction

ऊतक नमूनों का अध्ययन करने में तकनीकी प्रगति ने विभिन्न अंगों में स्वास्थ्य और रोग की स्थिति की समझ में सुधार किया है। इस तरह के अग्रिमों ने रेखांकित किया है कि विकृति सीमित क्षेत्रों में या विशिष्ट कोशिका प्रकारों में शुरू हो सकती है, फिर भी पूरे अंग पर महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं। इसलिए, व्यक्तिगत चिकित्सा के वर्तमान युग में, कोशिका और क्षेत्रीय दोनों स्तरों पर जीव विज्ञान को समझना महत्वपूर्ण है और न केवल विश्व स्तर पर1। यह गुर्दे में विशेष रूप से सच है, जो विभिन्न विशेष कोशिकाओं और संरचनाओं से बना है जो अलग-अलग रूप से शुरू करते हैं और/या पैथोलॉजिकल तनाव का जवाब देते हैं । विभिन्न प्रकार की मानव गुर्दे की बीमारी के रोगजनन अभी भी अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहा है। मानव गुर्दे में विशिष्ट ट्यूबलर खंडों, संरचनाओं या इंटरस्टिटियम के क्षेत्रों में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक पद्धति पैदा करने से क्षेत्र विशिष्ट परिवर्तनों को उजागर करने की क्षमता में वृद्धि होगी जो रोग के रोगजनकों पर सूचित कर सकते हैं ।

मानव गुर्दे बायोप्सी नमूने एक सीमित और कीमती संसाधन हैं। इसलिए, गुर्दे के ऊतकों में ट्रांसक्रिप्टोमिक्स से पूछताछ करने वाली प्रौद्योगिकियों को ऊतक को अर्थव्यवस्था बनाने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। सेल और क्षेत्रीय स्तर पर ट्रांसक्रिप्टोमिक्स का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध तरीकों में एकल सेल आरएनए अनुक्रमण (scRNaseq), एकल परमाणु RNaseq (snRNaseq), सीटू स्थानिक संकरण में, और लेजर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) शामिल हैं। उत्तरार्द्ध ऊतक वर्गों के भीतर क्षेत्रों या रुचि की संरचनाओं के सटीक अलगाव के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, डाउनस्ट्रीम आरएनए अनुक्रमण और विश्लेषण2,3,4,5के लिए। विच्छेदन के दौरान फ्लोरेसेंस-आधारित इमेजिंग का उपयोग करके मान्य मार्कर के आधार पर विशिष्ट सेल प्रकार या संरचनाओं की पहचान पर भरोसा करने के लिए एलएमडी अपनाया जा सकता है।

लेजर माइक्रोडिसेक्शन असिस्टेड रीजनल ट्रांसक्रिप्टोमिक्स की अनूठी विशेषताओं में शामिल हैं: 1) कोशिकाओं और संरचनाओं के स्थानिक संदर्भ का संरक्षण, जो एकल कोशिका प्रौद्योगिकियों का पूरक है जहां कोशिकाओं को हिस्टोलॉजिकल रूप से अभिव्यक्ति द्वारा पहचाना जाता है; 2) प्रौद्योगिकी अन्य इमेजिंग प्रौद्योगिकियों द्वारा सूचित और सूचित की जाती है क्योंकि एक एंटीबॉडी मार्कर अभिव्यक्ति हस्ताक्षरों को परिभाषित करता है; 3) रोग में मार्कर बदलने पर भी संरचनाओं की पहचान करने की क्षमता; 4) लगभग 20,000 जीन में नीच व्यक्त टेप का पता लगाना; और 5) उल्लेखनीय ऊतक अर्थव्यवस्था। यह तकनीक पर्याप्त आरएनए अधिग्रहण के लिए आवश्यक कोर की 100 माइक्रोन मोटाई से कम के साथ गुर्दे की बायोप्सी के लिए स्केलेबल है और संग्रहीत जमे हुए ऊतकों के उपयोग को सक्षम बनाती है, जो आमतौर पर बड़े भंडार या अकादमिक केंद्रों में उपलब्ध हैं6।

आगामी काम में, हम विस्तार से क्षेत्रीय और थोक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स तकनीक का वर्णन करते हैं, जो मानव गुर्दे के ऊतकों के साथ उपयोग के लिए एक उपन्यास रैपिड फ्लोरेसेंस धुंधला प्रोटोकॉल के साथ अनुकूलित होता है। यह दृष्टिकोण क्लासिक एलएमडी अन्वेषणों पर सुधार करता है क्योंकि यह कुल तुबुलोइंटिशियल अभिव्यक्ति के विपरीत इंटरस्टिटियम और नेफ्रॉन उप-खंडों के लिए अलग अभिव्यक्ति डेटा प्रदान करता है। कठोरता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए लागू गुणवत्ता आश्वासन और नियंत्रण उपाय शामिल हैं। यह प्रोटोकॉल कोशिकाओं और रुचि के क्षेत्रों के दृश्य को सक्षम बनाता है, जिसके परिणामस्वरूप इन अलग-थलग क्षेत्रों से आरएनए का संतोषजनक अधिग्रहण होता है ताकि डाउनस्ट्रीम आरएनए अनुक्रमण की अनुमति दी जा सके ।

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Protocol

इस अध्ययन को इंडियाना विश्वविद्यालय में संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा उपयोग के लिए मंजूरी दी गई थी ।

नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग गुर्दे के नेफ्रेक्टॉमी ऊतक (एक्स और वाई दोनों आयामों में 2 सेमी तक) के साथ करें जो इष्टतम कटिंग टेम्परेचर (OCT) यौगिक में संरक्षित है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है। सभी काम को इस तरीके से करें कि आरएनए संदूषण को सीमित करता है, स्वच्छ डिस्पोजेबल दस्ताने और फेस मास्क का उपयोग करें। सभी सतहों की सफाई सुनिश्चित करें। जिस उपकरण के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था, वह एक लेजर माइक्रोडिसेक्शन सिस्टम है जिसमें स्पंदित यूवी लेजर की विशेषता है।

1. क्रायोसेक्शनिंग

  1. 1.2 माइक्रोन एलएमडी पीपीएस-झिल्ली (पॉली (पी-फेनिलीन सल्फाइड) स्लाइड को यूवी लाइट (ऊतक संस्कृति लैमिनार फ्लो हुड में) को 30 मिनट के लिए बेनकाब करें, तुरंत क्रायोस्ेक्शनिंग से पहले। इष्टतम ऊतक पालन के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड स्टोर करें।
  2. क्रायोस्टेट को -20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। काम सतहों को साफ करें और एक नया काटने ब्लेड स्थापित करें।
  3. ताजा कट ऊतक के साथ स्लाइड स्टोर करने के लिए क्रायोस्टेट चैंबर के अंदर एक छोटा स्लाइड बॉक्स (RNase सतह पराकर्मण समाधान के साथ साफ) रखें।
  4. एक ऊतक धारक को अक्टूबर में नमूना का पालन करें और यह कुछ मिनट के लिए संतुलन के लिए चैंबर तापमान तक पहुंचने और OCT ब्लॉक और धारक के बीच आसंजन को मजबूत बनाने के लिए अनुमति देते हैं । एक गर्मी चिमटा का उपयोग करके प्रक्रिया सहायता।
  5. 12 माइक्रोन की मोटाई के लिए नमूना काटें और स्लाइड एडाप्टर का उपयोग करके, विशेष एलएमडी स्लाइड में इसे प्रत्यय करें। प्रत्येक स्लाइड में प्रति स्लाइड एक नेफ्रेक्टॉमी सेक्शन या प्रति स्लाइड दो किडनी बायोप्सी सेक्शन तक है। स्लाइड बॉक्स के अंदर जमने से अतिरिक्त नमी को रोकने के लिए एक डेसीकेंट कारतूस के साथ और एक कसकर बंद प्लास्टिक बैग के अंदर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर करें।
  6. प्रत्येक स्लाइड को नमूना आईडी, तिथि और स्लाइड नंबर के साथ लेबल करें।
  7. क्रायोसेक्शनिंग की शुरुआती तारीख से 10 दिनों के भीतर नमूनों के साथ स्लाइड्स का इस्तेमाल करें।

2. लेजर माइक्रोडिसेक्शन

  1. धुंधला होने से तुरंत पहले, निम्नलिखित जोड़कर आरएनएसई-मुक्त पीबीएस में 10% बीएसए में एंटीबॉडी मिक्स (एबी-मिक्स) तैयार करें: 4 μL of FITC-Phalloidin, DAPI के 1.5 माइक्रोन, टाम-हॉर्सफॉल प्रोटीन (टीएचपी) एंटीबॉडी के 2 माइक्रोन सीधे एलेक्सा फ्लोर 546, आरएनएसई अवरोधक के 3.3 माइक्रोन, और पीबीएस में 10% बीएसए के 89.2 माइक्रोन (100 माइक्रोन की मात्रा तक पहुंचने के लिए)।
    नोट: टीएचपी एंटीबॉडी के स्थान पर वैकल्पिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मेगालिन/LRP2 एंटीबॉडी के 2 μL, सीधे एलेक्सा फ्लोर ५६८ के लिए संयुक् त के लिए संविलियन ट्यूबल लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एबी-मिक्स में या तो LRP2 या THP एंटीबॉडी शामिल है (क्रमशः या तो समीपस्थ ट्यूबल या मोटी आरोही अंगों की कल्पना करने के लिए)। अन्य एंटीबॉडी उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुसार मान्य किया जा सकता है।
  2. बर्फ ठंड में स्लाइड धोएं (-20 डिग्री सेल्सियस) 1 मिनट के लिए 100% एसीटोन और इसे आर्द्रता कक्ष में ले जाएं।
  3. 30 एस दोहराने के लिए RNase मुक्त PBS के साथ स्लाइड के शीर्ष धोएं ।
  4. 30 एस दोहराने के लिए RNase-मुक्त PBS में 10% बीएसए के साथ स्लाइड के शीर्ष धोएं ।
  5. 5 मिनट के लिए एबी-मिक्स लगाएं।
  6. 30 एस दोहराने के लिए RNase-मुक्त PBS में 10% बीएसए के साथ स्लाइड के शीर्ष धोएं ।
  7. हवा 5 मिनट के लिए स्लाइड सूखी और लेजर microdissection काटने मंच पर लोड ।
  8. पीसीआर काम के लिए उपयुक्त संग्रह ट्यूब (ऑटोक्लेवेड 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब) स्थापित करें, जिसमें आरएनए आइसोलेशन किट से निष्कर्षण बफर के 50 माइक्रोनल शामिल हैं।
  9. एलएमडी के साथ आगे बढ़ें। प्रत्येक एलएमडी सत्र को अधिकांश 2 घंटे के भीतर पूरा करें।
    1. इंटर-ऑपरेटर परिवर्तनशीलता के साथ-साथ अभिलेखीय उद्देश्यों, प्रशिक्षण और प्रदर्शन प्रोटोकॉल के गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए विच्छेदन को मान्य करने के लिए माइक्रोस्कोप कैमरे का उपयोग करके प्री-और पोस्ट-एलएमडी इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों को एकत्र करें। आरएनए के 0.5 - 1 एनजी प्राप्त करने के लिए, न्यूनतम 500,000 माइक्रोन2 क्षेत्र की आवश्यकता होती है। यह अक्सर ब्याज के सभी उप-खंडों के लिए पर्याप्त मात्रा में सामग्री प्राप्त करने के लिए 8 x12 माइक्रोन मोटी वर्गों तक के उपयोग की आवश्यकता होती है।
    2. धुंधला, आकृति विज्ञान और स्थान द्वारा ब्याज के क्षेत्रों की पहचान करें और उन्हें 40 से अधिक लेजर शक्ति का उपयोग करके उत्पादित करें।
      नोट: यहां विच्छेदन मापदंड हैं । समीपस्थ ट्यूबल को फिटसी-फलोडिन और एलआरपी 2 लेबलिंग द्वारा परिभाषित किया गया है। मोटी आरोही अंग टीएचपी लेबलिंग द्वारा परिभाषित किया गया है। संग्रह वाहिनी परमाणु आकृति विज्ञान (DAPI) और अन्य धुंधला की अनुपस्थिति द्वारा परिभाषित किया गया है। ग्लोमेरुलस को फिटसी-फलोइडिन और आकृति विज्ञान द्वारा परिभाषित किया गया है। इंटरस्टिटियम को दाग वाले ट्यूबलों के बीच के क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है।
  10. एक एलएमडी स्लाइड करने के लिए दो 12 माइक्रोन वर्गों को चिपकाकर और निष्कर्षण बफर में पूरे वर्गों को विच्छेदन करके एक थोक क्रॉस-सेक्शनल अभिव्यक्ति हस्ताक्षर प्राप्त करें।
  11. एलएमडी प्रक्रिया के पूरा होने पर, संग्रहित माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों को बंद करें और यह सुनिश्चित करने के लिए इसे सख्ती से झटका दें कि सामग्री टोपी से ट्यूब के नीचे तक चली गई
  12. 30 एस के लिए 3,000 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।
  13. 30 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
  14. 2 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।
  15. सुपरनेट को एक नई 0.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे -80 डिग्री सेल्सियस में स्टोर करें।

3. आरएनए अलगाव

नोट: इस आरएनए अलगाव प्रोटोकॉल के लिए, हम एक वाणिज्यिक आरएनए अलगाव किट से एक प्रोटोकॉल अनुकूलित किया है । परियोजना के लिए निर्धारित गुणवत्ता नियंत्रण आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल को संशोधित किया गया है।

  1. प्रत्येक आरएनए शुद्धिकरण कॉलम (पीसी) में वातानुकूलित बफर (सीबी) के 250 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. 16,000 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए सभी पीसी सेंट्रलाइज।
  3. ऊतक के नमूनों के साथ ट्यूबों में 70% इथेनॉल (किट में प्रदान) के 50 माइक्रोन जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइपिंग करके नमूनों को अच्छी तरह से मिलाएं। भंवर न करें। अपकेंद्रित्र न करें।
  4. मिश्रण को 100 x ग्राम (आरएनए को बांधने के लिए) में 2 मिनट के लिए वातानुकूलित पीसी और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें, जल्दी से 16,000 x ग्राम (प्रवाह को हटाने के लिए) पर 30 एस के लिए अपकेंद्रित्र का पालन करें। यदि ऊतक नमूनों के साथ 1 ट्यूब से अधिक किसी भी उप-खंड के लिए उपलब्ध हैं तो इस चरण को दोहराएं।
  5. पीसी में वॉश बफर 1 (WB1) के 100 माइक्रोन जोड़ें और 8,000 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें।
  6. प्रत्येक नमूने के अनुसार DNase के 40 μL तैयार करें (आरडीडी बफर के 35 माइक्रोन में DNase के 5 माइक्रोन जोड़ें)। फिर मिश्रण के 40 μL सीधे पीसी की झिल्ली पर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  7. पीसी की झिल्ली पर WB1 के 40 μL जोड़ें, और 8,000 x gपर 15 एस के लिए अपकेंद्रित्र।
  8. पीसी की झिल्ली पर वॉश बफर 2 (WB2) के 100 माइक्रोन जोड़ें, और 8,000 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें।
  9. पीसी की झिल्ली पर WB2 के 100 μL जोड़ें, 16,000 x ग्रामपर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, तुरंत 16,000 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के बाद।
  10. पीसी को एक नई 0.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  11. झिल्ली पर एल्यूशन बफर (ईबी) के 12 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर 7 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इस प्रकार, सभी पूल किए गए विच्छेदित ऊतक नमूनों की अंतिम मात्रा प्रति उप-खंड 12 माइक्रोन है।
  12. 1,000 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए नमूनों को सेंट्रलाइज करें और फिर 16,000 x ग्राम पर 2 मिनट केलिए।
  13. बायोएनालाइजर विश्लेषण के लिए एक ताजा ट्यूब में 2 माइक्रोन स्थानांतरित करें (फ्रीज-गल घटनाओं को रोकने के लिए)।
  14. आगे की प्रक्रिया के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस में सभी ट्यूबों को स्टोर करें।

4. आरएनए अनुक्रमण

  1. प्रत्येक नमूने का आकलन करें, अनुक्रमण के लिए, एक वाणिज्यिक बायोएनालाइजर का उपयोग करके गुणवत्ता के लिए और आरएनए की छोटी मात्रा को मापने के लिए समर्पित एक चिप।
  2. लाइब्रेरी प्रेप और अनुक्रमण से पहले निम्नलिखित गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) मापदंडों की आवश्यकता होती है: आरएनए की मात्रा थोक के लिए 4 एनजी से अधिक और प्रत्येक उप-खंड के लिए 0.5 - 1 एनजी से अधिक; एलएमडी नमूनों (इष्टतम और 75%) के लिए 200 न्यूक्लियोटाइड (डीवी200) से अधिक लंबे टेप का प्रतिशत 25% से अधिक होना आवश्यक है।
  3. अवक्रमित आरएनए की छोटी मात्रा के लिए एक वाणिज्यिक सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी किट के साथ पुस्तकालय तैयारी करें। पूरक में सूचीबद्ध वाणिज्यिक किट के लिए, हम विकल्प 2 का उपयोग करने का सुझाव देते हैं, जिसके लिए न्यूनतम DV200 25% की आवश्यकता होती है और कोई विखंडन नहीं होता है। कुछ अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों को उच्च न्यूनतम DV200 थ्रेसहोल्ड की आवश्यकता हो सकती है, जैसे कि 30%7।
  4. सीडीएनए एडाप्टर और इंडेक्स जोड़ें।
  5. चुंबकीय मनका प्रौद्योगिकी का उपयोग कर RNAseq पुस्तकालयों को शुद्ध करें।
  6. आरएनसीक्यू लाइब्रेरी प्रवर्धन चरण से पहले एक वाणिज्यिक आरआरएनए हटाने किट का उपयोग करके रिबोसोमल सीडीएनए को कम करें।
  7. एक 2 एनजी/μL सीडीएनए पुस्तकालय एकाग्रता में चुंबकीय मनका प्रौद्योगिकी का उपयोग कर अंतिम RNAseq पुस्तकालय शुद्ध ।
  8. 30 मिलियन रीड्स/नमूना थोक के लिए और 100 मिलियन रीड्स/नमूना उप-खंडीय वर्गों के लिए एक वाणिज्यिक अनुक्रमण प्रणाली पर 75 बीपी पेयड एंड का आरएनए अनुक्रमण करें।
  9. बैच प्रभाव के नियंत्रण के लिए अनुमति देने के लिए हर अनुक्रमण रन के साथ एक संदर्भ आरएनए (25 माइक्रोन) का उपयोग करें। हमारे संदर्भ आरएनए की प्रारंभिक एकाग्रता 1 μg/μL है, जबकि अनुक्रमण में उपयोग की गई अंतिम एकाग्रता 25 एनजी/μL है । पुस्तकालय की तैयारी के दौरान एक अलग नमूने के रूप में संदर्भ आरएनए चलाएं और हर बार सभी एलएमडी नमूनों के साथ चलाएं ।
  10. अनुक्रमण, इंटरजेनिक और माइटोकॉन्ड्रियल की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए FastQC आवेदन का उपयोग कर डेटा विश्लेषण करें और एक जीन के लिए जिम्मेदार पढ़ता है निर्धारित करने के लिए।
  11. ट्रांसक्रिप्ट अभिव्यक्ति उपायों के लिए अलाइनमेंट और एजर/आरबीएमटूल के लिए इंटीग्रेटिव जीनोमिक्स व्यूअर (आईजीवी) का इस्तेमाल करें ।
  12. 100,000 से कम के साथ नमूने हटाएं पढ़ता है। क्वांटाइल एक उपयोगकर्ता परिभाषित सीमा पर नीच व्यक्त जीन को छानने के बाद सेट डेटा में कच्चे पढ़ता है सामान्य ।
  13. अभिव्यक्ति को अन्य सभी उप-खंडों और लॉग2-ट्रांसफॉर्म के औसत के लिए ब्याज के उप-खंड के अनुपात के रूप में निर्धारित करें। एक ही जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति की तुलना उप-खंडों और नमूनों में की जा सकती है; हालांकि, जीन और आरएनए प्रजातियों में गिरावट में संभावित अंतर के कारण दो अलग-अलग जीनों के बीच सापेक्ष अभिव्यक्ति की तुलना करना आदर्श नहीं है।
  14. प्रत्येक नेफ्रॉन उप-खंड के लिए विशिष्ट निर्माताओं के एक सेट के लिए जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए एक संवर्धन विश्लेषण करें, जबकि संदर्भ आरएनए नमूनों की तुलना बैचों में की जाती है । आर मूल्य और 0.9 के साथ मतलब अभिव्यक्ति के 1 मानक विचलन के भीतर एक बैच प्रभाव स्वीकार्य माना जाता है। उच्च बैच प्रभाव स्कोर के लिए अतिरिक्त सामान्यीकरण की आवश्यकता होती है। स्वीकृत बैच प्रभाव से विचलित होने वाले किसी भी रन को हरी झंडी दिखाई जा सकती है। Q30 प्रत्येक अनुक्रमण रन के लिए और अधिक से अधिक 90% होना चाहिए।

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Representative Results

नमूने

हम नौ संदर्भ नेफ्रेक्टॉमी (इंडियाना विश्वविद्यालय में प्राप्त 3 नमूनों और गुर्दे की सटीक चिकित्सा परियोजना के माध्यम से प्राप्त 6 नमूनों) से डेटा प्रस्तुत करते हैं, गुर्दे के नेफ्रॉन खंडों और अंतर-तकनीकी क्षेत्रों को अलग करने के लिए तेजी से फ्लोरेसेंस धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं। इस प्रक्रिया में उपयोग किए गए अनुभाग मृतक गुर्दे दाताओं या अप्रभावित ट्यूमर नेफ्रेक्टॉमी से प्राप्त किए गए थे। इन नमूनों में रोग के रोगिक साक्ष्य नहीं थे, जैसा कि समीपस्थ वर्गों(चित्रा 1 ए)से लिए गए एच एंड ई दाग में कल्पना की गई थी।

लेजर माइक्रोडिसेक्शन क्वालिटी कंट्रोल

गुर्दे में ट्यूबलर उप-खंडों की पहचान अद्वितीय ट्यूबलर मार्कर, साथ ही आकृति विज्ञान और संरचनात्मक स्थलों के एंटीबॉडी धुंधला के माध्यम से पूरा किया जाता है। चित्रा 1बी-सी एक प्रतिनिधि नेफ्रेक्टॉमी से ट्यूबलर उप-खंडों के धुंधला और माइक्रोडिसेक्शन को दिखाता है। यह DAPI (नाभिक), फिटसी-फल्लोइडिन (एफ-ऐक्टिन) और आवश्यक के रूप में एक अतिरिक्त एंटीबॉडी के साथ धुंधला करके पूरा किया जाता है। फ्लोरेसेंस धुंधला उपयोग किए जाने से उच्च स्तर के आत्मविश्वास के साथ गुर्दे के उप-खंडों की कल्पना करना संभव हो गया, जो रूपात्मक सुविधाओं के साथ-साथ इमेज्ड संरचनाओं(चित्र 2)की स्थानिक स्थिति द्वारा निर्देशित हो गया। उदाहरण के लिए, ग्लोमेरुली को बहुत विशिष्ट आकृति विज्ञान के साथ फलोइडिन और डीएपीआई धुंधला द्वारा प्रकट किया जाता है। इसी तरह, परमाणु आकृति विज्ञान और अन्य दागों की अनुपस्थिति का उपयोग करके नलिकाओं को इकट्ठा करने की कल्पना की जाती है। मेगालिन/LRP2 एंटीबॉडी (सीधे एलेक्सा फ्लोर ५६८ के लिए संयुक्या) यहां प्रयोग किया जाता है समीपस्थ ट्यूबल की पहचान करने के लिए । मोटी आरोही अंग को टाम-हॉर्सफॉल प्रोटीन (टीएचपी) एंटीबॉडी (सीधे एलेक्सा फ्लोर 546 से संयुग्मित) का उपयोग करके कल्पना की जाती है। इसके विपरीत, इंटरस्टिटियम ट्यूबल की बाहरी झिल्ली के साथ उत्पादित किया जाता है और इसमें स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ-साथ छोटी केशिकाएं भी शामिल हैं।

0.5 - 1 एनजी प्रति उप-खंड के पर्याप्त आरएनए प्राप्त करने के लिए, हम 500,000 माइक्रोन2के न्यूनतम क्षेत्र को विच्छेदन करना चाहते हैं। यह आम तौर पर सभी उप खंडों के लिए पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने के लिए पांच से आठ 12 माइक्रोन मोटी वर्गों (प्रति स्लाइड 1 अनुभाग) की आवश्यकता होती है । आरएनए गुणवत्ता को संरक्षित करने के लिए किसी भी स्लाइड का विच्छेदन 2 घंटे से भी कम समय में पूरा हो जाता है जो प्रति स्लाइड ~ 4 सेगमेंट को काटने की अनुमति देता है। एक ही उप-खंड से अधिग्रहीत ऊतक डाउनस्ट्रीम अनुक्रमण के लिए कई स्लाइडों से एकत्र किया जाता है। संलग्न कैमरे का उपयोग करके ब्याज के उप-खंडों के संग्रह को मान्य करने के लिए एक पूर्व और पोस्ट-एलएमडी इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि प्राप्त की जाती है। चित्रा 3 विच्छेदन क्षेत्र और न्यूनतम आरएनए इनपुट की सफलता दर को चित्रित करता है। इस प्रतिनिधि डेटासेट में न्यूनतम क्षेत्र इनपुट को पूरा करने की सफलता दर >90% थी। यदि स्रोत ऊतक सीडी या इंटरस्टिटियम की एक छोटी राशि है, वहां एक संभावना विच्छेदन क्षेत्र 8 स्लाइड का उपयोग करने के बाद इन खंडों के लिए ५००,०μm 2 से नीचे हो जाएगा । उपयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर अतिरिक्त स्लाइडों में कटौती की जा सकती है; हालांकि, जैसा कि चित्र 3में देखा गया है, यदि क्षेत्र 500,000 माइक्रोन2के करीब है, तो वांछित जीन का पता लगाया गया गिनती में उच्च सफलता दर (100%) और कुल पढ़ा गिनती सफलता दर 98.6% है (1 नमूना QC मीट्रिक से नीचे गिर गया).. इस प्रकार, पर्याप्त जीन प्राप्त करने और अतिरिक्त ऊतकों का उपयोग किए बिना गिनती पढ़ने के लिए पर्याप्त ऊतक था।

इनपुट क्वालिटी कंट्रोल अनुक्रमण

चयनित वाणिज्यिक पुस्तकालय तैयारी और अनुक्रमण मंच अत्यधिक अपमानित आरएनए की कम मात्रा के साथ भी ट्रांसक्रिप्ट अभिव्यक्ति के प्रजनन योग्य माप की अनुमति देता है। न्यूनतम आरएनए इनपुट 500 स्नातकोत्तर है और न्यूनतम DV200 (लंबाई में 200 न्यूक्लियोटाइड से अधिक समय तक पढ़ता है) का अनुपात 25% से ऊपर है। कोई न्यूनतम आरआईआईएन नहीं है। 100 मिलियन प्रति नमूना पढ़ता है के साथ अनुक्रमण, हम उपलब्ध पढ़ता है तर करने के लिए नीच व्यक्त टेप का पता लगाने के लिए चाहते हैं। कुल पढ़ता है उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।

यह दो 12 माइक्रोन थोक पार अनुभागीय वर्गों से पर्याप्त आरएनए प्राप्त करने के लिए सीधा है, इसलिए हम थोक अनुक्रमण के लिए 4 एनजी की उच्च न्यूनतम कुल एमआरएनए मात्रा प्राप्त करना चाहते हैं। जैसा कि प्रोटोकॉल में चित्रित किया गया है, प्रत्येक उप-खंड को कुल आरएनए में 0.5-1 एनजी की आवश्यकता होती है। इष्टतम आरएनए एकाग्रता अलगाव के बाद ५० स्नातकोत्तर/μL से ऊपर है । आरएनए की मात्रा इससे कम होती है जिससे जीन का पता लगाना कम हो सकता है और गणना की गई गिनती पढ़ी जा सकती है । अधिकांश नमूने उपज और 20,000 जीन का पता लगाया गया है और 1 मिलियन पढ़ता है। सभी नमूनों के लिए 25% से अधिक डीवी 200 निर्माता द्वारा आवश्यक है (>75% इष्टतम माना जाता है)। हालांकि RIN मापा जाता है, लेजर माइक्रोडिसेक्शन की प्रक्रिया RIN कम कर देता है और आरएनए अनुक्रमण प्लेटफार्मों खंडित आरएनए के लिए अनुकूलित किया गया है । आरएनए मात्रा और गुणवत्ता का मूल्यांकन अनुक्रमण से पहले एक बायोएनालाइजर द्वारा किया जाता है। तेजी से दाग समय ऊतक कमरे के तापमान और जलीय स्थितियों के संपर्क में है की मात्रा कम हो जाती है, जिससे संभव सीमा तक कम, आरएनए के क्षरण । इनपुट अनुक्रमण के लिए डीवी200 गुणवत्ता नियंत्रण मीट्रिक भी चित्र 3 में पाया गयाहै।

अनुक्रमण आउटपुट गुणवत्ता नियंत्रण

डाउनस्ट्रीम डेटा प्रोसेसिंग विभिन्न बैचों में नमूनों के बीच तुलना की अनुमति देने के लिए क्वांटाइल सामान्यीकरण का उपयोग करता है। १०,० की न्यूनतम जीन डिटेक्शन काउंट और १,०,० की न्यूनतम रीड काउंट को क्वांटिकल नॉर्मलाइजेशन में नमूनों को शामिल करने के लिए थ्रेसहोल्ड के रूप में नियोजित किया जाता है । कम जीन का पता लगाने या पढ़ने की गिनती वाले नमूनों को मात्रा सामान्यीकरण और बाद में तुलनात्मक विश्लेषणों से बाहर रखा गया है । 98 विच्छेदित उप-खंडीय नमूनों में से केवल 1 ही इन थ्रेसहोल्ड(चित्र 3)को पूरा करने में विफल रहे। Q30 (99.9% विश्वास पर मैप किया गया पढ़ता है का अनुपात) प्रत्येक अनुक्रमण प्रयोग(चित्रा 4)के लिए 93% से अधिक रहा है।

हम प्रत्येक अनुक्रमण रन के साथ एक मानव संदर्भ आरएनए (25 एनजी) अनुक्रम बैच प्रभाव के लिए सुधार की अनुमति देने के लिए अगर इस तरह के सुधार वांछित या आवश्यक है । मापा बैच प्रभाव एक आर मूल्य और जीटी और 0.9 के साथ मतलब अभिव्यक्ति के 1 मानक विचलन के भीतर होना चाहिए। यदि बैच प्रभाव अधिक है, तो उस अनुक्रमण रन के लिए अतिरिक्त सामान्यीकरण की आवश्यकता होती है। यहां, चित्र 4 में चित्रित चार अनुक्रमण प्रयोगों में बैच प्रभाव 3% से नीचेरहा है । इस प्रकार, बैच प्रभाव आम तौर पर सभी अनुक्रमण रन के लिए मात्रा सामान्यीकरण के साथ संबोधित किया जाता है, संदर्भ आरएनए के लिए नास्तिक। संदर्भ आरएनए के आधार पर कोई सुधार अभी तक लागू नहीं किया गया है, लेकिन यह जानकारी उपलब्ध है और एक विशेष विश्लेषण के लक्ष्यों के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है ।

कठोरता और प्रजनन क्षमता

सेल प्रकार और संरचनाओं की पहचान करने में कठोरता प्रदर्शित करना महत्वपूर्ण है। लेजर माइक्रोडिसेक्शन के बाद, हम अन्य डिब्बों(तालिका 1)की तुलना में ग्लोमेरुली, पीटी, टीएएल, सीडी और इंटरस्टिटियम में ज्ञात मार्कर के संवर्धन के लिए परीक्षण करते हैं। एक संवर्धन विश्लेषण पूर्व निर्धारित अपेक्षित मार्कर के लिए जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । जीन अभिव्यक्ति को अन्य उप-खंडों के अर्थ की तुलना में ब्याज के उप-खंड की अभिव्यक्ति के लॉग2 अनुपात के रूप में बताया जाता है। यह अभिव्यक्ति मीट्रिक मानव नमूनों के लिए चुना गया था क्योंकि यह अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता को कम करता है, नमूनों में सेल और डिब्बे के प्रकारों के बीच तुलना को सुविधाजनक बनाता है। हालांकि, कच्चे पढ़ता है और मात्रा सामान्यीकृत पढ़ता है भी वैकल्पिक विश्लेषण में तुलना की जा सकती है । स्कोलई 5 इन 5 चयनित ज्ञात मार्कर के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला के उदाहरण दिखाता है, जैसा कि मानव प्रोटीन एटलस में प्रस्तुत किया गया है।

इस प्रकार, हम ऑर्थोगोनल डेटा स्रोत पेश करते हैं जो एकत्र किए जा रहे सही उप-खंड को विश्वास प्रदान करते हैं: 1) इमेजिंग जिसमें सेगमेंट/डिब्बे की एंटीबॉडी दाग और आकृति विज्ञान शामिल है, और 2) ज्ञात मार्कर दिखाने वाले अभिव्यक्ति उत्पादन को इसी उप-खंड में व्यक्त किया जाता है।

प्रत्येक उप-खंड में व्यक्त जीन का क्षेत्रीय प्रतिलिपि विश्लेषण उपन्यास और कम सराहना मार्कर पहचान के लिए अनुमति देता है। चित्रा 6 एलएमडी क्षेत्रीय ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के माध्यम से पहचाने गए प्रत्येक उप-खंड के लिए एक मार्कर का एक उदाहरण दिखाता है जिसने संबंधित नेफ्रॉन उप-खंड का एक विशिष्ट इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला भी किया।

प्रजनन क्षमता प्रदर्शित करने और ऑपरेटर परिवर्तनशीलता के प्रभाव को समझने के लिए, हमने ट्यूमर नेफ्रेक्टॉमी नमूने पर एक प्रयोग किया। इस नमूने में आरएनए अनुक्रमण परिणामों के आत्मविश्वास को बढ़ाने के लिए ग्लोमेरुली, पीटी और टीएएल को फिर से विच्छेदित किया गया था और अब एक उपयोगी तकनीकी दोहराने के रूप में कार्य करता है। महीनों के अलावा, इस नमूने में ग्लोमेरुली, पीटी और टीएएल डिब्बों के क्रायोसेक्शनिंग, एंटीबॉडी स्टेनिंग, एलएमडी विच्छेदन, आरएनए निष्कर्षण, पुस्तकालय तैयारी और आरएनए अनुक्रमण(चित्रा 7)का दूसरा उदाहरण आया। दो संस्करणों (v1 और v2) की तुलना की गई । ग्लोमेरुलर, पीटी और टीएएल डिब्बों को आर2 मूल्यों और जीटी;0.95 के साथ अत्यधिक सहसंबद्ध किया गया था, जो हमारे संदर्भ आरएनए के न्यूनतम बैच प्रभाव के समान था।

Figure 1
चित्रा 1: गुर्दे के ऊतकों के प्रतिनिधि चित्र।
(A)मानव संदर्भ गुर्दे के ऊतकों का एच एंड ई दाग। (ख)मानव संदर्भ गुर्दे के ऊतकों की इम्यूनोफ्लोरेसेंट छवि एलएमडी से पहले दाग दार घना आरोही अंग खंडों के साथ और(सी)एक मोटी आरोही अंग संरचना के विच्छेदन के तुरंत बाद । स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: संदर्भ गुर्दे के उप-खंडों की प्रतिनिधि छवियां, एक विशिष्ट इम्यूनोफ्लोरेटेंट धुंधला दृष्टिकोण का उपयोग करके 20x पर कल्पना की गई।
(A)एक ग्लोमेरुलस,(बी)समीपस्थ ट्यूबुल,(C)मोटी आरोही अंग,(घ)डक्ट,(ई)इंटरस्टिटियम । (*= पी & 0.05, **= पी < 0.01, ***= पी एंड एलटी; 0.001 ANOVA द्वारा) । स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: सेगमेंटल ट्रांसक्रिप्टोमिक्स में गुणवत्ता नियंत्रण मीट्रिक।
(A) 90% से अधिक पायलट नमूनों में विच्छेदन क्षेत्र इनपुट सीमा 500,000 माइक्रोन2की मिली . (ख)एक को छोड़कर सभी नमूनों में कम से कम 500 पीजी के वांछित आरएनए इनपुट मिले।(ग)100% पायलट नमूनों ने निर्माता की न्यूनतम डीवी200 सीमा को 25% और(डी)100% नमूनों ने हमारी न्यूनतम सीमा को 10,000 जीन का पता लगाया। (ई)एक को छोड़कर सभी नमूने १,०,० की न्यूनतम कुल पठन गणना तक पहुंच गए । जैसा कि अपेक्षित था, कम विच्छेदन क्षेत्र कम आरएनए सांद्रता, कम जीन गिनती और कम पढ़े गए मायने रखता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: अनुक्रमण गुणवत्ता नियंत्रण।
(क)अनुक्रमण एक संदर्भ आरएनए (क्वांटाइल सामान्यीकृत नहीं) को नियोजित करने वाले रन सभी रनों की अभिव्यक्ति की तुलना की जाती है । न्यूनतम बैच प्रभाव (सभी आर और 0.969) के साथ मजबूत संबंध है। (ख)सभी रन में हमारे पढ़ता है की ९३% से अधिक उच्च विश्वास (Q30 या ९९.९%) के साथ मैप किया गया । ध्यान दें कि Q30 मान प्रति लेन के आधार पर प्रदान किए जाते हैं जिसमें प्रति लेन कई लेन होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: चयनित ज्ञात मार्कर की पहचान करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला के उदाहरण।
छवियों के लिए चित्रित किया गया है(A)NPHS1(B)LRP2(C)UMOD(D)SLC4A9(ई)COL6A2 । इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवियां मानव प्रोटीन एटलस से प्राप्त की जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: प्रासंगिक उप-खंडों में गैर-पारंपरिक मार्कर जीन की अभिव्यक्ति को चित्रित करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला के उदाहरण।
इसी इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ चित्रित टेप में(ए)शंक3 इन ग्लोमेरुलस,(बी)एसीएम2बी को समीपस्थ ट्यूबल में, मोटी आरोही अंग में(सी)RAP1GAP, और संग्रह वाहिनी में(डी)L1CAM शामिल हैं । इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवियां मानव प्रोटीन एटलस से प्राप्त की जाती हैं। (*= पी एंड एलटी; 0.0001 ANOVA द्वारा) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7: एक ही नमूने के अलग अनुक्रमण के साथ दो अलग विच्छेदन के बीच सहसंबंध।
(ए)ग्लोमेरुलस,(बी)समीपस्थ ट्यूबल, और हेनले केमोटीआरोही लूप में विभिन्न विच्छेदन के बीच उच्च स्तर का सहसंबंध देखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मार्कर खंड गुना परिवर्तन पी-वैल्यू
NPHS1 ग्लोमेरुलस 32.64 1.97E-08
एलआरपी 2 समीपस्थ ट्यूबल 4.69 1.21E-05
यूओडी मोटी आरोही अंग 24.92 2.00E-07
SLC4A9 डक्ट का संग्रह 4.09 0.000133
COL6A2 इंटरस्टिटियम 7.19 1.47E-06

तालिका 1: शेष उप-खंडों की तुलना में तीन नेफ्रेक्टॉमी नमूनों के बीच ब्याज के प्रत्येक उप-खंड के लिए प्रतिनिधि औसत मान।

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Discussion

एलएमडी आधारित ट्रांसक्रिप्टोमिक्स एक उपयोगी तकनीक है जो ऊतक के भीतर विशिष्ट क्षेत्रों में जीन अभिव्यक्ति को एंकर करती है। इस तकनीक का आधार और गुर्दे में इसके संभावित अनुप्रयोग को पहले8बताया गया है । हालांकि, अनुकूलन, आधुनिकीकरण और फ्लोरेसेंस आधारित विच्छेदन को सुव्यवस्थित करना विशेष रूप से डाउनस्ट्रीम आरएनए अनुक्रमण के लिए उच्च सटीकता विच्छेदन के उद्देश्य से कम सर्वव्यापी है। क्योंकि इस पद्धति को ऊतक के भीतर स्थानिक रूप से आधारित है, इसमें विशेष रूप से रोग राज्यों में ऊतक संरचनाओं में उपन्यास या कम सराहना वाले मार्कर प्रकट करने की क्षमता है। वास्तव में, कोशिकाओं के कई आम मार्कर रोग के साथ बदल सकते हैं, इसलिए स्थानिक संदर्भ के बिना पहचान न्यायनिर्णयन के लिए केवल सेल आरएनए अभिव्यक्ति मार्कर पर निर्भर रोग राज्यों में चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसलिए, स्थानिक रूप से लंगर डाले गए एलएमडी दृष्टिकोण के पूरक होने और एकल कोशिका और एकल परमाणु आरएनए अनुक्रमण जैसी कई अन्य प्रतिलिपि प्रौद्योगिकियों के लिए एक जमीनी-सत्य मंच प्रदान करने की संभावना है, जो मुख्य रूप से उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल9द्वारा कोशिकाओं को परिभाषित करते हैं। इसके अलावा, एलएमडी द्वारा प्रदान की गई जीन अभिव्यक्ति की गहराई (प्रति नमूना 20,000 जीन तक) कई स्रोतों से डेटा को पार करने और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के लिए खाते के लिए एक और लाभ और महत्वपूर्ण स्थान प्रदान करता है जो एक निश्चित गहराई के बिना स्पष्ट नहीं हो सकता है। ऊतक अर्थव्यवस्था का विचार इस तकनीक की एक और सकारात्मक विशेषता है, जिसके तहत एक जमे हुए ब्लॉक से १०० माइक्रोन कुल से कम की मोटाई एक पूरे LMD डेटासेट के लिए पर्याप्त हो सकता है । यह बचे हुए ऊतकों को अन्य विश्लेषणात्मक उद्देश्यों के लिए उपयोग करने की अनुमति देता है।

एलएमडी की सीमाएं हैं। लेजर माइक्रोडिसेक्शन ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा अधिग्रहण की एक प्रत्याशित सीमा इसकी कम थ्रूपुट प्रकृति है। 10,11स्केलेबिलिटी में सुधार करने में भविष्य में स्वचालन महत्वपूर्ण साबित होसकताहै . एलएमडी ट्रांसक्रिप्टोमिक्स की दो अतिरिक्त सीमाओं में विशेषज्ञता पर निर्भरता और डेटा परिणामों पर ऊतक गुणवत्ता का प्रभाव शामिल है। ब्याज के खंड के बाहर कोशिकाओं और सामग्री का अनजाने संग्रह एक ज्ञात सीमा है क्योंकि कोशिकाओं के समृद्ध डिब्बों को एकत्र किया जाता है, एक भी कोशिका नहीं । एलएमडी ऊतक संरचना को समझने में उपयोगकर्ता की प्रवीणता पर निर्भर करता है और इसलिए एक निश्चित डोमेन विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, व्यक्तियों के साथ और एंटीबॉडी धुंधला बिना गुर्दे में प्रासंगिक क्षेत्रों की पहचान करने के लिए प्रशिक्षित किया जाना चाहिए । अंत में, ऊतक की गुणवत्ता का प्रभाव डाउनस्ट्रीम डेटा गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है। एलएमडी प्रोटोकॉल ऊतक क्षरण की ओर जाता है, इसलिए सामग्री शुरू करने की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल को केवल मध्यम गुणवत्ता के कई नमूनों के साथ संग्रहीत बायोप्सी पर अनुकूलित किया गया था। इसमें शामिल आंकड़ों से पता चलता है कि चयनित ट्रांसक्रिप्टोमिक प्लेटफॉर्म मजबूत है ।

ध्यान दें, इस्तेमाल किया अलगाव किट और आरएनए अनुक्रमण के डाउनस्ट्रीम पद्धति विशेष रूप से आरएनए क्षरण की अपेक्षित डिग्री के लिए सिलवाया जाना चाहिए । यहां वर्णित धुंधला प्रोटोकॉल अपनाया गया था क्योंकि इस तरह के प्रभाव को कम करने पर इसका सबसे अनुकूल प्रभाव पड़ा था। इस प्रोटोकॉल में, ऊतक को अक्टूबर में एम्बेडेड किया गया था ताकि अन्य ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रौद्योगिकियों में भविष्य की तुलना को सुविधाजनक बनाया जा सके। हालांकि, फॉर्मेलिन फिक्स्ड टिश्यू एक विकल्प हो सकता है।

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत किए गए डेटा से अनुकूलन, गुणवत्ता नियंत्रण मैट्रिक्स और प्रौद्योगिकी परिणामों सहित क्षेत्रीय ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के लाभों का पता चलता है । कठोर पूर्व विश्लेषणात्मक और विश्लेषणात्मक गुणवत्ता नियंत्रण मानदंडों की स्थापना, और किसी भी कार्यप्रणाली के लिए कठोरता और प्रजनन क्षमता के ठोस सबूतों की स्थापना भी आवश्यक है। क्षेत्रीय ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के भविष्य के अनुप्रयोगों को मोटे तौर पर जीवविज्ञान अनुप्रयोगों, तकनीकी प्रगति और विश्लेषणात्मक प्रगति में बांटा जा सकता है। भविष्य के जीवविज्ञान अनुप्रयोगों का उद्देश्य ऊतक से अघायल, घायल और पुनरुत्थान ट्यूबल, साथ ही सूजन के करीब निकटता में ट्यूबल से पूछताछ करना हो सकता है। इन डिब्बों को पारंपरिक रूपात्मक मार्कर के साथ-साथ "मार्ग" विशिष्ट मार्कर के लिए एंटीबॉडी दाग दोनों द्वारा एक ही बायोप्सी में पहचाना जा सकता है। इस तकनीक में उपयोग के लिए मान्य दो एंटीबॉडी मार्कर, मेगालिन और उर्मोम्डुलिन, क्रमशः समीपस्थ ट्यूबल और मोटी आरोही अंग में अत्यधिक व्यक्त किए जाते हैं। हालांकि, यह संभव है कि इन मार्कर गंभीर रूप से रोगग्रस्त ऊतकों में कम हो सकते हैं। इन स्थितियों में, मार्ग विशिष्ट मार्कर या उपन्यास मार्कर का अतिरिक्त एंटीबॉडी सत्यापन जो उनके अभिव्यक्ति स्तर को नहीं बदलता है, इस मुद्दे को दूर कर सकता है।

एलएमडी अन्य अंगों की ट्रांसक्रिप्टोमिक पूछताछ में उपयोग करने के लिए एक उपयुक्त तरीका होने की संभावना है। तेजी से धुंधला करने के लिए काम करने वाले एंटीबॉडी का चयन और अनुकूलन जरूरी होगा। एक एंटीबॉडी जो नियमित धुंधला प्रोटोकॉल में काम करता है, जरूरी नहीं कि तेजी से धुंधला प्रोटोकॉल के लिए काम करे, जिसके लिए उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है। एक प्राथमिक संयुग्मित एंटीबॉडी आवश्यक चरणों को कम करेगा और फायदे प्रदान कर सकता है। हालांकि, फ्लोरोफोरस के लिए एंटीबॉडी का संाधीनता बाध्यकारी को बदल सकती है, और प्रोटोकॉल में इन अभिकर्णों को शामिल करने से पहले पायलट प्रयोग किए जाने की आवश्यकता होती है।

अंत में, हम फ्लोरेसेंस आधारित लेजर माइक्रोडिसेक्शन के लिए एक पाइपलाइन का वर्णन करते हैं ताकि मानव गुर्दे में विशिष्ट क्षेत्रों और संरचनाओं को अलग किया जा सके ताकि ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण को सक्षम किया जा सके। यह दृष्टिकोण महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है और ऊतक आधारित आणविक पूछताछ प्रदान करने के लिए अन्य ऊतकों तक बढ़ाया जा सकता है। क्षेत्रीय ट्रांसक्रिप्टोमिक्स अभिव्यक्ति को समझने, जीव विज्ञान की व्याख्या और स्वास्थ्य और रोग के हस्ताक्षर में सहायता करने के लिए एक हिस्टोपैथोलोजिक एंकर प्रदान करके अन्य ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रौद्योगिकियों का पूरक है। यह तकनीक गुर्दे के एक ट्रांसक्रिप्टोस्मिक एटलस के निर्माण के लिए दृष्टि के भीतर स्वाभाविक रूप से फिट बैठती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

सामान्य: लेखक किडनी प्रिसिजन मेडिसिन प्रोजेक्ट (www.kpmp.org) के जांचकर्ताओं को उनके अनुग्रह समर्थन और सलाह के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं ।

फंडिंग: इस काम के लिए समर्थन NIH/NIDK K08DK107864 (M.T.E.) द्वारा प्रदान किया गया था; NIH/NIDDK UG3DK1114923 (T.M.E., P.C.d.); R01dK099345 (T.A.S.) । इस पांडुलिपि में रिपोर्ट किए गए शोध को पुरस्कार संख्या U2CDK114886 के तहत राष्ट्रीय मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारियों (NIDDK) किडनी प्रेसिजन मेडिसिन परियोजना (KPMP), (www.kpmp.org) द्वारा समर्थित किया गया था ।

डेटा और सामग्री की उपलब्धता: डेटा जीन अभिव्यक्ति सर्वग्राही में संग्रहीत है (जियो # लंबित)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich 270725-1L
AMPure Beads Beckman Coulter A63880
Bioanalyzer Agilent 2100
BSA VWR 0332-100G
DAPI ThermoFisher 62248
Desiccant Cartridge Bel-Art F42046-0000
DNAse Qiagen 79254 RDD buffer is included in the pakage
Laser Microdissection Microscope Leica LMD6500
Megalin/LRP2 Antibody Abcam ab76969 Directly conjugated to Alexa Fluor 568
Microcentrifuge tubes ThermoFisher AB-0350
Microscope camera Leica DFC700T
PBS (RNAse Free) VWR K812-500ML
Phalloidin (Oregon Green 488) ThermoFisher O7466
PicoPure RNA Isolation Kit Applied Biosystems KIT0204
PPS-membrane slides Leica 11505268
qPCR Human Reference Total RNA 25 µg Takara Clontech 636690
RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip Agilent 5067-1513
RNAse Away ThermoFisher 7000
RNAse Inhibitor ThermoFisher AM2696
Sequencer (HiSeq or NovaSeq) Illumina NA
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 Takara Clontech 634411
Tamm-Horsfall Protein Antibody R&D Systems AF5144 Directly conjugated to Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. Compound Sakura 4583

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