Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die Lasermikrodissektion von Untersegmenten der menschlichen Niere, einschließlich des Glomerulus, proximalen Tubuli, dick aufsteigender Gliedmaße, Sammelkanal und Interstitium. Die RNA wird dann aus den erhaltenen Kompartimenten isoliert und die RNA-Sequenzierung wird durchgeführt, um Veränderungen in der transkriptomischen Signatur innerhalb jedes Teilsegments zu bestimmen.
Abstract
Die Genexpressionsanalyse des menschlichen Nierengewebes ist ein wichtiges Werkzeug, um Homöostase und Krankheitspathophysiologie zu verstehen. Es ist notwendig, die Auflösung und Tiefe dieser Technologie zu erhöhen und sie auf die Ebene der Zellen im Gewebe auszudehnen. Obwohl die Verwendung von einzelnuklearen und einzelzelligen RNA-Sequenzierungen weit verbreitet ist, behalten die Expressionssignaturen von Zellen, die aus der Gewebedissoziation gewonnen werden, keinen räumlichen Kontext bei. Lasermikrodissektion (LMD) auf Basis spezifischer fluoreszierender Marker würde die Isolierung spezifischer Strukturen und Zellgruppen von Interesse mit bekannter Lokalisierung ermöglichen und so den Erwerb von räumlich verankerten transkriptomischen Signaturen im Nierengewebe ermöglichen. Wir haben eine LMD-Methodik optimiert, die von einem schnellen fluoreszenzbasierten Fleck geleitet wird, um fünf verschiedene Kompartimente innerhalb der menschlichen Niere zu isolieren und anschließende RNA-Sequenzierungen von wertvollen menschlichen Nierengewebeproben durchzuführen. Wir stellen auch Qualitätskontrollparameter vor, um die Angemessenheit der gesammelten Proben beurteilen zu können. Der in diesem Manuskript beschriebene Workflow zeigt die Durchführbarkeit dieses Ansatzes, subsegmentale transkriptomische Signaturen mit hoher Sicherheit zu isolieren. Der hier vorgestellte methodische Ansatz kann auch auf andere Gewebetypen mit Substitution relevanter Antikörpermarker angewendet werden.
Introduction
Technologische Fortschritte bei der Untersuchung von Gewebeproben haben das Verständnis des Gesundheitszustands und der Krankheit in verschiedenen Organen verbessert. Solche Fortschritte haben unterstrichen, dass Pathologie in begrenzten Regionen oder in bestimmten Zelltypen beginnen kann, aber wichtige Auswirkungen auf das gesamte Organ hat. Daher ist es im gegenwärtigen Alter der personalisierten Medizin wichtig, die Biologie sowohl auf Zell- als auch auf regionaler Ebene zu verstehen und nicht nur weltweit1. Dies gilt insbesondere für die Niere, die aus verschiedenen spezialisierten Zellen und Strukturen besteht, die differenziell pathologischen Stress initiieren und/oder darauf reagieren. Die Pathogenese verschiedener Arten menschlicher Nierenerkrankungen ist noch immer nicht gut verstanden. Die Generierung einer Methodik zur Untersuchung von Veränderungen der Genexpression in bestimmten röhrenförmigen Segmenten, Strukturen oder Bereichen des Interstitiums in der menschlichen Niere wird die Fähigkeit verbessern, regionale spezifische Veränderungen aufzudecken, die über die Pathogenese von Krankheiten informieren könnten.
Menschliche Nierenbiopsie-Proben sind eine begrenzte und wertvolle Ressource. Daher sollten Technologien, die Transkriptomik im Nierengewebe verhören, optimiert werden, um Gewebe zu sparen. Zu den verfügbaren Methoden zur Untersuchung der Transkriptomik auf Zell- und Regionaler Ebene gehören die einzellige RNA-Sequenzierung (scRNaseq), die einzelne kernatoische RNaseq (snRNaseq), die räumliche In-situ-Hybridisierung und die Lasermikrodissektion (LMD). Letzteres eignet sich gut für die präzise Isolierung von Regionen oder Strukturen von Interesse innerhalb von Gewebeabschnitten, für die nachgeschaltete RNA-Sequenzierung und -Analyse2,3,4,5. LMD kann angenommen werden, um sich auf die Identifizierung bestimmter Zelltypen oder Strukturen basierend auf validierten Markern zu verlassen, die fluoreszenzbasierte Bildgebung während der Zerlegung verwenden.
Zu den einzigartigen Merkmalen der lasermikrodissektionengestützten regionalen Transkriptomik gehören: 1) die Erhaltung des räumlichen Kontextes von Zellen und Strukturen, die Einzelzelltechnologien ergänzt, bei denen Zellen durch Expression und nicht durch Histologie identifiziert werden; 2) die Technologie informiert und wird durch andere Bildgebungstechnologien informiert, weil ein Antikörpermarker Ausdruckssignaturen definiert; 3) die Fähigkeit, Strukturen zu identifizieren, auch wenn sich Marker in Derkrankheit ändern; 4) Nachweis von niedrig exprimierenden Transkripten in etwa 20.000 Genen; und 5) bemerkenswerte Gewebewirtschaft. Die Technologie ist skalierbar für eine Nierenbiopsie mit einer Dicke von weniger als 100 m eines Kerns, der für eine ausreichende RNA-Erfassung notwendig ist, und ermöglicht die Verwendung von archiviertem gefrorenem Gewebe, das in großen Repositories oder akademischen Zentren allgemein verfügbar ist6.
In der anschließenden Arbeit beschreiben wir die regionale und Massen-Transkriptomik-Technologie im Detail, optimiert mit einem neuartigen schnellen Fluoreszenz-Färbeprotokoll für die Verwendung mit menschlichem Nierengewebe. Dieser Ansatz verbessert die klassischen LMD-Explorationen, da er separate Ausdrucksdaten für die Interstitium- und Nephron-Untersegmente im Gegensatz zu aggregierter tubulointerstitialer Expression bereitstellt. Dazu gehören die Qualitätssicherungs- und Kontrollmaßnahmen, die zur Gewährleistung von Strenge und Reproduzierbarkeit durchgeführt werden. Das Protokoll ermöglicht die Visualisierung von Zellen und Interessensgebieten, was zu einer zufriedenstellenden Erfassung von RNA aus diesen isolierten Bereichen führt, um eine nachgeschaltete RNA-Sequenzierung zu ermöglichen.
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Protocol
Die Studie wurde vom Institutional Review Board (IRB) der Indiana University genehmigt.
HINWEIS: Verwenden Sie dieses Protokoll mit Nierennephrektomiegewebe (bis zu 2 cm in der X- und Y-Dimension), das in der Verbindung optimale Schnitttemperatur (OCT) konserviert und bei -80 °C gelagert wird. Führen Sie alle Arbeiten in einer Weise durch, die die RNA-Kontamination begrenzt, verwenden Sie saubere Einweghandschuhe und eine Gesichtsmaske. Sorgen Sie für die Sauberkeit aller Oberflächen. Die Ausrüstung, für die dieses Protokoll optimiert wurde, ist ein Laser-Mikrodissektionssystem mit gepulsten UV-Laser.
1. Kryosektion
- 1,2 m LMD-PPS-Membran (Poly(p-Phenylensulfid) diaglyzieren, um 30 Minuten lang, unmittelbar vor dem Kryosektions-, UV-Licht (in einer laminaren Strömungshaube) der Gewebekultur aussetzen. Bewahren Sie die Dias bei Raumtemperatur auf, um eine optimale Gewebehaftung zu gewährleisten.
- Kühlen Sie den Kryostat auf -20 °C. Reinigen Sie die Arbeitsflächen und installieren Sie eine neue Schneidklinge.
- Legen Sie eine kleine Schiebebox (mit RNase Oberflächendekontaminationslösung gereinigt) in die Kryostatkammer, um Dias mit frisch geschnittenem Gewebe zu lagern.
- Die Probe in OCT an einem Gewebehalter kleben und einige Minuten ausgrenzen lassen, um die Kammertemperatur zu erreichen und die Haftung zwischen dem OCT-Block und dem Halter zu stärken. Helfen Sie den Prozess mit einem Wärmeabscheider.
- Schneiden Sie die Probe auf eine Dicke von 12 m und befestigen Sie sie mit dem Schiebeadapter auf dem speziellen LMD-Schlitten. Jede Folie enthält einen Nephrektomieabschnitt pro Folie oder bis zu zwei Nierenbiopsieabschnitte pro Folie. Bewahren Sie die Dias bei -80 °C mit einer Entweichpatrone und in einer dicht verschlossenen Plastiktüte auf, um zu verhindern, dass sich überschüssige Feuchtigkeit in der Schiebebox ansammelt.
- Beschriften Sie jede Folie mit einer Muster-ID, einem Datum und einer Foliennummer.
- Verwenden Sie die Dias mit Proben innerhalb von 10 Tagen ab dem ursprünglichen Datum der Kryosektion.
2. Laser-Mikrodissektion
- Bereiten Sie unmittelbar vor der Färbung den Antikörpermix (Ab-Mix) in 10% BSA in RNase-freier PBS vor, indem Sie folgendes hinzufügen: 4 l FITC-Phalloidin, 1,5 l DAPI, 2 L Tamm-Horsfall Protein (THP) Antikörper, die direkt mit Alexa Fluor 546 konjugiert werden, 3,3 l RNase-Inhibitor und 89,2 l von 10 % BSA in PBS (um ein Volumen von 100 l zu erreichen).
HINWEIS: Anstelle des THP-Antikörpers können alternative Antikörper verwendet werden. Zum Beispiel können 2 l megalin/LRP2-Antikörper, direkt konjugiert mit Alexa Fluor 568, verwendet werden, um den proximalen Tubuli zu kennzeichnen. Der Ab-Mix enthält entweder LRP2- oder THP-Antikörper (zur Visualisierung von proximalen Tubuli bzw. dicken aufsteigenden Gliedmaßen). Andere Antikörper können je nach Benutzerwunsch validiert werden. - Waschen Sie die Rutsche in eiskalt (-20 °C) 100% Aceton für 1 min und bewegen Sie es in die Feuchtigkeitskammer.
- Waschen Sie die Oberseite des Schlittens mit RNase-freien PBS für 30 s. Wiederholen.
- Waschen Sie die Oberseite der Folie mit 10% BSA in RNase-freier PBS für 30 s. Wiederholen.
- Tragen Sie den Ab-Mix für 5 min auf.
- Waschen Sie die Oberseite der Folie mit 10% BSA in RNase-freier PBS für 30 s. Wiederholen.
- Trocknen Sie den Schlitten 5 min lang an der Luft und laden Sie ihn auf die Laser-Mikrodissektionsschneideplattform.
- Installieren Sie die für pcR-Arbeiten geeigneten Sammelrohre (autoklavierte 0,5 ml Mikrozentrifugenrohre), die 50 l Extraktionspuffer aus dem RNA-Isolationskit enthalten.
- Fahren Sie mit LMD fort. Schließen Sie jede LMD-Sitzung innerhalb von höchstens 2 Stunden ab.
- Sammeln Sie Immunfluoreszenzbilder vor und nach der LMD, indem Sie die Mikroskopkamera verwenden, um die Sezierung für die Variabilität zwischen den Bedienern sowie für Archivierungszwecke, Schulungen und Qualitätsbewertungen des durchgeführten Protokolls zu validieren. Um 0,5 – 1 ng RNA zu erhalten, ist ein Minimum von 500.000m2 Fläche erforderlich. Dies erfordert oft die Verwendung von bis zu 8 x 12 m dicken Abschnitten, um eine ausreichende Materialmenge für alle Teilsegmente von Interesse zu erhalten.
- Identifizieren Sie Regionen von Interesse durch Färbung, Morphologie und Lage und verbrauchen Sie sie mit Laserleistung größer als 40.
HINWEIS: Hier sind die Sezierkriterien. Die proximale Tubuli wird durch FITC-Phalloidin und LRP2-Etikettierung definiert. Die dicke aufsteigende Extremität wird durch THP-Beschriftung definiert. Der Sammelkanal wird durch kerntechnische Morphologie (DAPI) und das Fehlen anderer Färbungen definiert. Der Glomerulus wird durch FITC-Phalloidin und Morphologie definiert. Das Interstitium ist definiert als der Bereich zwischen gefärbten Tubuli.
- Erhalten Sie eine Massenquerschnittsausdruckssignatur, indem Sie zwei 12-m-Abschnitte an einer LMD-Folie anbringen und die gesamten Abschnitte in den Extraktionspuffer sezieren.
- Schließen Sie nach Abschluss des LMD-Prozesses die sammelnden Mikrozentrifugenrohre und flicken Sie sie kräftig, um sicherzustellen, dass der Inhalt von der Kappe nach unten bewegt wird.
- Zentrifugieren Sie die Rohre bei 3.000 x g für 30 s.
- Inkubieren Sie die Rohre in 42 °C Wasserbad für 30 min.
- Zentrifugieren Sie die Rohre bei 3.000 x g für 2 min.
- Den Überstand auf ein neues 0,5 ml-Rohr übertragen und in -80 °C lagern.
3. RNA-Isolation
HINWEIS: Für dieses RNA-Isolationsprotokoll haben wir ein Protokoll aus einem kommerziellen RNA-Isolationskit angepasst. Das Protokoll des Herstellers wurde geändert, um die für das Projekt festgelegten Anforderungen an die Qualitätskontrolle zu erfüllen.
- Fügen Sie jeder RNA-Reinigungssäule (PC) 250 l Bedingten Puffer (CB) hinzu und inkubieren Sie 5 min bei Raumtemperatur.
- Zentrifugieren Sie alle PCs für 1 min bei 16.000 x g.
- Fügen Sie 50 l 70 % Ethanol (im Kit enthalten) in die Röhrchen mit Gewebeproben. Mischen Sie die Proben gut, indem Sie nach oben und unten. Wirbel nicht. Zentrifugieren Sie nicht.
- Das Gemisch in konditionierte PCs und Zentrifuge für 2 min bei 100 x g (zur Bindung der RNA) übertragen, schnell mit Zentrifugation für 30 s bei 16.000 x g folgen (um durchfließen). Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn mehr als 1 Röhrchen mit Gewebeproben für ein bestimmtes Untersegment verfügbar sind.
- Fügen Sie 100 l Waschpuffer 1 (WB1) in die PCs und Zentrifuge für 1 Minute bei 8.000 x g.
- Bereiten Sie 40 l DNase pro Probe vor (Hinzufügen von 5 l DNase zu 35 L RDD-Puffer). Dann 40 l des Gemischs direkt auf die Membran des PCs geben und 15 min bei Raumtemperatur brüten.
- Fügen Sie 40 l WB1 auf die Membran des PCs und Zentrifuge für 15 s bei 8.000 x g.
- Fügen Sie 100 l Waschpuffer 2 (WB2) auf die Membran des PCs und Zentrifuge für 1 min bei 8.000 x g.
- Fügen Sie 100 l WB2 auf die Membran des PCs, Zentrifuge für 2 min bei 16.000 x g, sofort folgen durch Zentrifugation für 1 min bei 16.000 x g.
- Übertragen Sie den PC in ein neues 0,5 ml Rohr.
- Fügen Sie 12 L Elution Buffer (EB) auf die Membran und inkubieren für 7 min bei Raumtemperatur. Somit beträgt das Endvolumen aller gepoolten sezierten Gewebeproben 12 L pro Teilsegment.
- Zentrifugieren Sie die Proben für 1 min bei 1.000 x g und dann für 2 min bei 16.000 x g.
- Übertragen Sie 2 l in ein frisches Rohr für die Bioanalyzer-Analyse (um Frost-Tau-Ereignisse zu verhindern).
- Alle Rohre in -80 °C lagern, bis sie zur Weiterverarbeitung bereit sind.
4. RNA-Sequenzierung
- Bewerten Sie jede Probe, die für die Sequenzierung bestimmt ist, auf Qualität mit einem kommerziellen Bioanalyzer und einem Chip, der der Messung kleiner RNA-Mengen gewidmet ist.
- Folgende Qualitätskontrolle (QC) Parameter vor der Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung sind erforderlich: RNA-Menge größer als 4 ng für Bulk und größer als 0,5 – 1 ng für jedes Teilsegment; Der Prozentsatz der Transkripte, die länger als 200 Nukleotide (DV200) sind, muss für LMD-Proben mehr als 25 % betragen (optimal > 75%).
- Durchführung der Bibliotheksvorbereitung mit einem kommerziellen cDNA-Bibliotheksvorbereitungskit, das für kleine Mengen degradierter RNA bestimmt ist. Für das kommerzielle Kit in der Ergänzung aufgeführt, Wir empfehlen, Option 2, die eine minimale DV200 von 25% und keine Fragmentierung erfordert. Einige Sequenzierungstechnologien erfordern möglicherweise höhere MINDEST-DV200-Schwellenwerte, z. B. 30 %7.
- Fügen Sie cDNA-Adapter und Indizes hinzu.
- Reinigen Sie die RNAseq-Bibliotheken mit magnetisch-perlen-Technologie.
- Erpleft die ribosomale cDNA mit einem kommerziellen rRNA-Entfernungskit vor dem RnAseq-Bibliotheksamplifikationsschritt.
- Reinigen Sie die endgültige RNAseq-Bibliothek mit magnetischer Perlentechnologie bei einer CDNA-Bibliothekskonzentration von 2 ng/L.
- Führen Sie die RNA-Sequenzierung von 75 bp gepaartem Ende auf einem kommerziellen Sequenzierungssystem mit 30 Millionen Lese-/Proben für Bulk und 100 Millionen Lese-/Proben für teilsegmentale Abschnitte durch.
- Verwenden Sie bei jedem Sequenzierungslauf eine Referenz-RNA (25 g), um die Steuerung des Batch-Effekts zu ermöglichen. Die Anfangskonzentration unserer Referenz-RNA beträgt 1 g/l, während die bei der Sequenzierung verwendete Endkonzentration 25 ng/l beträgt. Führen Sie die Referenz-RNA während der Bibliotheksvorbereitung als separate Probe aus und laufen Sie jeweils mit allen LMD-Proben.
- Führen Sie datenanalysen unter Verwendung der FastQC-Anwendung durch, um die Qualität der Sequenzierung, intergene und mitochondriale Lesevorgänge zu bewerten und Lesevorgänge zu bestimmen, die einem Gen zugeschrieben werden.
- Verwenden Sie Integrative Genomics Viewer (IGV) für Ausrichtung und edgeR/rbamtools für Transkriptexpressionsmessungen.
- Entfernen Sie Proben mit weniger als 100.000 Lesevorgängen. Quantile normalisieren die Rohlesevorgänge im Datensatz, nachdem niedrig ausgedrückte Gene an einem benutzerdefinierten Schwellenwert herausgefiltert wurden.
- Quantifizieren Sie den Ausdruck als Verhältnis des Teilsegments von Interesse zum Durchschnitt aller anderen Untersegmente und log2-transform. Die relative Expression desselben Gens kann über Untersegmente und Proben hinweg verglichen werden; Es ist jedoch nicht ideal, die relative Expression zwischen zwei verschiedenen Genen aufgrund möglicher Degradierungsunterschiede zwischen Genen und RNA-Arten zu vergleichen.
- Führen Sie eine Anreicherungsanalyse durch, um die Genexpression für eine Reihe von Herstellern zu vergleichen, die für jedes Nephron-Untersegment spezifisch sind, während Referenz-RNA-Proben über Chargen hinweg verglichen werden. Ein Batcheffekt innerhalb von 1 Standardabweichung des mittelwertigen Ausdrucks mit R-Wert > 0,9 gilt als akzeptabel. Für eine höhere Batch-Effekt-Punktzahl ist eine zusätzliche Normalisierung erforderlich. Jede Ausführung, die vom akzeptierten Batcheffekt abweicht, kann gekennzeichnet werden. Der Q30 sollte für jeden Sequenzierungslauf größer als >90 % sein.
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Representative Results
Proben
Wir präsentieren Daten von neun Referenznephrektomien (3 Proben, die an der Indiana University gewonnen wurden, und 6 Proben, die durch das Kidney Precision Medicine Project gewonnen wurden), wobei das schnelle Fluoreszenz-Färbeprotokoll verwendet wird, um Nierennephronsegmente und interstitielle Bereiche zu isolieren. Die in diesem Prozess verwendeten Abschnitte wurden von verstorbenen Nierenspendern oder nicht betroffenen Tumornephrectomien gewonnen. Diese Proben hatten keine pathologischen Hinweise auf eine Krankheit, wie sie im H&E-Fleck aus zusammenhängenden Abschnitten visualisiert wurden (Abbildung 1A).
Laser Microdissection Qualitätskontrolle
Die Identifizierung von röhrenförmigen Untersegmenten in der Niere erfolgt durch Antikörperfärbung einzigartiger röhrenförmiger Marker sowie Morphologie und strukturelle Rand-) Abbildung 1B-C zeigt die Färbung und Mikrodissektion von röhrenförmigen Untersegmenten aus einer repräsentativen Nephrektomie. Dies wird durch Färbung mit DAPI (Nuklei), FITC-Phalloidin (F-Actin) und einem zusätzlichen Antikörper bei Bedarf erreicht. Die verwendete Fluoreszenzfärbung ermöglichte es, renale Untersegmente mit einem hohen Maß an Vertrauen zu visualisieren, weiter geleitet von morphologischen Merkmalen sowie räumlicher Positionierung der abgebildeten Strukturen (Abbildung 2). Zum Beispiel, Glomeruli werden durch Phalloidin und DAPI Färbung mit sehr ausgeprägter Morphologie offenbart. In ähnlicher Weise werden Sammelkanäle mittels nuklearer Morphologie und dem Fehlen anderer Flecken visualisiert. Der megalin/LRP2-Antikörper (direkt konjugiert mit Alexa Fluor 568) wird hier zur Identifizierung proximaler Tubuli verwendet. Die dicke aufsteigende Gliedmaße wird mit einem Tamm-Horsfall-Protein (THP) Antikörper (direkt konjugiert mit Alexa Fluor 546) visualisiert. Im Gegensatz dazu wird das Interstitium entlang der äußeren Membran der Tubuli ausgeschnitten und umfasst Stromal- und Immunzellen sowie kleine Kapillaren.
Um eine ausreichende RNA von 0,5 – 1 ng pro Untersegment zu erhalten, versuchen wir, eine Mindestfläche von 500.000 m2zu sezieren. Dies erfordert in der Regel fünf bis acht 12 m dicke Abschnitte (1 Abschnitt pro Schlitten), um ausreichend Material für alle Untersegmente zu erhalten. Die Zerlegung eines Dias erfolgt in weniger als 2 Stunden, um die RNA-Qualität zu erhalten, so dass man 4 Segmente pro Schlitten schneiden kann. Erworbenes Gewebe aus demselben Teilsegment wird aus mehreren Folien für die nachgelagerte Sequenzierung gepoolt. Ein Pre- und Post-LMD-Immunfluoreszenzbild wird erhalten, um die Sammlung von Teilsegmenten von Interesse mit einer angeschlossenen Kamera zu validieren. Abbildung 3 gibt die Erfolgsraten der Sezierfläche und des minimalen RNA-Eingangs ab. Die Erfolgsrate bei der Erfüllung der minimalen Flächeneingabe betrug >90% in diesem repräsentativen Dataset. Wenn das Quellgewebe eine kleine Menge der CD oder des Interstitiums hat, besteht die Möglichkeit, dass der Sezierbereich für diese Segmente unter 500.000m2 liegt, nachdem 8 Dias verwendet wurden. Zusätzliche Folien können je nach den Bedürfnissen des Benutzers geschnitten werden. Wie in Abbildung 3dargestellt, weist die gewünschte nachgewiesene Anzahl dererkannten Gene jedoch eine hohe Erfolgsrate auf (100%) und die Gesamterfolgsrate der Lesezählung beträgt 98,6 % (ein Exemplar fiel unter die QC-Metrik). So gab es genügend Gewebe, um ausreichende Gen- und Lesewerte zu erreichen, ohne zusätzliches Gewebe zu verwenden.
Sequenzierung der Eingabequalitätskontrolle
Die ausgewählte kommerzielle Bibliotheksvorbereitungs- und Sequenzierungsplattform ermöglicht reproduzierbare Messungen der Transkriptexpression, auch bei geringen Mengen stark degradierter RNA. Der minimale RNA-Eingang beträgt 500 pg und der minimale DV200 (Anteil der Lesewerte länger als 200 Nukleotide in der Länge) liegt über 25%. Es gibt kein Mindest-RIN. Sequenzierung mit 100 Millionen Lesevorgängen pro Probe, versuchen wir, die verfügbaren Lesevorgänge zu sättigen, um niedrig ausgedrückte Transkripte zu erkennen. Die Gesamtlesevorgänge können an die Bedürfnisse des Benutzers angepasst werden.
Es ist einfach, genügend RNA aus zwei 12 m Großen und Massenquerschnitten zu erhalten, daher versuchen wir, eine höhere minimale mRNA-Gesamtmenge von 4 ng für die Massensequenzierung zu erhalten. Wie im Protokoll abgegrenzt, benötigt jedes Untersegment 0,5-1 ng in der gesamten RNA. Die optimale RNA-Konzentration liegt nach der Isolierung über 50 pg/l. RNA-Mengen, die niedriger sind, können zu einer reduzierten Gendetektion und den beobachteten Lesezahlen führen. Die Mehrheit der Proben liefert >20.000 Gene und >1 Millionen Lesevorgänge. Der Hersteller benötigt einen DV200 von mehr als 25 % für alle Proben (>75% gilt als optimal). Obwohl RIN gemessen wird, reduziert der Prozess der Lasermikrodissektion RIN und die RNA-Sequenzierungsplattformen wurden für fragmentierte RNA optimiert. Die RNA-Menge und -Qualität wird vor der Sequenzierung von einem Bioanalyzer bewertet. Der schnelle Fleck verringert die Zeit, die das Gewebe Raumtemperatur und wässrige Bedingungen ausgesetzt ist, wodurch der Abbau der RNA so weit wie möglich minimiert wird. Die DV200-Qualitätskontrollmetrik für die Sequenzierung sezisierender Eingaben ist auch in Abbildung 3zu finden.
Sequenzierung der Ausgabequalitätskontrolle
Die nachgeschaltete Datenverarbeitung verwendet die Quantilnormalisierung, um den Vergleich zwischen Proben in verschiedenen Chargen zu ermöglichen. Eine minimale Gendetektionszahl von 10.000 und eine Mindestleseanzahl von 1 Million werden als Schwellenwerte verwendet, um Proben in die Quantilnormalisierung einzubeziehen. Proben mit geringerer Gendetektion oder Leseanzahl sind von der Quantilnormalisierung und nachfolgenden Vergleichsanalysen ausgeschlossen. Nur 1 von 98 sezierten teilsegmentalen Stichproben erfüllte diese Schwellenwerte nicht (Abbildung 3). Der Q30 (Anteil der mit 99,9 % Konfidenz abgebildeten Lesevorgänge) war für jedes Sequenzierungsexperiment größer als 93 %(Abbildung 4).
Wir sequenzieren eine menschliche Referenz-RNA (25 ng) mit jedem Sequenzierungslauf, um eine Korrektur des Chargeneffekts zu ermöglichen, wenn eine solche Korrektur gewünscht oder erforderlich ist. Der gemessene Chargeneffekt sollte innerhalb von 1 Standardabweichung des mittelmäßigen Ausdrucks mit einem R-Wert > 0,9 liegen. Wenn der Batcheffekt höher ist, ist eine zusätzliche Normalisierung für diesen Sequenzierungslauf erforderlich. Hier lag der Batch-Effekt in den vier Sequenzierungsexperimenten in Abbildung 4unter 3 %. Daher wird der Batch-Effekt in der Regel mit Quantilnormalisierung für alle Sequenzierungsläufe angesprochen, agnostisch auf die Referenz-RNA. Es wurde noch keine Korrektur auf der Grundlage der Referenz-RNA implementiert, aber diese Informationen sind verfügbar und könnten je nach den Zielen einer bestimmten Analyse verwendet werden.
Strenge und Reproduzierbarkeit
Es ist wichtig, strenge Ermittlungen zu den Zelltypen und -strukturen zu demonstrieren. Nach der Lasermikrodissektion testen wir die Anreicherung bekannter Marker in den Glomeruli, PT, TAL, CD und Interstitium im Vergleich zu den anderen Fächern (Tabelle 1). Eine Anreicherungsanalyse wird verwendet, um die Genexpression für vorbestimmte erwartete Marker zu vergleichen. Die Genexpression wird als Log2-Verhältnisse der Ausprägemenge des Teilsegments von Interesse im Vergleich zum Mittelwert der anderen Teilsegmente vermittelt. Diese Ausdrucksmetrik wurde für menschliche Proben ausgewählt, da sie die interindividuelle Variabilität reduziert und Vergleiche zwischen Zell- und Kompartimenttypen über Proben hinweg erleichtert. Die rohen Lese- und Quantil-Normallesevorgänge können jedoch auch in alternativen Analysen verglichen werden. Figure 5 zeigt Beispiele für immunhistochemische Färbung dieser 5 ausgewählten bekannten Marker, wie im Human Protein Atlas dargestellt.
So präsentieren wir orthogonale Datenquellen, die dem richtigen Teilsegment, das gesammelt wird, Vertrauen verleihen: 1) die Bildgebung, die den Antikörperfleck und die Morphologie des Segments/Fachs umfasst, und 2) die Expressionsausgabe, die bekannte Marker zeigt, werden im entsprechenden Teilsegment ausgedrückt.
Die regionale transkriptomische Analyse der in jedem Teilsegment exprimierenden Gene ermöglicht eine neuartige und unterschätzte Markeridentifikation. Abbildung 6 zeigt ein Beispiel für einen Marker für jedes Teilsegment, das durch lmD-Regionaltranskriptomik identifiziert wurde, die auch eine spezifische immunhistochemische Färbung des entsprechenden Nephron-Untersegments ergab.
Um die Reproduzierbarkeit zu demonstrieren und die Wirkung der Operatorvariabilität zu verstehen, haben wir ein Experiment an einer Tumornephrektomieprobe durchgeführt. Diese Probe ließ die Glomeruli, PT und TAL neu sezieren, um das Vertrauen der RNA-Sequenzierungsergebnisse zu erhöhen und dient nun als nützliche technische Replikation. Monate auseinander wurde diese Probe einer zweiten Instanz von Kryosektionen, Antikörperfärbungen, LMD-Sektion, RNA-Extraktion, Bibliotheksvorbereitung und RNA-Sequenzierung unterzogen (Abbildung 7) der Glomeruli-, PT- und TAL-Fächer. Die beiden Versionen (v1 und v2) wurden verglichen. Die Glomerular-, PT- und TAL-Fächer waren stark korreliert mit r2-Werten >0,95, ähnlich dem minimalen Chargeneffekt unserer Referenz-RNA.
Abbildung 1: Repräsentative Bilder des Nierengewebes.
(A) H&E-Färbung eines menschlichen Referenznierengewebes. (B) Immunfluoreszenzbild des menschlichen Referenznierengewebes mit gebeizten dicken aufsteigenden Gliedmaßensegmenten vor LMD und (C) unmittelbar nach der Zerlegung einer einzelnen dicken aufsteigenden Gliedmaßenstruktur. Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder von Referenz-Renal-Untersegmenten, visualisiert bei 20x mit einem spezifischen immunfluoreszierenden Färbungsansatz.
(A)a Glomerulus, (B) Proximal Tubule, (C) Dicke aufsteigende Gliedmaße, (D) Sammelkanal, (E) Interstitium. (*= p < 0,05, **= p < 0,01, ***= p < 0,001 von ANOVA). Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Qualitätskontrollmetriken in segmentalen Transkriptomics.
(A) Mehr als 90 % der Pilotproben erreichten den Grenzwert für die Einbringung von Sezierflächen von 500.000 m2. (B) Alle Proben mit Ausnahme einer Der Ersten erfüllten den gewünschten RNA-Eingang von mindestens 500 pg. (C) 100% der Pilotproben erfüllten die Mindestschwelle von 25% DV200 des Herstellers und (D) 100% der Proben erfüllten unsere Mindestschwelle von 10.000 nachgewiesenen Genen. (E) Alle Stichproben mit Ausnahme einer wurden eine Mindestlesemenge von 1 Million erreicht. Wie erwartet korrelieren niedrigere Sezierbereiche mit reduzierten RNA-Konzentrationen, niedrigeren Genzahlen und niedrigeren Lesezahlen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Sequenzierung der Qualitätskontrolle.
(A) Sequenzierungsläufe mit einer Referenz-RNA (nicht quantil normalisiert) werden mit der mittleren Expression aller Durchläufe verglichen. Es besteht eine starke Korrelation mit minimalem Chargeneffekt (alle R >0,969). (B) Mehr als 93 % unserer Lesevorgänge in allen Durchläufen wurden mit hohem Vertrauen abgebildet (Q30 oder 99,9%). Beachten Sie, dass Q30-Werte pro Fahrspur mit mehreren Fahrspuren pro Lauf bereitgestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Beispiele für immunhistochemische Färbung zur Identifizierung der ausgewählten bekannten Marker.
Die Bilder sind abgebildet für (A) NPHS1 (B) LRP2 (C) UMOD (D) SLC4A9 (E) COL6A2. Immunhistochemie-Bilder stammen aus dem Human Protein Atlas. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Beispiele für immunhistochemische Färbung zur Veranschaulichung der Expression nicht traditioneller Markergene in relevanten Untersegmenten.
Zu den dargestellten Transkripten mit entsprechender Immunhistochemie gehören (A) SHANK3 in glomerulus, (B) ACSM2B in proximalem Tubule, (C) RAP1GAP in der dicken aufsteigenden Gliedmaße und (D) L1CAM im Sammelkanal. Immunhistochemie-Bilder stammen aus dem Human Protein Atlas. (*= p < 0.0001 von ANOVA) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Korrelation zwischen zwei unterschiedlichen Sezieren mit getrennter Sequenzierung derselben Stichprobe.
Ein hoher Grad der Korrelation wurde zwischen verschiedenen Dissektionen in der (A) glomerulus, (B) proximalen Tubuli und (C) dicken aufsteigenden Schleife von Henle beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Marker | Segment | Faltenwechsel | p-Wert |
| NPHS1 | Glomerulus | 32.64 | 1.97E-08 |
| LRP2 | Proximal Tubule | 4.69 | 1.21E-05 |
| UMOD | Dicke aufsteigende Limbe | 24.92 | 2.00E-07 |
| SLC4A9 | Sammeln von Duct | 4.09 | 0.000133 |
| COL6A2 | Interstitium | 7.19 | 1.47E-06 |
Tabelle 1: Repräsentative Durchschnittswerte für jedes Teilsegment von Interesse in drei Nephrektomieproben im Vergleich zu den übrigen Teilsegmenten.
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Discussion
LMD-basierte Transkriptomik ist eine nützliche Technologie, die die Genexpression an bestimmten Bereichen im Gewebe verankert. Die Basis dieser Technologie und ihre mögliche Anwendung in der Niere wurde zuvor beschrieben8. Die Optimierung, Modernisierung und Rationalisierung der fluoreszenzbasierten Dissektion, die speziell auf eine hochpräzise Sesektion für die nachgeschaltete RNA-Sequenzierung ausgerichtet ist, ist jedoch weniger allgegenwärtig. Da diese Methode räumlich im Gewebe begründet ist, hat sie das Potenzial, neue oder unterschätzte Marker in Gewebestrukturen, insbesondere in Krankheitszuständen, zu offenbaren. Tatsächlich können sich viele häufige Marker von Zellen mit Krankheiten ändern, daher kann die Abhängigkeit nur auf den Zell-RNA-Expressionsmarkern für die Identitätsbeurteilung ohne den räumlichen Kontext in Krankheitszuständen eine Herausforderung sein. Daher wird der räumlich verankerte LMD-Ansatz wahrscheinlich eine Boden-Wahrheits-Plattform für viele andere transkriptomische Technologien wie die Einzelzell- und Single-Kern-RNA-Sequenzierung ergänzen und bieten, die Zellen überwiegend durch ihr Genexpressionsprofil9definieren. Darüber hinaus bietet die tiefe Genexpression, die durch LMD bereitgestellt wird (bis zu 20.000 Gene pro Probe), einen weiteren Vorteil und wichtigen Ort, um Daten aus mehreren Quellen miteinander zu verknüpfen und Veränderungen in der Genexpression zu berücksichtigen, die ohne eine gewisse Tiefe möglicherweise nicht erkennbar sind. Die Berücksichtigung der Gewebeökonomie ist ein weiteres positives Merkmal dieser Technologie, bei der eine Dicke von weniger als 100 m aus einem gefrorenen Block für einen gesamten LMD-Datensatz ausreichen könnte. Dadurch können Restgewebe für andere analytische Zwecke verwendet werden.
Die LMD hat Einschränkungen. Eine erwartete Einschränkung der lasermikrodissektionentranskriptomischen Datenerfassung ist ihre geringere Durchsatznatur. Zukünftige Automatisierung kann sich als wichtig für die Verbesserung der Skalierbarkeiterweisen 10,11. Zwei weitere Einschränkungen der LMD-Transkriptomik umfassen die Abhängigkeit von Fachwissen und die Auswirkungen der Gewebequalität auf die Datenergebnisse. Die unbeabsichtigte Sammlung von Zellen und Material außerhalb des Segments von Interesse ist eine bekannte Einschränkung, da angereicherte Zellabschnitte gesammelt werden, nicht eine einzelne Zelle. LMD stützt sich auf die Kenntnisse des Benutzers im Verständnis der Gewebestruktur und erfordert daher eine gewisse Domänenexpertise. Daher müssen Einzelpersonen geschult werden, um relevante Regionen in der Niere mit und ohne Antikörperfärbung zu identifizieren. Schließlich kann sich die Wirkung der Gewebequalität auf die nachgelagerte Datenqualität auswirken. Das LMD-Protokoll führt zu Gewebeabbau, daher ist die Qualität des Ausgangsmaterials wichtig. Dieses Protokoll wurde jedoch für archivierte Biopsien mit mehreren Proben von nur mäßiger Qualität optimiert. Die enthaltenen Daten zeigen, dass die ausgewählte Transkriptomik-Plattform robust ist.
Bemerkenswert ist, dass das verwendete Isolationskit und die nachgelagerte Methodik der RNA-Sequenzierung speziell auf den erwarteten Grad des RNA-Abbaus zugeschnitten sein müssen. Das hier beschriebene Färbeprotokoll wurde angenommen, weil es die günstigste Wirkung auf die Minimierung dieser Wirkung hatte. In diesem Protokoll wurde Gewebe in OCT eingebettet, um zukünftige Vergleiche über andere transkriptomische Technologien hinweg zu erleichtern. Formalin festem Gewebe kann jedoch eine Alternative sein.
Die in diesem Manuskript vorgestellten Daten zeigen die Vorteile regionaler Transkriptomik, einschließlich der Optimierung, Qualitätskontrolle und Technologieergebnisse. Die Festlegung strenger voranalytischer und analytischer Qualitätskontrollkriterien sowie die Festlegung solider Nachweise für Strenge und Reproduzierbarkeit sind für jede Methodik von entscheidender Bedeutung. Zukünftige Anwendungen der regionalen Transkriptomik lassen sich grob in biologische Anwendungen, technische Fortschritte und analytische Fortschritte einteilen. Zukünftige biologische Anwendungen können auf die Abfrage von Gewebe von unverletzten, verletzten und regenerierenden Tubuli sowie Tubulen in unmittelbarer Nähe zu Entzündungen abzielen. Diese Fächer können in der gleichen Biopsie sowohl durch traditionelle morphologische Marker als auch durch Antikörperflecken für "Weg"-spezifische Marker identifiziert werden. Die beiden Antikörpermarker, die für den Einsatz in dieser Technologie validiert wurden, Megalin und Uromodulin, sind stark in der proximalen Tubuli bzw. dick aufsteigenden Gliedmaße exprimiert. Es ist jedoch möglich, dass diese Marker in schwer krankem Gewebe reduziert werden können. In diesen Situationen kann eine zusätzliche Antikörpervalidierung von pfadspezifischen Markern oder neuartigen Markern, die ihre Ausdrucksstufe nicht ändern, dieses Problem lösen.
LMD ist wahrscheinlich eine geeignete Methode, um in transkriptomischen Verhören anderer Organe zu verwenden. Die Auswahl und Optimierung von Antikörpern, die für eine schnelle Färbung wirken, ist unerlässlich. Ein Antikörper, der in einem regulären Färbeprotokoll arbeitet, funktioniert möglicherweise nicht unbedingt für das schnelle Färbeprotokoll, das wahrscheinlich Antikörper mit hoher Affinität erfordert. Ein primär konjugierter Antikörper minimiert die erforderlichen Schritte und kann Vorteile bieten. Die Konjugation eines Antikörpers gegen Fluorophore kann jedoch die Bindung verändern, und vor der Aufnahme dieser Reagenzien in das Protokoll müssen Pilotversuche durchgeführt werden.
Abschließend beschreiben wir eine Pipeline für fluoreszenzbasierte Lasermikrosektion, um bestimmte Bereiche und Strukturen in der menschlichen Niere zu isolieren, um eine transkriptomische Analyse zu ermöglichen. Dieser Ansatz bietet wichtige Vorteile und kann auf andere Gewebe ausgedehnt werden, um eine gewebebasierte molekulare Abfrage zu ermöglichen. Regionale Transkriptomik ergänzt andere transkriptomische Technologien, indem sie einen histopathologischen Anker zur Verfügung stellt, um Ausdruck zu verstehen, und dabei hilft, die Biologie und die Signatur von Gesundheit und Krankheit zu interpretieren. Diese Technologie passt natürlich in die Vision für den Aufbau eines transkriptomischen Atlas der Niere.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Allgemeines: Die Autoren danken den Forschern des Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) für ihre gnädige Unterstützung und Beratung.
Finanzierung: Unterstützung für diese Arbeit wurde vom NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.) bereitgestellt; NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Die in diesem Manuskript berichtete Forschung wurde vom National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), unter der Auszeichnungsnummer U2CDK114886 unterstützt.
Daten- und Materialverfügbarkeit: Die Daten werden im Gene Expression Omnibus (GEO - ausstehend) archiviert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
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