Summary
نحن وصف بروتوكول للmicrodissection الليزر من أجزاء فرعية من الكلى البشرية، بما في ذلك كبيبات الكبيب، tubule القريب، سميكة صعود الطرف، وجمع القناة والتهائل. ثم يتم عزل الجيش الملكي النيبالي عن المقصورات التي تم الحصول عليها ويتم تنفيذ تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد التغييرات في التوقيع النسخي داخل كل جزء فرعي.
Abstract
تحليل التعبير الجيني للأنسجة الكلى البشرية هو أداة هامة لفهم التوازن والأمراض في الفيزيولوجيا. زيادة دقة وعمق هذه التكنولوجيا وتوسيعها إلى مستوى الخلايا داخل الأنسجة هناك حاجة. على الرغم من أن استخدام تسلسل الحمض النووي والرنا وحيد الخلية الواحد أصبح واسع الانتشار، فإن تواقيع التعبير للخلايا التي تم الحصول عليها من تفكك الأنسجة لا تحافظ على السياق المكاني. من شأن الميكروستيكشن بالليزر (LMD) القائم على علامات فلورية محددة أن يسمح بعزل هياكل محددة ومجموعات خلايا ذات أهمية مع التعريب المعروف، مما يسمح بالحصول على توقيعات مستنسخة ذات رسوخ مكانية في أنسجة الكلى. لقد قمنا بتحسين منهجية LMD ، مسترشدة بصبغة سريعة تستند إلى الفلورانس ، لعزل خمس مقصورات متميزة داخل الكلى البشرية وإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي اللاحق من عينات أنسجة الكلى البشرية القيمة. كما نقدم معايير لمراقبة الجودة لتمكين تقييم مدى كفاية العينات التي تم جمعها. يُظهر سير العمل الموضح في هذه المخطوطة جدوى هذا النهج لعزل التوقيعات المستنسخة الجزئية الفرعية بثقة عالية. ويمكن أيضاً تطبيق النهج المنهجي المعروض هنا على أنواع الأنسجة الأخرى مع استبدال علامات الأجسام المضادة ذات الصلة.
Introduction
وقد تحسنت التطورات التكنولوجية في دراسة عينات الأنسجة فهم الحالة الصحية والمرض في مختلف الأجهزة. وقد أكدت هذه التطورات أن علم الأمراض يمكن أن تبدأ في مناطق محدودة أو في أنواع محددة من الخلايا، ولكن لها آثار هامة على الجهاز بأكمله. ولذلك ، في العصر الحالي من الطب الشخصي ، من المهم أن نفهم علم الأحياء على حد سواء الخلية والمستوى الإقليمي وليس فقط على الصعيد العالمي1. وينطبق هذا بشكل خاص على الكلى ، التي تتكون من خلايا وهياكل متخصصة مختلفة تبدأ و / أو تستجيب بشكل متمايز للإجهاد المرضي. لا يزال المرض من أنواع مختلفة من أمراض الكلى البشرية غير مفهومة جيدا. ومن ثم فإن توليد منهجية لدراسة التغيرات في التعبير الجيني في أجزاء أنبوبية محددة أو هياكل أو مناطق من التداخل في الكلى البشرية سيعزز القدرة على الكشف عن التغيرات المحددة في المنطقة التي يمكن أن تُعلم عن التسبب في المرض.
عينات خزعة الكلى البشرية هي مورد محدود وثمين. لذلك، ينبغي تحسين التقنيات استجواب transcriptomics في أنسجة الكلى إلى الاقتصاد في الأنسجة. وتشمل الطرق المتاحة لدراسة النسخ على مستوى الخلية والمستوى الإقليمي تسلسل RNA خلية واحدة (scRNaseq)، RNaseq النووية واحدة (snRNaseq)، في التهجين المكاني في الموقع، والصغرى الليزر (LMD). وهذا الأخير مناسب تماماً لعزل المناطق أو الهياكل ذات الاهتمام الدقيق داخل أقسام الأنسجة، لتسلسل الحمض النووي الريبي في المصبوتحليله 2و3و4و5. يمكن اعتماد LMD للاعتماد على تحديد أنواع أو هياكل محددة من الخلايا استنادًا إلى علامات معتمدة باستخدام التصوير القائم على الفلور أثناء التشريح.
وتشمل السمات الفريدة لتقنيات النسخ المجهرية بالليزر التي تساعد على ذلك: 1) الحفاظ على السياق المكاني للخلايا والهياكل، الذي يكمل تكنولوجيات الخلايا المفردة التي يتم فيها تحديد الخلايا بالتعبير وليس بالسنولوجيا؛ (2) الحفاظ على السياق المكاني للخلايا والهياكل؛ (2) الحفاظ على البيئة الجغرافية؛ (2) استخدام تكنولوجيات الخلايا المفردة؛ (2) الحفاظ على البيئة الجغرافية للخلايا والهياكل؛ (2) الحفاظ على الخلايا والهياكل؛ (2) الحفاظ على البيئة المكانية للخلايا والهياكل؛ (2) استخدام تكنولوجيات الخلايا الصغيرة التي يتم تحديدها باستخدامها في الهياكل المحددة؛ (2) الحفاظ على استخدام الخلايا الصغيرة في المناطق التي يتم فيها استخدام الخلايا الصغيرة في المناطق التي يتم فيها تحديدها باستخدامها في 2) التكنولوجيا بإعلام ويتم إبلاغها من قبل تقنيات التصوير الأخرى لأن علامة الأجسام المضادة يحدد توقيعات التعبير؛ 3) القدرة على تحديد الهياكل حتى عندما علامات تغيير في المرض؛ 4) الكشف عن المحاضر أعرب عن انخفاض في ما يقرب من 20،000 الجينات؛ و 5) اقتصاد الأنسجة ملحوظا. التكنولوجيا قابلة للتطوير إلى خزعة الكلى مع أقل من 100 μm سمك من نواة ضرورية للحصول على ما يكفي من RNA وتمكن من استخدام الأنسجة المجمدة المؤرشفة ، والتي تتوفر عادة في مستودعات كبيرة أو المراكز الأكاديمية6.
في العمل الذي أعقب ذلك، ونحن وصف التكنولوجيا النسخ الإقليمية والجملة بالتفصيل، الأمثل مع بروتوكول تلطيخ الفلوريسينس السريعة رواية للاستخدام مع أنسجة الكلى البشرية. هذا النهج يحسن على استكشافات LMD الكلاسيكية لأنه يوفر بيانات التعبير منفصلة للفصيلات الفرعية والنيفرون بدلا من التعبير توبولونترسالية الكلي. وتشمل هذه التدابير تدابير ضمان الجودة والرقابة التي تم تنفيذها لضمان الصرامة وقابلية التكرار. ويتيح البروتوكول تصور الخلايا والمناطق ذات الأهمية، مما يؤدي إلى الحصول على RNA بشكل مرض من هذه المناطق المعزولة للسماح بتسلسل الحمض النووي الريبي في المصب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الدراسة لاستخدامها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) في جامعة إنديانا.
ملاحظة: استخدم هذا البروتوكول مع أنسجة استئصال الكلى (حتى 2 سم في كل من أبعاد X و Y) المحفوظة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) وتخزينها عند -80 درجة مئوية. أداء جميع الأعمال بطريقة تحد من التلوث RNA، واستخدام قفازات نظيفة يمكن التخلص منها وقناع الوجه. ضمان نظافة جميع الأسطح. المعدات التي تم تحسين هذا البروتوكول هو نظام microdissection الليزر تتميز ليزر الأشعة فوق البنفسجية نبض.
1. القاء الكرياء
- 1.2 μm LMD PPS-غشاء (بولي (p-p-phenylene كبريتيد) الشرائح للأشعة فوق البنفسجية (في نسيج غطاء تدفق لارينار لثقافة) لمدة 30 دقيقة، مباشرة قبل cryosectioning. تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة للانضمام الأمثل للأنسجة.
- تبريد التبريد إلى -20 درجة مئوية. تنظيف أسطح العمل وتثبيت شفرة قطع جديدة.
- ضع مربع شريحة صغيرة (تنظيفها مع RNase حل إزالة التلوث السطح) داخل غرفة التبريد لتخزين الشرائح مع الأنسجة قطع حديثا.
- الانضمام إلى العينة في أكتوبر إلى حامل الأنسجة والسماح لها لتكليل لبضع دقائق للوصول إلى درجة حرارة الغرفة وتعزيز التصاق بين كتلة أكتوبر وحامل. المساعدة في العملية باستخدام مستخرج حراري.
- قطع العينة إلى سمك 12 ميكرومتر ولصقها على الشريحة LMD المتخصصة، وذلك باستخدام محول الشريحة. تحتوي كل شريحة على قسم واحد لاستئصال الكلية لكل شريحة أو ما يصل إلى قسمين من خزعة الكلى لكل شريحة. قم بتخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية بخراطيشة مجففة وداخل كيس بلاستيكي مغلق بإحكام لمنع تراكم الرطوبة الزائدة داخل مربع الشريحة.
- تسمية كل شريحة مع معرف عينة وتاريخ ورقم الشريحة.
- استخدم الشرائح مع العينات في غضون 10 أيام من التاريخ الأولي لتكرير الكرياض.
2. الليزر microdissection
- مباشرة قبل تلطيخ، وإعداد مزيج الأجسام المضادة (Ab-ميكس) في 10٪ BSA في برنامج تلفزيوني RNase خالية من خلال إضافة ما يلي: 4 ميكرولتر من FITC-Phalloidin، 1.5 ميكرولتر من DAPI، 2 ميكرولتر من تام-هورسفال بروتين (THP) الأجسام المضادة مترافقة مباشرة إلى اليكسا فلور 546، 3.3 ميكرولتر من مثبط RNase، و 89.2 ميكرولتر من 10٪ BSA في برنامج تلفزيوني (للوصول إلى حجم 100 ميكرولتر).
ملاحظة: يمكن استخدام الأجسام المضادة البديلة بدلاً من الأجسام المضادة THP. على سبيل المثال، يمكن استخدام 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة ميغالين/LRP2، مترافق مباشرة مع فلور اليكسا 568، لتسمية الأنابيب القريبة. يحتوي Ab-Mix على جسم مضاد LRP2 أو THP (لتصور إما أنابيب قريبة أو أطراف صاعدة سميكة، على التوالي). قد يتم التحقق من صحة الأجسام المضادة الأخرى وفقا لاحتياجات المستخدم. - غسل الشريحة في الجليد البارد (-20 درجة مئوية) 100٪ الأسيتون لمدة 1 دقيقة ونقله إلى غرفة الرطوبة.
- غسل الجزء العلوي من الشريحة مع برنامج تلفزيوني RNase خالية لمدة 30 s. كرر.
- غسل الجزء العلوي من الشريحة مع 10٪ BSA في برنامج تلفزيوني RNase خالية لمدة 30 s. كرر.
- تطبيق Ab-Mix لمدة 5 دقائق.
- غسل الجزء العلوي من الشريحة مع 10٪ BSA في برنامج تلفزيوني RNase خالية لمدة 30 s. كرر.
- الهواء الجافة الشريحة لمدة 5 دقائق وتحميله على منصة قطع microdissection الليزر.
- تثبيت أنابيب جمع (autoclaved 0.5 مل أنابيب microcentrifuge) مناسبة لعمل PCR، التي تحتوي على 50 ميكرولتر من مخزن الاستخراج من طقم العزلة RNA.
- المضي قدما مع LMD. أكمل كل جلسة LMD في غضون ساعتين على الأكثر.
- جمع الصور قبل وما بعد LMD immunofluorescence، وذلك باستخدام كاميرا المجهر للتحقق من صحة تشريح للتباين بين المشغلين، فضلا عن أغراض المحفوظات والتدريب وتقييم الجودة للبروتوكول المنجز. من أجل الحصول على 0.5 - 1 نانوغرام من الجيش الملكي النيبالي، مطلوب ما لا يقل عن 500،000 μm2 المساحة. وهذا يتطلب في كثير من الأحيان استخدام ما يصل إلى 8 μm 8 أجزاء سميكة μm للحصول على كمية كافية من المواد لجميع القطاعات الفرعية من الفائدة.
- تحديد المناطق ذات الأهمية عن طريق تلطيخ، مورفولوجيا وموقع ومكوس لهم باستخدام قوة الليزر أكبر من 40.
ملاحظة: هنا معايير تشريح. يتم تعريف الأنبوبة القريبة بواسطة FITC-Phalloidin و LRP2 التسمية. يتم تعريف الطرف الصاعد سميكة من قبل THP وضع العلامات. يتم تعريف قناة التجميع بواسطة مورفولوجيا النووية (DAPI) وعدم وجود تلطيخ آخر. يتم تعريف الكبيبات من قبل FITC-Phalloidin ومورفولوجيا. ويعرف الخلية على أنها المنطقة بين الأنابيب الملون.
- الحصول على توقيع تعبير مقطعي مقطعي مجمع عن طريق لصق قسمين 12 ميكرومتر على شريحة LMD وتشريح المقاطع بأكملها في مخزن الاستخراج المؤقت.
- عند الانتهاء من عملية LMD، قم بإغلاق أنابيب microcentcentuge جمع ونفض الغبار بقوة لضمان أن المحتوى انتقل من الغطاء إلى أسفل الأنبوب
- أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 3000 س ز لمدة 30 s.
- احتضان الأنابيب في 42 درجة مئوية حمام مائي لمدة 30 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 3000 س ز لمدة 2 دقيقة.
- نقل عظمى إلى أنبوب 0.5 مل جديدة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
3. RNA العزل
ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول عزل RNA، قمنا بتكييف بروتوكول من مجموعة العزل RNA التجارية. تم تعديل بروتوكول الشركة المصنعة لتلبية متطلبات مراقبة الجودة التي تم تعيينها للمشروع.
- أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت المشروط (CB) لكل عمود تنقية RNA (PC) وحضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- أجهزة الطرد المركزي جميع أجهزة الكمبيوتر لمدة 1 دقيقة في 16،000 س ز.
- إضافة 50 ميكرولتر من 70٪ الإيثانول (المقدمة في عدة) في الأنابيب مع عينات الأنسجة. مزيج العينات جيدا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا. لا دوامة. لا الطرد المركزي.
- نقل الخليط إلى أجهزة الكمبيوتر مكيفة والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 100 × ز (لربط RNA)، اتبع بسرعة مع الطرد المركزي لمدة 30 s في 16،000 س ز (لإزالة تدفق من خلال). كرر هذه الخطوة إذا كان أكثر من 1 أنبوب مع عينات الأنسجة المتاحة لأي شريحة فرعية معينة.
- إضافة 100 μL من الغسيل العازل 1 (WB1) في أجهزة الكمبيوتر وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 8000 س ز.
- إعداد 40 ميكرولتر من DNase لكل عينة (أضف 5 ميكرولتر من DNase إلى 35 ميكرولتر من العازلة RDD). ثم إضافة 40 μL من الخليط مباشرة على غشاء الكمبيوتر واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 40 ميكرولتر من WB1 على غشاء PC، والطرد المركزي لمدة 15 s في 8000 x ز.
- إضافة 100 μL من غسل العازلة 2 (WB2) على غشاء PC، والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 8،000 س ز.
- إضافة 100 μL من WB2 على غشاء PC، والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 16،000 س ز،تليها مباشرة من قبل الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 16،000 س ز.
- نقل الكمبيوتر إلى أنبوب جديد 0.5 مل.
- أضف 12 ميكرولتر من عازلة Elution (EB) على الغشاء واحتضان لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وبالتالي، فإن الحجم النهائي لجميع العينات التشريحية تجمع الأنسجة هو 12 ميكرولتر لكل جزء فرعي.
- الطرد المركزي العينات لمدة 1 دقيقة في 1000 س ز ثم لمدة 2 دقيقة في 16000 س ز.
- نقل 2 ميكرولتر إلى أنبوب جديد لتحليل Bioanalyzer (لمنع تجميد ذوبان).
- تخزين جميع الأنابيب في -80 درجة مئوية حتى جاهزة لمزيد من المعالجة.
4. تسلسل الجيش الملكي النيبالي
- تقييم كل عينة، مخصصة لتسلسل، للجودة باستخدام Bioanalyzer التجارية ورقاقة مخصصة لقياس كميات صغيرة من الحمض النووي الريبي.
- المعلمات التالية لمراقبة الجودة (QC) قبل الإعدادية للمكتبة وتسلسل مطلوبة: كمية من RNA أكبر من 4 نانوغرام لكميات كبيرة وأكبر من 0.5 - 1 نانوغرام لكل جزء فرعي; في المئة من النصوص أطول من 200 النيوكليوتيدات (DV200) مطلوب أن تكون أكبر من 25٪ لعينات LMD (الأمثل > 75٪).
- تنفيذ الإعدادية مكتبة مع إعداد مكتبة cDNA التجارية طقم إعداد مكتبة مخصصة لكميات صغيرة من الحمض النووي الريبي المتدهورة. بالنسبة للمجموعة التجارية المذكورة في الملحق ، نقترح استخدام الخيار 2 ، الذي يتطلب الحد الأدنى من DV200 من 25 ٪ وعدم التجزئة. قد تتطلب بعض تقنيات التسلسل عتبات DV200 الحد الأدنى الأعلى ، مثل 30٪7.
- إضافة محولات وفهارس cDNA.
- تنقية المكتبات RNAseq باستخدام تكنولوجيا الخرز المغناطيسي.
- نضوب الريبوسومال cDNA باستخدام مجموعة إزالة rRNA التجارية قبل RNAseq مكتبة خطوة التضخيم.
- تنقية مكتبة RNAseq النهائي باستخدام تكنولوجيا حبة المغناطيسي في تركيز مكتبة cDNA 2 نانوغرام /ميكرولتر.
- تنفيذ تسلسل الحمض النووي الريبي من 75 نقطة بريتيش بتروليوم يقترن نهاية على نظام تسلسل التجارية مع 30 مليون يقرأ / عينة للجملة و 100 مليون يقرأ / عينة لأقسام فرعية.
- استخدم RNA المرجعي (25 ميكروغرام) مع كل تشغيل تسلسل للسماح بالسيطرة على تأثير الدفعة. التركيز الأولي للرنا المرجعي لدينا هو 1 ميكروغرام/ميكرولتر، في حين أن التركيز النهائي المستخدم في التسلسل هو 25 نانوغرام/ميكرولتر. تشغيل الحمض النووي الريبي المرجعي كعينة منفصلة أثناء إعداد المكتبة وتشغيلها مع جميع عينات LMD في كل مرة.
- إجراء تحليل البيانات باستخدام تطبيق FastQC لتقييم جودة تسلسل، intergenic و القراءة الميتوكوندريا وتحديد قراءات المنسوبة إلى الجينات.
- استخدام المتكاملة الجينوم عارض (IGV) للمحاذاة وحافة / rbamtools لمقاييس التعبير عن النص.
- إزالة العينات مع أقل من 100،000 يقرأ. Quantile تطبيع يقرأ الخام في مجموعة البيانات بعد تصفية الجينات أعرب عن انخفاض في عتبة محددة من قبل المستخدم.
- كمّي التعبير كنسبة من الجزء الفرعي من الفائدة إلى متوسط جميع الأجزاء الفرعية الأخرى و log2-transform. ويمكن مقارنة التعبير النسبي لنفس الجين عبر الأجزاء الفرعية والعينات؛ ومع ذلك، فإنه ليس من المثالي لمقارنة التعبير النسبي بين اثنين من الجينات المختلفة بسبب الاختلافات المحتملة في التدهور عبر الجينات وأنواع الحمض النووي الريبي.
- إجراء تحليل للإثراء لمقارنة التعبير الجيني لمجموعة من صانعي محددة لكل شريحة فرعية من النيفرون، في حين تتم مقارنة عينات RNA المرجعية عبر دفعات. يعتبر تأثير الدُفعة ضمن انحراف معياري 1 للتعبير المتوسط مع قيمة R > 0.9 مقبولاً. مطلوب التطبيع إضافية للحصول على درجة تأثير دفعة أعلى. يمكن وضع علامة على أي تشغيل ينحرف عن تأثير الدفعة المقبول. يجب أن يكون Q30 أكبر من > 90٪ لكل تشغيل تسلسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عينات
نقدم بيانات من تسعة زرع الكلية المرجعية (3 عينات تم الحصول عليها في جامعة إنديانا و 6 عينات تم الحصول عليها من خلال مشروع طب دقة الكلى)، وذلك باستخدام بروتوكول تلطيخ الفلوريسين السريع لعزل أجزاء الكلى والمناطق الخلالية. تم الحصول على الأقسام المستخدمة في هذه العملية من المتبرعين بالكلى المتوفين أو استئصال الكلية الورم غير المصاب. لم يكن لدى هذه العينات أدلة مرضية للمرض كما هو متصور في وصمة H & E المأخوذة من الأقسام المتجاورة (الشكل 1A).
مراقبة جودة الليزر الدقيقة
يتم إنجاز تحديد الأجزاء الفرعية الأنبوبية في الكلى من خلال تلطيخ الأجسام المضادة لعلامات أنبوبية فريدة من نوعها ، وكذلك المورفولوجيا والمعالم الهيكلية. يوضح الشكل 1B-C تلطيخ الأجزاء الفرعية الأنبوبية والميكروفين من استئصال الكلية التمثيلي. ويتم ذلك عن طريق تلطيخ مع DAPI (النوى)، FITC-Phalloidin (F-actin)، والأجسام المضادة إضافية حسب الضرورة. جعل تلطيخ الفلوريسنس المستخدمة من الممكن تصور الأجزاء الفرعية الكلوية بدرجة عالية من الثقة ، مسترشدة أيضًا بملامح مورفولوجية بالإضافة إلى تحديد المواقع المكانية للهياكل المصورة (الشكل 2). على سبيل المثال، يتم الكشف عن الكبيبات من قبل phalloidin وDAPI تلطيخ مع مورفولوجيا مميزة جدا. وبالمثل، يتم تصور جمع القنوات باستخدام مورفولوجيا نووية وعدم وجود بقع أخرى. يتم استخدام الأجسام المضادة ميغالين/LRP2 (مترافق مباشرة مع فلور اليكسا 568) هنا لتحديد الأنابيب القريبة. يتم تصور الطرف الصاعد السميك باستخدام جسم مضاد بروتين تام هورسفال (THP) (مترافق مباشرة مع أليكسا فلور 546). في المقابل ، يتم استئصال التاتالي على طول الغشاء الخارجي من الأنابيب ويشمل الخلايا القوية والمناعة وكذلك الشعيرات الدموية الصغيرة.
للحصول على RNA كافية من 0.5 – 1 نانوغرام لكل جزء فرعي، ونحن نسعى لتشريح مساحة 500،000 μm2كحد أدنى . ويتطلب هذا عموماً خمسة إلى ثمانية أقسام سميكة 12 ميكرومتر (مقطع لكل شريحة) للحصول على مواد كافية لجميع الشرائح الفرعية. يتم الانتهاء من تشريح أي شريحة في أقل من 2 ساعة للحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي الذي يسمح لأحد لخفض شرائح ~ 4 في الشريحة الواحدة. يتم تجميع الأنسجة المكتسبة من نفس الجزء الفرعي من شرائح متعددة لتسلسل المصب. يتم الحصول على صورة قبل وما بعد LMD immunofluorescence للتحقق من صحة مجموعة من شرائح فرعية من الفائدة باستخدام كاميرا المرفقة. يحدد الشكل 3 معدلات نجاح منطقة التشريح والحد الأدنى من مدخلات الحمض النووي الريبي. كان معدل نجاح تلبية الحد الأدنى لمدخلات المنطقة >90٪ في مجموعة البيانات التمثيلية هذه. إذا كان النسيج المصدر لديه كمية صغيرة من CD أو الخلية, هناك احتمال أن منطقة تشريح سيكون أقل من 500,000 μm2 لهذه الشرائح بعد استخدام 8 الشرائح. ويمكن قطع شرائح إضافية تبعا لاحتياجات المستخدم؛ ومع ذلك، كما رأينا في الشكل 3، إذا كانت المنطقة قريبة من 500،000 μm2، فإن عدد الجينات المطلوبة المكتشفة لديه نسبة نجاح عالية (100٪) وبلغ معدل نجاح عدد القراءة الإجمالي 98.6٪ (1 عينة أقل من مقياس QC). وهكذا، كان هناك ما يكفي من الأنسجة لتحقيق ما يكفي من الجينات وقراءة التهم دون استخدام الأنسجة الإضافية.
تسلسل التحكم في جودة الإدخال
وتتيح منصة إعداد وتسلسل المكتبة التجارية المختارة قياسات قابلة للاستنساخ للتعبير عن النسخ، حتى مع كميات منخفضة من الحمض النووي الريبي المتدهور للغاية. الحد الأدنى لمدخلات الحمض النووي الريبي هو 500 pg والحد الأدنى لـ DV200 (نسبة القراءة التي تزيد عن 200 نويدات في الطول) فوق 25٪." لا يوجد حد أدنى لـ RIN. التسلسل مع 100 مليون يقرأ لكل عينة، ونحن نسعى لتشبع القراءات المتاحة من أجل الكشف عن النصوص أعرب عن انخفاض. يمكن تعديل إجمالي القراءات وفقًا لاحتياجات المستخدم.
ومن السهل الحصول على ما يكفي من RNA من قسمين مقطعي مقطعي 12 ميكرومتر، لذلك نسعى للحصول على كمية دنيا أعلى من الرنا 4 نانوغرام لتسلسل الكميات الكبيرة. وكما هو محدد في البروتوكول، فإن كل جزء فرعي يتطلب 0.5-1 نانوغرام في مجموع الحمض النووي الريبي. التركيز الأمثل للرنا فوق 50 pg/μL بعد العزل. كميات الحمض النووي الريبي أقل من هذا قد يؤدي إلى انخفاض الكشف عن الجينات وعدد القراءة لوحظ. معظم العينات العائد > 20،000 الجينات المكتشفة و> 1 مليون يقرأ. وهناك حاجة إلى DV200 أكبر من 25٪ لجميع العينات من قبل الشركة المصنعة (> 75٪ يعتبر الأمثل). على الرغم من أن يتم قياس RIN، فإن عملية الميكروسكشن بالليزر تقلل من RIN وقد تم تحسين منصات تسلسل الحمض النووي الريبي للرنا المجزأ. يتم تقييم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي بواسطة محلل حيوي قبل التسلسل. البقعة السريعة يقلل من مقدار الوقت الذي يتعرض النسيج لدرجة حرارة الغرفة والظروف مائي، وبالتالي تقليل إلى أقصى حد ممكن، وتدهور الجيش الملكي النيبالي. تم العثور على DV200 قياس مراقبة الجودة لتسلسل المدخلات في الشكل 3.
تسلسل مراقبة جودة المخرجات
معالجة البيانات المصبّة تستخدم التطبيع الكمي للسماح بالمقارنة بين العينات في دفعات مختلفة. ويستخدم الحد الأدنى لعدد الكشف عن الجينات البالغ 000 10 وعدد قراءة أدنى قدره مليون شخص كعتبات لإدراج عينات في تطبيع كمية الكمية. وتستبعد العينات التي لديها اكتشاف جينات أقل أو عدد القراءة من تطبيع كمية العينات والتحليلات المقارنة اللاحقة. فقط 1 من أصل 98 عينة تشريحية دون قطاع فشل في تلبية هذه العتبات (الشكل 3). Q30 (نسبة من يقرأ معين في ثقة 99.9٪) كان أكبر من 93٪ لكل تجربة تسلسل(الشكل 4).
نحن تسلسل RNA مرجع الإنسان (25 نانوغرام) مع كل تشغيل تسلسل للسماح لتصحيح تأثير دفعة إذا كان هذا التصحيح هو المطلوب أو المطلوبة. يجب أن يكون تأثير الدُفعة المقاسة ضمن انحراف معياري 1 للتعبير المتوسط مع قيمة R > 0.9. إذا كان تأثير الدُفعة أعلى، يلزم تطبيع إضافي لتشغيل التسلسل هذا. هنا، كان تأثير الدفعة أقل من 3٪ في تجارب التسلسل الأربعة المصورة في الشكل 4. وبالتالي ، يتم تناول تأثير الدفعة عادة مع التطبيع الكمي لجميع أشواط التسلسل ، لا أدرية لرنا المرجعية. لم يتم بعد تنفيذ أي تصحيح يستند إلى المرجع RNA، ولكن هذه المعلومات متاحة ويمكن استخدامها حسب أهداف تحليل معين.
الصرامة وقابلية الاستنساخ
من المهم إثبات الصرامة في تحديد أنواع الخلايا وهياكلها. بعد microdissection الليزر، ونحن اختبار لإثراء علامات معروفة في glomeruli، PT، TAL، CD، والربط بينية بالمقارنة مع المقصورات الأخرى (الجدول 1). ويُستخدم تحليل الإثراء لمقارنة التعبير الجيني للعلامات المتوقعة المحددة مسبقاً. يتم نقل التعبير الجيني كنسب سجل2 للتعبير عن الجزء الفرعي من الفائدة مقارنة مع متوسط الأجزاء الفرعية الأخرى. وقد تم اختيار هذا التعبير متري للعينات البشرية لأنه يقلل من التباين بين الفردية، مما يسهل المقارنات بين أنواع الخلايا والمقصورة عبر العينات. ومع ذلك، يمكن أيضاً مقارنة القراءة الأولية و عمليات القراءة التي تم تطبيعها كمي في التحليلات البديلة. يوضح الشكل5 أمثلة على تلطيخ مناعة الوهيستوميكية لهذه العلامات الخمسة المعروفة المختارة، كما هو معروض في أطلس البروتين البشري.
وهكذا، نقدم مصادر البيانات المتعامدة التي تعطي الثقة إلى الجزء الفرعي الصحيح الذي يتم جمعه: 1) التصوير الذي يشمل وصمة جسم مضاد ومورفولوجيا الجزء/المقصورة، و2) يتم التعبير عن إخراج التعبير الذي يظهر العلامات المعروفة في الجزء الفرعي المقابل.
ويتيح التحليل المستنسخ الإقليمي للجينات المعبر عنه في كل جزء فرعي تحديد العلامة الجديدة وغير مقدرة حق قدرها. ويوضح الشكل 6 مثالاً على علامة واحدة لكل جزء فرعي تم تحديدها من خلال LMD الإقليمية التي أسفرت أيضاً عن تلطيخ مناعي محدد للجزء الفرعي المقابل من النيفرون.
لإثبات قابلية التكاثر وفهم تأثير تقلب المشغل ، أجرينا تجربة على عينة استئصال الكلية للورم. وكان هذا النموذج glomeruli، PT، و TAL إعادة تشريح لزيادة الثقة في نتائج تسلسل الجيش الملكي النيبالي، والآن بمثابة تكرار التقنية مفيدة. أشهر وبصرف النظر، وخضعت هذه العينة مثيل ثان من cryosectioning، تلطيخ الأجسام المضادة، تشريح LMD، استخراج الجيش الملكي النيبالي، الإعدادية مكتبة، وتسلسل الحمض النووي الريبي(الشكل 7)من مقصورات كبيبات، PT و TAL. تمت مقارنة النسختين (v1 و v2). كانت مقصورات الكبيّة وPT و TAL مرتبطة جدًا بقيم r2 > 0.95 ، على غرار تأثير الدفعة الأدنى لـ RNA المرجعي.
الشكل 1: صور تمثيلية للأنسجة الكلوية.
(A) H & E وصمة عار من أنسجة الكلى مرجع الإنسان. (B) صورة مناعية من أنسجة الكلى المرجعية البشرية مع شرائح الأطراف الصاعدة سميكة ملطخة قبل LMD و (C) مباشرة بعد تشريح واحد سميكة هيكل الأطراف الصاعدة. شريط مقياس = 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور تمثيلية للأجزاء الفرعية المرجعية من الكلى، تصور في 20x باستخدام نهج تلوين مناعي محدد.
(A(a Glomerulus, (B) ابوتولية بروكسي, (C) سميكة تصاعدي الطرف, (D) جمع القناة, (ه) Interstitium. (*= p < 0.05، **= p < 0.01، ***= p < 0.001 بواسطة ANOVA). شريط مقياس = 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقاييس مراقبة الجودة في نسخ البيانات المقطعية.
(أ)أكثر من 90٪ من العينات التجريبية تلبية عتبة إدخال منطقة تشريح من 500،000 μm2. (ب) جميع العينات باستثناء واحد التقى إدخال RNA المطلوبة من 500 pg على الأقل . (C) 100 ٪ من العينات التجريبية التقى الحد الأدنى للعتبة DV200 الشركة المصنعة من 25 ٪ و (D) 100 ٪ من العينات التي تلبي الحد الأدنى لدينا عتبة 10000 الجينات الكشف عنها. (E) وصلت جميع العينات باستثناء واحد إلى حد أدنى إجمالي عدد القراءة 1 مليون. كما هو متوقع، ترتبط مناطق التشريح السفلية بتركيزات الحمض النووي الريبي المنخفضة، وعدد الجينات الأقل، وعدد القراءة الأقل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تسلسل مراقبة الجودة.
(أ) تسلسل يدير توظيف RNA مرجع (لا quantile تطبيع) تتم مقارنة للتعبير يعني من جميع أشواط. هناك ارتباط قوي مع تأثير دفعة الحد الأدنى (كل R > 0.969). (B) أكثر من 93٪ من قراءاتنا في جميع عمليات التشغيل تم تعيينها بثقة عالية (Q30 أو 99.9٪). لاحظ أنه يتم توفير قيم Q30 على أساس كل حارة مع مسارات متعددة لكل تشغيل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: أمثلة على التلطيخ المناعي الكيميائي لتحديد العلامات المختارة المعروفة.
صور مصورة لـ (A) NPHS1 (B) LRP2 (C) UMOD (D) SLC4A9 (E) COL6A2. يتم الحصول على صور الكيمياء المناعية من أطلس البروتين البشري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: أمثلة على التلطيخ المناعي الكيميائي لتوضيح التعبير عن جينات العلامات غير التقليدية في الأجزاء الفرعية ذات الصلة.
تتضمن النصوص المصورة مع الكيمياء المناعية المقابلة (A) SHANK3 في كبيبات، (B) ACSM2B في الأنابيب القريبة، (C) RAP1GAP في الطرف الصاعد السميك، و (D) L1CAM في قناة التجميع. يتم الحصول على صور الكيمياء المناعية من أطلس البروتين البشري. (*= p < 0.0001 بواسطة ANOVA) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: العلاقة بين تشريحين متميزين مع تسلسل منفصل لنفس العينة.
لوحظت درجة عالية من الارتباط بين التشريحات المختلفة في (A) كبيبات ، (B) tubule القريب ، و (C) حلقة تصاعدي سميكة من Henle. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| علامه | الجزء | تغيير طي | p-قيمة |
| NPHS1 | Glomerulus | 32.64 | 1.97E-08 |
| LRP2 | أنبوب قريب | 4.69 | 1.21E-05 |
| UMOD | سميكة تصاعدي الطرف | 24.92 | 2.00E-07 |
| SLC4A9 | جمع القناة | 4.09 | 0.000133 |
| COL6A2 | الخلالي | 7.19 | 1.47E-06 |
الجدول 1: متوسط القيم التمثيلية لكل شريحة فرعية من قطاعات الاهتمام بين ثلاث عينات من استئصال الكلية، مقارنة بالشرائح الفرعية المتبقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LMD المستندة إلى transcriptomics هي تقنية مفيدة التي ترسي التعبير الجيني لمناطق محددة داخل الأنسجة. وقد وصفت أساس هذه التكنولوجيا وتطبيقها المحتملة في الكلى سابقا8. ومع ذلك ، فإن التحسين والتحديث وتبسيط التشريح القائم على الفلور الذي يهدف على وجه التحديد إلى تشريح الدقة العالية لتسلسل الحمض النووي الريبي في المصب أقل في كل مكان. ولأن هذه المنهجية مُسَكَّمة مكانياً داخل النسيج، فإنَّ لديها القدرة على كشف علامات جديدة أو غير مقدرة في هياكل الأنسجة، لا سيما في حالات المرض. في الواقع، قد تتغير العديد من العلامات الشائعة للخلايا مع المرض، وبالتالي الاعتماد فقط على علامات التعبير RNA الخلية للفصل في الهوية دون السياق المكاني قد يكون تحديا في حالات المرض. ولذلك، فإن نهج LMD المرتكزة مكانيا من المرجح أن تكمل وتوفر منصة الحقيقة الأرضية للعديد من التكنولوجيات النسخية الأخرى مثل خلية واحدة وتسلسل الحمض النووي الريبي واحد، والتي تحدد الخلايا من قبل في الغالب من قبل ملفها التعبير الجيني9. وعلاوة على ذلك، فإن عمق التعبير الجيني الذي توفره LMD (ما يصل إلى 000 20 جين لكل عينة) يوفر ميزة أخرى ومكاناً هاماً لربط البيانات من مصادر متعددة وحساب التغيرات في التعبير الجيني التي قد لا تكون ظاهرة دون عمق معين. ويعتبر الاقتصاد في الأنسجة سمة إيجابية أخرى لهذه التكنولوجيا، حيث يمكن أن يكون سمك أقل من 100 ميكرومتر من كتلة مجمدة كافيا لمجموعة بيانات LMD بأكملها. وهذا يسمح بقايا الأنسجة لاستخدامها لأغراض تحليلية أخرى.
LMD لديها قيود. أحد القيود المتوقعة من الليزر microdissection النسخ النسخ هو طبيعته أقل إنتاجية. قد يكون من المهم الأتمتة المستقبلية في تحسين قابلية التوسع10،11. وهناك قيدان إضافيان لـ LMD تتضمن الاعتماد على الخبرة وتأثير جودة الأنسجة على نتائج البيانات. جمع غير مقصود من الخلايا والمواد خارج قطعة من الفائدة هو قيد معروف لأنه يتم جمع أجزاء المخصب من الخلايا، وليس خلية واحدة. يعتمد LMD على كفاءة المستخدم في فهم بنية الأنسجة وبالتالي يتطلب خبرة مجال معين. وبالتالي، يجب تدريب الأفراد على تحديد المناطق ذات الصلة في الكلى مع وبدون تلطيخ الأجسام المضادة. وأخيراً، قد يؤثر تأثير جودة الأنسجة على جودة البيانات في المراحل النهائية. بروتوكول LMD يؤدي إلى تدهور الأنسجة، وبالتالي فإن نوعية المواد الأولية مهمة. ومع ذلك، تم تحسين هذا البروتوكول على خزعات اُرُوِّت مع عدة عينات ذات جودة معتدلة فقط. وتبين البيانات الواردة أن المنصة المحددة للنسخة المحددة قوية.
وتجدر الإشارة إلى أن مجموعة العزل المستخدمة ومنهجية المراحل النهائية لتسلسل الحمض النووي الريبي يجب أن تُصمَّم خصيصاً للدرجة المتوقعة من تدهور الحمض النووي الريبي. تم اعتماد بروتوكول تلطيخ الموصوف هنا لأنه كان له التأثير الأكثر ملاءمة على تقليل هذا التأثير. في هذا البروتوكول، تم تضمين الأنسجة في أكتوبر من أجل تسهيل المقارنات المستقبلية عبر تقنيات النسخ الأخرى. ومع ذلك، قد تكون الأنسجة ثابتة formalin بديلا.
تكشف البيانات المعروضة في هذه المخطوطة عن فوائد تقنيات النسخ الإقليمية، بما في ذلك التحسين ومقاييس مراقبة الجودة والنتائج التكنولوجية. ومن الضروري لأي منهجية وضع معايير صارمة لمراقبة الجودة قبل التحليل والتحليل، وكذلك وضع أدلة قوية على الصرامة وقابلية التكرار. يمكن تجميع التطبيقات المستقبلية لتقنيات النسخ الإقليمية بشكل عام في تطبيقات بيولوجية ، وتقدم تقني ، وتقدم تحليلي. قد تكون التطبيقات البيولوجية المستقبلية تهدف إلى استجواب الأنسجة من غير المصابين والجرحى، وتجديد الأنابيب، وكذلك الأنابيب في القرب من الالتهاب. ويمكن تحديد هذه المقصورات في نفس الخزعة على حد سواء من قبل علامات المورفولوجية التقليدية وكذلك البقع المضادة لعلامات محددة "المسار". يتم التعبير عن علامات الأجسام المضادة اثنين التحقق من صحة لاستخدامها في هذه التكنولوجيا، ميجالين والأوردومولين، في الأنابيب القريبة والاطراف الصاعدة سميكة على التوالي. ومع ذلك، فمن الممكن أن هذه العلامات قد تكون انخفضت في الأنسجة المصابة بمرض شديد. في هذه الحالات، قد التحقق من صحة الأجسام المضادة إضافية من علامات المسار محددة أو علامات الرواية التي لا تغير مستوى التعبير الخاصة بهم التغلب على هذه المشكلة.
ومن المرجح أن يكون LMD طريقة مناسبة لاستخدامها في الاستجواب النسخي للأجهزة الأخرى. اختيار الأمثل من الأجسام المضادة التي تعمل من أجل تلطيخ سريع سيكون أمرا حتميا. قد لا يعمل الجسم المضاد الذي يعمل في بروتوكول تلطيخ منتظم بالضرورة لبروتوكول التلطيخ السريع ، والذي من المرجح أن يتطلب أجسامًا مضادة عالية التقارب. وسوف الأجسام المضادة مترافق الابتدائية تقليل الخطوات اللازمة، وقد تقدم مزايا. ومع ذلك، قد يؤدي اقتران جسم مضاد إلى الفلوروفورس إلى تغيير الربط، ويتعين إجراء تجارب تجريبية قبل دمج هذه الكواشف في البروتوكول.
في الختام، نحن وصف خط أنابيب للmidescence القائم على المجهر الليزر لعزل مناطق وهياكل محددة في الكلى البشرية لتمكين تحليل النسخ. هذا النهج يوفر مزايا هامة ويمكن أن تمتد إلى الأنسجة الأخرى لتوفير الأنسجة على أساس الاستجواب الجزيئي. يكمل علم النسخ الإقليمي تقنيات النسخ الأخرى من خلال توفير مرساة هيستووباثولوجي لفهم التعبير ، والمساعدة في تفسير البيولوجيا وتوقيع الصحة والمرض. هذه التكنولوجيا تناسبها بشكل طبيعي ضمن الرؤية لبناء أطلس النسخ الكلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
عام: ويود المؤلفون أن يشكروا محققي مشروع طب دقة الكلى (www.kpmp.org) على دعمهم ونصائحهم الكريمة.
التمويل: وقد قدمت الدعم لهذا العمل المعاهد الوطنية للصحة/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.)؛ المعاهد القومية للصحة/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S. ). وقد تم دعم البحوث التي تم الإبلاغ عنها في هذه المخطوطة من قبل المعهد الوطني للسكري والجهاز الهضمي وطب أمراض الكلى (NIDDK) كلية الطب (KPMP)، (www.kpmp.org)، تحت رقم الجائزة U2CDK114886.
توافر البيانات والمواد: يتم أرشفة البيانات في التعبير الجيني Omnibus (GEO # معلقة)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
- Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance. , Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016).
- Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
- Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).
