Summary
Nous décrivons un protocole pour la microdissection laser des sous-segments du rein humain, y compris le glomerulus, le tubule proximal, le membre ascendant épais, le conduit de collecte et l’interstitium. L’ARN est ensuite isolé des compartiments obtenus et le séquençage de l’ARN est effectué pour déterminer les changements dans la signature transcriptomique dans chaque sous-segment.
Abstract
L’analyse de l’expression génétique du tissu rénal humain est un outil important pour comprendre l’homéostasie et la pathophysiologie des maladies. Il est nécessaire d’augmenter la résolution et la profondeur de cette technologie et de l’étendre au niveau des cellules dans le tissu. Bien que l’utilisation du séquençage d’ARN nucléaire et unicelliste unique soit devenue répandue, les signatures d’expression des cellules obtenues de la dissociation tissulaire ne maintiennent pas le contexte spatial. La microdissection laser (LMD) basée sur des marqueurs fluorescents spécifiques permettrait l’isolement de structures spécifiques et de groupes cellulaires d’intérêt avec localisation connue, permettant ainsi l’acquisition de signatures transcriptomiques ancrées spatialement dans le tissu rénal. Nous avons optimisé une méthodologie de LMD, guidée par une tache basée sur la fluorescence rapide, pour isoler cinq compartiments distincts dans le rein humain et mener le séquençage ultérieur d’ARN des spécimens humains précieux de tissu de rein. Nous présentons également des paramètres de contrôle de la qualité pour permettre l’évaluation de l’adéquation des spécimens recueillis. Le flux de travail décrit dans ce manuscrit montre la faisabilité de cette approche pour isoler les signatures transcriptomiques sous-segmentales avec une grande confiance. L’approche méthodologique présentée ici peut également être appliquée à d’autres types de tissus avec substitution de marqueurs anticorps pertinents.
Introduction
Les progrès technologiques dans l’étude des échantillons de tissus ont amélioré la compréhension de l’état de santé et de la maladie dans divers organes. Ces progrès ont souligné que la pathologie peut commencer dans des régions limitées ou dans des types de cellules spécifiques, mais ont des implications importantes sur l’ensemble de l’organe. Par conséquent, à l’ère actuelle de la médecine personnalisée, il est important de comprendre la biologie à la fois au niveau cellulaire et régional et pas seulement globalement1. Cela est particulièrement vrai dans le rein, qui est composé de diverses cellules et structures spécialisées qui initient et/ou répondent différemment au stress pathologique. La pathogénie de divers types de maladie rénale humaine n’est toujours pas bien comprise. La génération d’une méthodologie pour étudier les changements dans l’expression des gènes dans des segments tubulaires spécifiques, des structures ou des zones de l’interstitium dans le rein humain améliorera la capacité de découvrir des changements spécifiques à la région qui pourraient éclairer sur la pathogénie de la maladie.
Les spécimens humains de biopsie rénale sont une ressource limitée et précieuse. Par conséquent, les technologies interrogeant la transcriptomique dans le tissu rénal devraient être optimisées pour économiser les tissus. Les méthodes disponibles pour étudier la transcriptomique au niveau cellulaire et régional comprennent le séquençage de l’ARN à cellule unique (scRNaseq), le RNaseq nucléaire unique (snRNaseq), l’hybridation spatiale in situ et la microdissection laser (LMD). Ce dernier est bien adapté à l’isolement précis des régions ou des structures d’intérêt dans les sections tissulaires, pour le séquençage et l’analyse del’ARN en aval 2,3,4,5. LMD peut être adopté pour s’appuyer sur l’identification de types ou de structures cellulaires spécifiques basés sur des marqueurs validés utilisant l’imagerie basée sur la fluorescence pendant la dissection.
Les caractéristiques uniques de la transcriptomics régionale assistée par microdissection laser comprennent : 1) la préservation du contexte spatial des cellules et des structures, qui complète les technologies cellulaires uniques où les cellules sont identifiées par expression plutôt qu’histologiquement; 2) la technologie informe et est informée par d’autres technologies d’imagerie parce qu’un marqueur d’anticorps définit des signatures d’expression ; 3) la capacité d’identifier les structures même lorsque les marqueurs changent dans la maladie; 4) détection de transcriptions faiblement exprimées dans environ 20 000 gènes; et 5) économie remarquable des tissus. La technologie est évolutive à une biopsie rénale avec moins de 100 μm d’épaisseur d’un noyau nécessaire à l’acquisition suffisante d’ARN et permet l’utilisation de tissus congelés archivés, qui sont couramment disponibles dans les grands dépôts ou centres universitaires6.
Dans les travaux qui ont suivi, nous décrivons en détail la technologie de transcriptomics régionale et en vrac, optimisée avec un nouveau protocole rapide de coloration par fluorescence pour une utilisation avec le tissu rénal humain. Cette approche améliore les explorations classiques du LMD parce qu’elle fournit des données d’expression distinctes pour les sous-segments interstitium et néphron par opposition à l’expression tubulointerstitial globale. On y inclut les mesures d’assurance et de contrôle de la qualité mises en œuvre pour assurer la rigueur et la reproductibilité. Le protocole permet la visualisation des cellules et des régions d’intérêt, ce qui se traduit par l’acquisition satisfaisante de l’ARN de ces zones isolées pour permettre le séquençage de l’ARN en aval.
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Protocol
L’étude a été approuvée pour utilisation par l’Institutional Review Board (IRB) de l’Université de l’Indiana.
REMARQUE : Utilisez ce protocole avec du tissu néphrectomie rénale (jusqu’à 2 cm dans les dimensions X et Y) conservé dans le composé de la température optimale de coupe (OCT) et stocké à -80 °C. Effectuez tous les travaux d’une manière qui limite la contamination par l’ARN, utilisez des gants jetables propres et un masque facial. Assurer la propreté de toutes les surfaces. L’équipement pour lequel ce protocole a été optimisé est un système de microdissection laser doté d’un laser UV pulsé.
1. Cryosection
- Exposer 1,2 μm LMD PPS-membrane (poly(p-phenylene sulfure) glisse à la lumière UV (dans une culture tissulaire capuchon d’écoulement laminaire) pendant 30 minutes, immédiatement avant la cryosection. Rangez les glissières à température ambiante pour une adhérence optimale des tissus.
- Laisser refroidir le cryostat à -20 °C. Nettoyez les surfaces de travail et installez une nouvelle lame de coupe.
- Placez une petite boîte à glissière (nettoyée avec la solution de décontamination de surface RNase) à l’intérieur de la chambre cryostat pour stocker les glissières avec du tissu fraîchement coupé.
- Adhérez l’échantillon en OCT à un porte-tissus et laissez-le équilibrer pendant quelques minutes pour atteindre la température de la chambre et renforcer l’adhérence entre le bloc OCT et le support. Faciliter le processus à l’aide d’un extracteur de chaleur.
- Coupez l’échantillon à une épaisseur de 12 μm et fixez-le à la diapositive LMD spécialisée, à l’aide de l’adaptateur de diapositives. Chaque diapositive contient une section de néphrectomie par toboggan ou jusqu’à deux sections de biopsie rénale par diapositive. Rangez les glissières à -80 °C à l’aide d’une cartouche de dessiccant et à l’intérieur d’un sac en plastique bien fermé pour éviter que l’excès d’humidité ne s’accumule à l’intérieur de la boîte à glissière.
- Étiquetez chaque diapositive avec un iD de spécimen, une date et un numéro de diapositive.
- Utilisez les diapositives avec des spécimens dans les 10 jours suivant la date initiale de cryosection.
2. Microdissection laser
- Immédiatement avant la coloration, préparer le mélange anticorps (Ab-Mix) en 10% BSA en PBS sans RNase en ajoutant ce qui suit: 4 μL de FITC-Phalloidin, 1,5 μL de DAPI, 2 μL d’anticorps tamm-horsfall protein (THP) directement conjugués à Alexa Fluor 546, 3,3 μL d’inhibiteur de la RNase et 89,2 μL de 10 % de BSA en PBS (pour atteindre un volume de 100 μL).
REMARQUE : Des anticorps alternatifs peuvent être utilisés à la place de l’anticorps THP. Par exemple, 2 μL d’anticorps mégalin/LRP2, directement conjugués à Alexa Fluor 568, peuvent être utilisés pour étiqueter le tubule proximal. L’Ab-Mix contient des anticorps LRP2 ou THP (pour visualiser les tubules proximaux ou les membres ascendants épais, respectivement). D’autres anticorps peuvent être validés en fonction des besoins de l’utilisateur. - Laver la glissade dans le froid glacial (-20 °C) 100 % d’acétone pendant 1 min et la déplacer dans la chambre d’humidité.
- Laver le haut de la diapositive avec du PBS sans RNase pendant 30 s. Répéter.
- Lavez le haut de la diapositive avec 10% BSA en PBS sans RNase pendant 30 s. Répétez.
- Appliquer l’Ab-Mix pendant 5 min.
- Lavez le haut de la diapositive avec 10% BSA en PBS sans RNase pendant 30 s. Répétez.
- Séchez la glissière pendant 5 min et chargez-la sur la plate-forme de coupe de microdissection laser.
- Installez les tubes de collecte (tubes de microcentrifugeuses autoclavés de 0,5 mL) appropriés pour le travail pcr, contenant 50 μL de tampon d’extraction du kit d’isolation arn.
- Procédez avec LMD. Terminez chaque session LMD dans un délai maximum de 2 heures.
- Recueillir des images d’immunofluorescence avant et après la LMD, à l’aide de la caméra microscope pour valider la dissection pour la variabilité entre opérateurs ainsi qu’à des fins archivistiques, formation et évaluation de la qualité du protocole effectué. Afin d’obtenir 0,5 à 1 ng d’ARN, un minimum de 500 000 μm2 est nécessaire. Cela nécessite souvent l’utilisation de sections jusqu’à 8 x 12 μm d’épaisseur pour obtenir une quantité suffisante de matériaux pour tous les sous-segments d’intérêt.
- Identifiez les régions d’intérêt en les soudant, en les morphologie et en les acciseant à l’aide d’une puissance laser supérieure à 40.
REMARQUE : Voici les critères de dissection. Le tubule proximal est défini par l’étiquetage FITC-Phalloidin et LRP2. Le membre ascendant épais est défini par l’étiquetage THP. Le conduit de collecte est défini par la morphologie nucléaire (DAPI) et l’absence d’autres taches. Le glomerulus est défini par fitc-phalloidin et morphologie. L’interstitium est défini comme la zone entre les tubules tachés.
- Obtenez une signature d’expression transversale en vrac en apposant deux sections de 12 μm sur une diapositive LMD et en disséquant les sections entières en tampon d’extraction.
- À la fin du processus LMD, fermez les tubes de microcentrifugeuse de collecte et faites-le glisser vigoureusement pour vous assurer que le contenu se déplaçait du bouchon vers le bas du tube.
- Centrifuger les tubes à 3 000 x g pendant 30 s.
- Incuber les tubes dans un bain d’eau de 42 °C pendant 30 min.
- Centrifuger les tubes à 3 000 x g pendant 2 min.
- Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 0,5 mL et le conserver en -80 °C.
3. Isolement d’ARN
REMARQUE : Pour ce protocole d’isolement de l’ARN, nous avons adapté un protocole à partir d’une trousse commerciale d’isolement de l’ARN. Le protocole du fabricant a été modifié pour répondre aux exigences de contrôle de la qualité fixées pour le projet.
- Ajouter 250 μL de tampon conditionné (CB) à chaque colonne de purification de l’ARN (PC) et incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Centrifugeuse tous les PC pendant 1 min à 16.000 x g.
- Ajouter 50 μL d’éthanol à 70 % (fourni dans le kit) dans les tubes avec des échantillons de tissus. Bien mélanger les échantillons en faisant des tuyaux de haut en bas. Ne pas vortex. Ne pas centrifugeuse.
- Transférer le mélange dans des PC conditionnés et une centrifugeuse pendant 2 min à 100 x g (pour lier l’ARN), suivre rapidement avec centrifugation pendant 30 s à 16.000 x g (pour enlever le flux à travers). Répétez cette étape si plus d’un tube avec des échantillons de tissus sont disponibles pour un sous-segment donné.
- Ajouter 100 μL de Wash Buffer 1 (WB1) dans les PC et la centrifugeuse pendant 1 minute à 8 000 x g.
- Préparer 40 μL de DNase par échantillon (Ajouter 5 μL de DNase à 35 μL de tampon RDD). Ajouter ensuite 40 μL du mélange directement sur la membrane du PC et incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Ajouter 40 μL de WB1 sur la membrane du PC et une centrifugeuse de 15 s à 8 000 x g.
- Ajouter 100 μL de Wash Buffer 2 (WB2) sur la membrane du PC, et centrifugeuse pendant 1 min à 8 000 x g.
- Ajouter 100 μL de WB2 sur la membrane du PC, centrifugeuse pendant 2 min à 16 000 x g,suivre immédiatement par centrifugation pendant 1 min à 16 000 x g.
- Transférez le PC dans un nouveau tube de 0,5 mL.
- Ajouter 12 μL d’Elution Buffer (EB) sur la membrane et incuber pendant 7 min à température ambiante. Ainsi, le volume final de tous les échantillons de tissus disséqués mis en commun est de 12 μL par sous-segment.
- Centrifuger les échantillons pendant 1 min à 1000 x g, puis pendant 2 min à 16 000 x g.
- Transférer 2 μL dans un tube frais pour l’analyse bioanalyse (pour éviter les événements de gel-dégel).
- Conserver tous les tubes en -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour un traitement ultérieur.
4. Séquençage de l’ARN
- Évaluer chaque échantillon, destiné au séquençage, pour la qualité à l’aide d’un bioanalyseur commercial et d’une puce dédiée à la mesure de petites quantités d’ARN.
- Il faut suivre les paramètres de contrôle de la qualité (QC) avant la préparation et le séquençage de la bibliothèque : quantité d’ARN supérieure à 4 ng en vrac et supérieure à 0,5 à 1 ng pour chaque sous-segment; Le pourcentage de transcriptions de plus de 200 nucléotides (DV200) doit être supérieur à 25 % pour les échantillons de LMD (optimal > 75 %).
- Effectuer la préparation de la bibliothèque avec une trousse commerciale de préparation de la bibliothèque cDNA destinée à de petites quantités d’ARN dégradé. Pour le kit commercial énuméré dans le supplément, nous vous suggérons d’utiliser l’option 2, qui nécessite un minimum de DV200 de 25% et pas de fragmentation. Certaines technologies de séquençage peuvent nécessiter des seuils de DV200 minimaux plus élevés, tels que 30% 7.
- Ajoutez des adaptateurs et des index cDNA.
- Purifiez les bibliothèques RNAseq à l’aide de la technologie des perles magnétiques.
- Épuisez l’ADND ribosomal à l’aide d’un kit commercial d’enlèvement rRNA avant l’étape d’amplification de la bibliothèque RNAseq.
- Purifier la bibliothèque finale du RNAseq à l’aide de la technologie des perles magnétiques à une concentration de bibliothèque cDNA de 2 ng/μL.
- Effectuer le séquençage de l’ARN de 75 pb sur un système de séquençage commercial avec 30 millions de lecture/échantillon pour le vrac et 100 millions de lecture/échantillon pour les sections sous-segmentales.
- Utilisez un ARN de référence (25 μg) à chaque course de séquençage pour permettre le contrôle de l’effet de lot. La concentration initiale de notre ARN de référence est de 1 μg/μL, tandis que la concentration finale utilisée dans le séquençage est de 25 ng/μL. Exécutez l’ARN de référence comme un échantillon distinct pendant la préparation de la bibliothèque et courez avec tous les spécimens de LMD à chaque fois.
- Effectuer une analyse des données à l’aide de l’application FastQC pour évaluer la qualité des lectures séquençantes, intergéniques et mitochondriales et pour déterminer les lectures attribuées à un gène.
- Utilisez Integrative Genomics Viewer (IGV) pour l’alignement et edgeR/rbamtools pour les mesures d’expression de transcription.
- Retirez les échantillons avec moins de 100 000 lectures. Quantile normalise les lectures brutes dans l’ensemble de données après le filtrage des gènes faiblement exprimés à un seuil défini par l’utilisateur.
- Quantifier l’expression comme un rapport entre le sous-segment d’intérêt et la moyenne de tous les autres sous-segments et log2-transform. L’expression relative du même gène peut être comparée entre les sous-segments et les échantillons; cependant, il n’est pas idéal de comparer l’expression relative entre deux gènes différents en raison de différences potentielles de dégradation entre les gènes et les espèces d’ARN.
- Effectuer une analyse d’enrichissement pour comparer l’expression des gènes pour un ensemble de fabricants spécifiques à chaque sous-segment du néphron, tandis que les échantillons d’ARN de référence sont comparés entre lots. Un effet de lot dans un écart type de l’expression moyenne avec valeur R > 0,9 est considéré comme acceptable. Une normalisation supplémentaire est nécessaire pour un score d’effet de lot plus élevé. Toute course qui s’écarte de l’effet de lot accepté peut être signalée. Le Q30 devrait être supérieur à >90% pour chaque course de séquençage.
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Representative Results
Échantillons
Nous présentons des données provenant de neuf néphrectomies de référence (3 spécimens obtenus à l’Université de l’Indiana et 6 spécimens obtenus dans le cadre du Kidney Precision Medicine Project), en utilisant le protocole de coloration par fluorescence rapide pour isoler les segments de néphron rénal et les zones interstitielles. Les sections utilisées dans ce processus ont été obtenues des donneurs de rein décédés ou des nephrectomies non affectées de tumeur. Ces échantillons n’avaient pas d’évidence pathologique de la maladie tel que visualisé dans la tache de H&E prélevée dans les sections contiguës (figure 1A).
Contrôle de la qualité de microdissection laser
L’identification des sous-segments tubulaires dans le rein est accomplie par la coloration d’anticorps des marqueurs tubulaires uniques, aussi bien que la morphologie et les repères structurels. La figure 1B-C illustre la coloration et la microdissection des sous-segments tubulaires d’une néphrectomie représentative. Ceci est accompli en souillant avec DAPI (noyaux), FITC-Phalloidin (F-actin), et un anticorps supplémentaire si nécessaire. La coloration par fluorescence utilisée a permis de visualiser les sous-segments rénaux avec un degré élevé de confiance, guidés davantage par les caractéristiques morphologiques ainsi que le positionnement spatial des structures imageées (figure 2). Par exemple, le glomeruli est révélé par la phalloidine et la coloration DAPI avec une morphologie très distinctive. De même, la collecte des conduits est visualisée à l’aide de la morphologie nucléaire et de l’absence d’autres taches. L’anticorps mégalin/LRP2 (directement conjugué à Alexa Fluor 568) est utilisé ici pour identifier les tubules proximaux. L’épais membre ascendant est visualisé à l’aide d’un anticorps protéique Tamm-Horsfall (THP) (directement conjugué à Alexa Fluor 546). En revanche, l’interstitium est excisé le long de la membrane externe des tubules et comprend des cellules stromales et immunitaires ainsi que de petits capillaires.
Pour obtenir suffisamment d’ARN de 0,5 à 1 ng par sous-segment, nous cherchons à disséquer une superficie minimale de 500 000 μm2. Cela nécessite généralement de cinq à huit sections de 12 μm d’épaisseur (1 section par diapositive) pour obtenir suffisamment de matériaux pour tous les sous-segments. La dissection de n’importe quelle diapositive est terminée en moins de 2 heures pour préserver la qualité de l’ARN qui permet de couper ~4 segments par diapositive. Les tissus acquis du même sous-segment sont mis en commun à partir de plusieurs diapositives pour le séquençage en aval. Une image d’immunofluorescence pré et post-LMD est obtenue pour valider la collection de sous-segments d’intérêt à l’aide d’une caméra attachée. La figure 3 délimite les taux de réussite de la zone de dissection et de l’entrée minimale d’ARN. Le taux de réussite de la réunion de l’entrée de zone minimale était >90% dans cet ensemble de données représentatif. Si le tissu source contient une petite quantité de CD ou d’interstitium, il est possible que la zone de dissection soit inférieure à 500 000 μm2 pour ces segments après avoir utilisé 8 diapositives. Des diapositives supplémentaires pourraient être coupées en fonction des besoins de l’utilisateur; toutefois, comme on le voit à la figure 3,si la superficie est proche de 500 000 μm2,le nombre de gènes détectés désiré a un taux de réussite élevé (100 %) et le taux total de réussite du nombre de lecture est de 98,6 % (1 spécimen est tombé en dessous de la mesure du QC). Ainsi, il y avait assez de tissu pour réaliser le gène suffisant et les comptes de lecture sans utiliser le tissu additionnel.
Contrôle de la qualité des entrées de séquençage
La plate-forme de préparation et de séquençage sélectionnée de la bibliothèque commerciale permet des mesures reproductibles de l’expression des transcriptions, même avec de faibles quantités d’ARN fortement dégradé. L’entrée minimale d’ARN est de 500 pg et le DV200 minimum (proportion de lires de plus de 200 nucléotides de longueur) est supérieur à 25%. Il n’y a pas de RIN minimum. Séquençage avec 100 millions de lectures par échantillon, nous cherchons à saturer les relevés disponibles afin de détecter les transcriptions faiblement exprimées. Le total des lectures peut être ajusté en fonction des besoins de l’utilisateur.
Il est simple d’obtenir suffisamment d’ARN à partir de deux sections transversales en vrac de 12 μm, de sorte que nous cherchons à obtenir une quantité minimale plus élevée d’ARNm de 4 ng pour le séquençage en vrac. Tel que délimité dans le protocole, chaque sous-segment nécessite 0,5-1 ng d’ARN total. La concentration optimale d’ARN est supérieure à 50 pg/μL après isolation. Des quantités d’ARN inférieures à celle-ci peuvent entraîner une réduction de la détection des gènes et des comptes de lecture observés. La majorité des échantillons donnent >20.000 gènes détectés et >1 million lit. Un DV200 supérieur à 25% pour tous les spécimens est requis par le fabricant (>75% est considéré comme optimal). Bien que rin soit mesuré, le processus de microdissection laser réduit rin et les plates-formes de séquençage d’ARN ont été optimisées pour l’ARN fragmenté. La quantité et la qualité de l’ARN sont évaluées par un bioanalyseur avant le séquençage. La tache rapide diminue le temps pendant laquelle le tissu est exposé à la température ambiante et aux conditions aqueuses, minimisant ainsi dans la mesure du possible la dégradation de l’ARN. La mesure de contrôle de la qualité DV200 pour l’entrée de séquençage se trouve également à la figure 3.
Contrôle de la qualité de sortie de séquençage
Le traitement des données en aval utilise la normalisation quantile pour permettre la comparaison entre les échantillons dans différents lots. Un nombre minimum de détections génétiques de 10 000 et un nombre minimum de lecture d’un million sont utilisés comme seuils pour inclure des échantillons dans la normalisation quantile. Les échantillons dont le nombre de gènes est moins détecté ou lu sont exclus de la normalisation quantile et des analyses comparatives subséquentes. Seulement 1 échantillon sous-segmental disséqué sur 98 n’a pas atteint ces seuils (figure 3). Le Q30 (proportion de lecture cartographiée à une confiance de 99,9 % ) a été supérieur à 93 % pour chaque expérience de séquençage (figure 4).
Nous séquençons un ARN de référence humain (25 ng) à chaque course de séquençage pour permettre la correction de l’effet de lot si une telle correction est souhaitée ou requise. L’effet de lot mesuré devrait être dans un écart type de l’expression moyenne avec une valeur R > 0,9. Si l’effet de lot est plus élevé, une normalisation supplémentaire est nécessaire pour cette course de séquençage. En l’espèce, l’effet de lot a été inférieur à 3 % dans les quatre expériences de séquençage décrites à la figure 4. Ainsi, l’effet de lot est généralement abordé avec la normalisation quantile pour toutes les courses de séquençage, agnostique à l’ARN de référence. Aucune correction basée sur l’ARN de référence n’a encore été mise en œuvre, mais cette information est disponible et pourrait être utilisée en fonction des objectifs d’une analyse particulière.
Rigueur et reproductibilité
Il est important de faire preuve de rigueur dans l’identification des types et des structures cellulaires. Après la microdissection laser, nous testons l’enrichissement de marqueurs connus dans le glomeruli, PT, TAL, CD et interstitium par rapport aux autres compartiments (Tableau 1). Une analyse de l’enrichissement est utilisée pour comparer l’expression des gènes pour les marqueurs attendus prédéterminés. L’expression des gènes est transmise sous forme de ratioslog 2 de l’expression du sous-segment d’intérêt par rapport à la moyenne des autres sous-segments. Cette mesure d’expression a été choisie pour les échantillons humains car elle réduit la variabilité inter-individuelle, facilitant les comparaisons entre les types de cellules et de compartiments entre les spécimens. Toutefois, les lectures brutes et les lectures normalisées quantiles peuvent également être comparées dans d’autres analyses. La figuree 5 illustre des exemples de coloration immunohistochimique de ces 5 marqueurs connus sélectionnés, tels que présentés dans l’Atlas des protéines humaines.
Ainsi, nous présentons des sources de données orthogonales qui donnent confiance au sous-segment correct collecté : 1) l’imagerie qui inclut la tache d’anticorps et la morphologie du segment/compartiment, et 2) la sortie d’expression montrant les marqueurs connus sont exprimées dans le sous-segment correspondant.
L’analyse transcriptomique régionale des gènes exprimés dans chaque sous-segment permet une identification de marqueur nouvelle et sous-estimée. La figure 6 illustre un exemple d’un marqueur pour chaque sous-segment identifié par transcriptomics régional de LMD qui a également donné une coloration immunohistochimique spécifique du sous-segment correspondant de néphron.
Pour démontrer la reproductibilité et comprendre l’effet de la variabilité d’opérateur, nous avons mené une expérience sur un échantillon de nephrectomy de tumeur. Ce spécimen a eu le glomeruli, PT, et TAL re-disséqué pour augmenter la confiance des résultats de séquençage d’ARN et sert maintenant de réplique technique utile. À quelques mois d’intervalle, cet échantillon a subi un deuxième cas de cryosection, de coloration d’anticorps, de dissection de LMD, d’extraction d’ARN, de préparation de bibliothèque et de séquençage d’ARN (figure 7) des compartiments glomeruli, PT et TAL. Les deux versions (v1 et v2) ont été comparées. Les compartiments glomerular, PT, et TAL ont été fortement corrélés avec r2 valeurs >0.95, semblable à l’effet minimal de lot de notre ARN de référence.
Figure 1 : Images représentatives du tissu rénal.
(A) Tache H & E d’un tissu rénal de référence humaine. (B) Image immunofluorescente du tissu rénal de référence humaine avec les segments ascendants épais tachés de membre avant LMD et (C) immédiatement après dissection de la structure ascendante épaisse simple de membre. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Images représentatives de sous-segments rénaux de référence, visualisées à 20 x à l’aide d’une approche spécifique de coloration immunofluorescente.
(A)a Glomerulus, (B) Proximal Tubule, (C) Membre ascendant épais, (D) Collecte du conduit, (E) Interstitium. (*= p < 0,05, **= p < 0,01, ***= p < 0,001 par ANOVA). Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Mesures de contrôle de la qualité dans la transcriptomique segmentale.
(A) Plus de 90 % des échantillons pilotes ont atteint le seuil d’entrée de la zone de dissection de 500 000 μm2. (B) Tous les échantillons, sauf un, ont atteint l’apport d’ARN souhaité d’au moins 500 pg. (C) 100 % des échantillons pilotes ont atteint le seuil minimum de DV200 du fabricant de 25 % et (D) 100 % des échantillons ont atteint notre seuil minimum de 10 000 gènes détectés. ( E )Tousles échantillons sauf un ont atteint un nombre total minimum de lecture de 1 million. Comme prévu, les zones de dissection inférieures sont corrélées avec des concentrations réduites d’ARN, des comptes de gènes plus faibles et des comptes de lecture plus faibles. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Contrôle de la qualité du séquençage.
(A) Les pistes de séquençage utilisant un ARN de référence (non quantile normalisé) sont comparées à l’expression moyenne de toutes les courses. Il existe une forte corrélation avec l’effet de lot minimum (tous les R >0.969). (B) Plus de 93 % de nos lectures dans toutes les courses ont été cartographiées avec une grande confiance (Q30 ou 99,9 %). Notez que les valeurs Q30 sont fournies par voie avec plusieurs voies par course. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Exemples de coloration immunohistochimique pour identifier les marqueurs connus sélectionnés.
Les images sont représentées pour (A) NPHS1 (B) LRP2 (C) UMOD (D) SLC4A9 (E) COL6A2. Les images d’immunohistochimie sont obtenues à partir de l’Atlas des protéines humaines. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Exemples de coloration immunohistochimique pour illustrer l’expression de gènes marqueurs non traditionnels dans les sous-segments pertinents.
Les transcriptions représentées avec l’immunohistochimie correspondante incluent (A) SHANK3 dans glomerulus, (B) ACSM2B dans le tubule proximal, (C) RAP1GAP dans le membre ascendant épais, et (D) L1CAM dans le conduit de collecte. Les images d’immunohistochimie sont obtenues à partir de l’Atlas des protéines humaines. (*= p < 0.0001 par ANOVA) S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Corrélation entre deux dissections distinctes avec séquençage séparé du même échantillon.
Un degré élevé de corrélation a été observé entre différentes dissections dans le tubule proximal (A) glomerulus, (B) et (C) boucle ascendante épaisse de Henle. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Marqueur | Segment | Changement de pli | p-Valeur |
| NPFS1 | Glomerulus ( Glomerulus ) | 32.64 | 1.97E-08 |
| LRP2 (en) | Proximal Tubule | 4.69 | 1.21E-05 |
| L’UMOD | Membre ascendant épais | 24.92 | 2.00E-07 |
| SLC4A9 (en) | Collecte des conduits | 4.09 | 0.000133 |
| COL6A2 (col6A2) | Interstitium (Interstitium) | 7.19 | 1.47E-06 |
Tableau 1 : Valeurs moyennes représentatives pour chaque sous-segment d’intérêt parmi trois échantillons de néphrectomie, comparativement aux sous-segments restants.
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Discussion
La transcriptomics basée sur le LMD est une technologie utile qui ancre l’expression des gènes dans des zones spécifiques du tissu. La base de cette technologie et son application potentielle dans le rein a été décrite précédemment8. Toutefois, l’optimisation, la modernisation et la rationalisation de la dissection basée sur la fluorescence visant spécifiquement à une dissection de haute précision pour le séquençage de l’ARN en aval sont moins omniprésentes. Parce que cette méthodologie est spatialement anquée dans le tissu, elle a le potentiel de révéler des marqueurs nouveaux ou sous-estimés dans les structures tissulaires, en particulier dans les états de la maladie. En fait, de nombreux marqueurs communs des cellules peuvent changer avec la maladie, s’appuyant donc uniquement sur les marqueurs d’expression de l’ARN cellulaire pour l’arbitrage de l’identité sans le contexte spatial peut être difficile dans les états de la maladie. Par conséquent, l’approche LMD ancrée spatialement est susceptible de compléter et de fournir une plate-forme de vérité au sol pour de nombreuses autres technologies transcriptomiques comme le séquençage à cellules simples et à ARN nucléaire unique, qui définissent les cellules principalement par leur profil d’expressiongénétique 9. En outre, la profondeur de l’expression des gènes fournie par le LMD (jusqu’à 20 000 gènes par échantillon) offre un autre avantage et un lieu important pour relier les données provenant de sources multiples et tenir compte des changements dans l’expression des gènes qui peuvent ne pas être apparents sans une certaine profondeur. La prise en compte de l’économie tissulaire est une autre caractéristique positive de cette technologie, par laquelle une épaisseur inférieure à 100 μm au total à partir d’un bloc gelé pourrait être suffisante pour un ensemble de données LMD entier. Cela permet d’utiliser les restes de tissu à d’autres fins analytiques.
Le LMD a des limites. Une limitation prévue de l’acquisition de données transcriptomiques de microdissection laser est sa nature inférieure de débit. L’automatisation future peut s’avérer importante dans l’amélioration del’évolutivité 10,11. Deux autres limitations de la transcriptomics de LMD incluent la dépendance à l’expertise et l’impact de la qualité de tissu sur des résultats de données. La collecte accidentelle de cellules et de matériaux en dehors du segment d’intérêt est une limitation connue parce que des compartiments enrichis de cellules sont collectés, pas une seule cellule. LMD s’appuie sur la compétence d’un utilisateur dans la compréhension de la structure tissulaire et nécessite donc une certaine expertise de domaine. Ainsi, les individus doivent être formés pour identifier les régions pertinentes dans le rein avec et sans taches d’anticorps. Enfin, l’effet de la qualité des tissus peut avoir un impact sur la qualité des données en aval. Le protocole LMD conduit à la dégradation des tissus, de sorte que la qualité du matériau de départ est importante. Cependant, ce protocole a été optimisé sur des biopsies archivées avec plusieurs échantillons de qualité modérée seulement. Les données incluses montrent que la plate-forme transcriptomique sélectionnée est robuste.
Il convient de noter que la trousse d’isolement utilisée et la méthodologie en aval du séquençage de l’ARN doivent être adaptées spécifiquement au degré prévu de dégradation de l’ARN. Le protocole de coloration décrit ici a été adopté parce qu’il a eu l’effet le plus favorable sur la minimisation d’un tel effet. Dans ce protocole, le tissu a été incorporé dans oct afin de faciliter des comparaisons futures entre d’autres technologies transcriptomiques. Cependant, le tissu fixe de formaline peut être une alternative.
Les données présentées dans ce manuscrit révèlent les avantages de la transcriptomique régionale, y compris l’optimisation, les mesures de contrôle de la qualité et les résultats technologiques. L’établissement de critères rigoureux de contrôle de la qualité pré-analytique et analytique, ainsi que l’établissement de preuves solides de rigueur et de reproductibilité sont essentiels à toute méthodologie. Les applications futures de la transcriptomics régionale peuvent être largement regroupées en applications biologiques, en progrès techniques et en progrès analytiques. Les applications biologiques futures peuvent viser l’interrogation des tissus des tubules non blessés, blessés, et régénérants, aussi bien que des tubules à proximité de l’inflammation. Ces compartiments peuvent être identifiés dans la même biopsie à la fois par des marqueurs morphologiques traditionnels ainsi que par des taches d’anticorps pour des marqueurs spécifiques à la « voie ». Les deux marqueurs d’anticorps validés pour une utilisation dans cette technologie, la mégaline et l’uromoduline, sont fortement exprimés dans le tubule proximal et le membre ascendant épais respectivement. Cependant, il est possible que ces marqueurs puissent être réduits dans les tissus gravement diseaseés. Dans ces situations, la validation supplémentaire par anticorps de marqueurs spécifiques à la voie ou de nouveaux marqueurs qui ne modifient pas leur niveau d’expression peut surmonter ce problème.
LMD est susceptible d’être une méthode appropriée à utiliser dans l’interrogatoire transcriptomique d’autres organes. La sélection et l’optimisation des anticorps qui fonctionnent pour la coloration rapide seront impératives. Un anticorps qui fonctionne dans un protocole de coloration régulier peut ne pas nécessairement fonctionner pour le protocole de coloration rapide, qui nécessite probablement des anticorps à haute affinité. Un anticorps conjugué primaire minimisera les étapes nécessaires et peut offrir des avantages. Cependant, la conjugaison d’un anticorps aux fluorophores peut modifier la liaison, et des expériences pilotes doivent être effectuées avant l’incorporation de ces réaconts dans le protocole.
En conclusion, nous décrivons un pipeline pour la microdissection laser fluorescence-basée pour isoler des secteurs et des structures spécifiques dans le rein humain pour permettre une analyse transcriptomique. Cette approche offre des avantages importants et peut être étendue à d’autres tissus pour fournir un interrogatoire moléculaire basé sur les tissus. La transcriptomics régionale complète d’autres technologies transcriptomiques en fournissant un ancrage histopathologique pour comprendre l’expression, aidant à l’interprétation de la biologie et à la signature de la santé et de la maladie. Cette technologie s’inscrit naturellement dans la vision de construction d’un atlas transcriptomique du rein.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Général: Les auteurs remercient les chercheurs du Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) pour leur soutien et leurs conseils gracieux.
Financement : Le soutien à ces travaux a été fourni par les NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (S.T.A.). Les recherches rapportées dans ce manuscrit ont été soutenues par le National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), sous le numéro de prix U2CDK114886.
Disponibilité des données et des matériaux : Les données sont archivées dans le Gene Expression Omnibus (GEO # en attente)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
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