Summary
Мы описываем протокол лазерного микропереписьа подсегментов человеческой почки, включая гломерул, проксимальные трубочку, толстую восходящую конечность, сбор протока и интерстиция. Затем РНК изолируются из полученных отсеков, и секвенирование РНК осуществляется для определения изменений в транскрипцио-подписи в каждом подразиме.
Abstract
Анализ экспрессии генов тканей почек человека является важным инструментом для понимания гомеостаза и патофизиологии заболеваний. Необходимо увеличить разрешение и глубину этой технологии и расширить ее до уровня клеток в тканях. Хотя использование одноядерной и одноклеточной РНК-секвенирования получило широкое распространение, экспрессионные сигнатные знаки клеток, полученных в результате диссоциации тканей, не поддерживают пространственного контекста. Лазерная микроперепись (ЛМД) на основе специфических флуоресцентных маркеров позволит изоляции конкретных структур и клеточных групп, представляющих интерес с известной локализации, тем самым позволяя приобретение пространственно якорных транскриптомных подписей в ткани почек. Мы оптимизировали методологию LMD, руководствуясь быстрым пятном на основе флуоресценции, чтобы изолировать пять различных отсеков в почках человека и провести последующее секвенирование РНК из ценных образцов тканей почек человека. Мы также представляем параметры контроля качества, позволяющие оценить адекватность собранных образцов. Рабочий процесс, изложенный в этой рукописи, показывает осуществимость такого подхода к изоляции подкломентальных транскриптомных подписей с высокой достоверностью. Представленный здесь методологический подход может быть применен и к другим типам тканей с заменой соответствующих маркеров антител.
Introduction
Технологический прогресс в изучении образцов тканей улучшил понимание состояния здоровья и заболеваний в различных органах. Такие достижения подчеркивают, что патология может начаться в ограниченных регионах или в конкретных типах клеток, но имеют важные последствия для всего органа. Поэтому в нынешнюю эпоху персонализированной медицины важно понимать биологию как на клеточном, так и на региональном уровне, а не только глобально1. Это особенно верно в почках, которая состоит из различных специализированных клеток и структур, которые дифференцированно инициировать и / или реагировать на патологический стресс. Патогенез различных типов заболеваний почек человека до сих пор не очень хорошо изучен. Создание методологии для изучения изменений экспрессии генов в конкретных трубчатых сегментах, структурах или областях интерстиция в почках человека повысит способность выявить конкретные изменения региона, которые могли бы информировать о патогенеза болезни.
Образцы биопсии почек человека являются ограниченным и ценным ресурсом. Поэтому технологии, допрашивающие транскриптомику в тканях почек, должны быть оптимизированы для экономии тканей. Доступные методы изучения транскриптомики на клеточном и региональном уровне включают одноклеточное секвенирование РНК (scRNaseq), одноядерную RNaseq (snRNaseq), пространственную гибридизацию на месте и лазерное микродиссекцию (LMD). Последний хорошо подходит для точной изоляции регионов или структур, представляющих интерес в секциях тканей, для секвенирования ианализа РНК вниз по течению 2,3,4,5. LMD может быть принят, чтобы полагаться на идентификацию конкретных типов клеток или структур на основе проверенных маркеров с использованием флуоресценции на основе изображений во время вскрытия.
Уникальные особенности лазерной микроперепись помощь региональной транскриптомики включают в себя: 1) сохранение пространственного контекста клеток и структур, который дополняет одноклеточных технологий, где клетки идентифицируются по выражению, а не гисто логики; 2) технология информирует и информируется другими технологиями визуализации, потому что маркер антител определяет экспрессионные подписи; 3) способность определять структуры даже при изменении маркеров заболевания; 4) обнаружение низко выраженных транскриптов примерно в 20 000 генов; и 5) замечательная экономия тканей. Технология масштабируется для биопсии почек с толщиной менее 100 мкм ядра, необходимого для достаточного приобретения РНК и позволяет использовать архивные замороженные ткани, которые обычно доступны в крупных хранилищах или академическихцентрах 6.
В последующей работе мы подробно описываем региональную и объемную технологию транскриптомики, оптимизированную новым протоколом быстрого окрашивания флуоресценции для использования в почечной ткани человека. Этот подход улучшает классические исследования LMD, поскольку он обеспечивает отдельные данные выражения для интерстиций и нефронных подсектов, в отличие от агрегированного тубулоинтерстициального выражения. Включены меры по обеспечению качества и контролю, принятые для обеспечения строгости и воспроизводимости. Протокол позволяет визуализировать ячейки и области, представляющие интерес, что приводит к удовлетворительному приобретению РНК из этих изолированных районов, чтобы позволить секвенированию РНК ниже по течению.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование было одобрено для использования Советом по институциональному обзору (IRB) при Университете Индианы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот протокол с тканью нефрэктомии почек (до 2 см в размерах X и Y), сохраненных в соединении Оптимальная температура резки (OCT) и хранящихся при -80 градусов по Цельсию. Выполняем все работы таким образом, чтобы ограничивает загрязнение РНК, используйте чистые одноразовые перчатки и маску для лица. Обеспечь чистоту всех поверхностей. Оборудованием, для которого был оптимизирован этот протокол, является лазерная система микродиссекции с импульсным УФ-лазером.
1. Криозекция
- Разоблачить 1,2 мкм LMD PPS-мембраны (поли (p-фенилен сульфид) слайды к ультрафиолетовому свету (в ткани культуры ламинарного потока капот) в течение 30 минут, непосредственно перед криозированием. Храните слайды при комнатной температуре для оптимального соблюдения ткани.
- Охладить криостат до -20 градусов по Цельсию. Очистите рабочие поверхности и установите новый режущей лезвие.
- Поместите небольшую слайд-коробку (очищенную раствором обеззараживания поверхности RNase) внутри криостатической камеры для хранения слайдов со свежесрезанной тканью.
- Придерживайтесь образца в OCT к держателю ткани и дайте ему уравночные в течение нескольких минут, чтобы достичь температуры камеры и укрепить адгезию между блоком OCT и держателем. Помощь процессу с помощью теплового экстрактора.
- Вырежьте образец толщиной 12 мкм и прикрепите его к специализированному слайду LMD, используя слайд-адаптер. Каждый слайд содержит один раздел нефрэктомии на слайд или до двух секций биопсии почек на слайд. Храните слайды при -80 градусов по Цельсию с desiccant картриджа и внутри плотно закрытый полиэтиленовый пакет, чтобы предотвратить избыток влаги от накопления внутри слайд-бокс.
- Наклеьте этикетку на каждый слайд с идентификатором образца, датой и номером слайда.
- Используйте слайды с образцами в течение 10 дней с даты начала криозирования.
2. Лазерная микроперегибка
- Непосредственно перед окрашиванием, подготовить антитела Mix (Ab-Mix) в 10% BSA в RNase-бесплатно PBS, добавив следующее: 4 МКЛ FITC-фаллоидин, 1,5 Л DAPI, 2 л антитела Tamm-Horsfall Protein (THP) непосредственно спрягаются с Alexa Fluor 546, 3,3 л ингибитора RNase и 89,2 л 10% BSA в PBS (для достижения объема 100 Л).
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные антитела могут быть использованы вместо антител tHP. Например, 2 л антитела мегалина/LRP2, непосредственно спряженные с Alexa Fluor 568, могут быть использованы для обозначения проксимальной трубоубии. Ab-Mix содержит либо LRP2 или THP антитела (для визуализации либо проксимальных труб или толстых восходящих конечностей, соответственно). Другие антитела могут быть проверены в соответствии с потребностями пользователя. - Вымойте горку в ледяной (-20 градусов по Цельсию) 100% ацетон в течение 1 мин и переместить его в камеру влажности.
- Вымойте верхнюю часть слайда с помощью PBS без RNase в течение 30 с. Повторите.
- Вымойте верхнюю часть слайда с 10% BSA в RNase-бесплатно PBS для 30 с. Повторите.
- Применить Ab-Mix в течение 5 мин.
- Вымойте верхнюю часть слайда с 10% BSA в RNase-бесплатно PBS для 30 с. Повторите.
- Воздух высушит слайд в течение 5 минут и загрузите его на платформу лазерной микроперемешки резки.
- Установите трубки сбора (автоматические микроцентрифугные трубки объемом 0,5 мл), подходящие для работы ПЦР, содержащие 50 МКЛ буфера экстракции из изоляционные комплекты РНК.
- Продолжить с LMD. Завершите каждую сессию LMD не более чем за 2 часа.
- Сбор изображений иммунофлуоресценции до и после LMD с помощью микроскопьной камеры для проверки вскрытия на вариативность межоператора, а также архивных целей, обучения и оценки качества выполненного протокола. Для того, чтобы получить 0,5 - 1 нг РНК, требуется не менее 500 000мкм 2 области. Это часто требует использования секций толщиной до 8 х12 мкм для получения достаточного количества материала для всех подсегментов, представляющих интерес.
- Определите области, представляющие интерес, окрашивая, морфологии и местоположения и акциз их с помощью лазерной энергии более 40.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вот критерии вскрытия. Проксимальная трубоубий определяется маркировкой FITC-Phalloidin и LRP2. Толстая восходящая конечность определяется маркировкой THP. Сбор протока определяется ядерной морфологией (DAPI) и отсутствием других окрашивания. Гломерул определяется FITC-фаллоидин и морфология. Интерститиум определяется как область между окрашенными трубами.
- Получить объемную поперечную подпись выражения, прикрепите два 12 мкм секций к слайду LMD и рассекая все разделы в буфер извлечения.
- По завершении процесса LMD, закрыть сбор микроцентрифуг трубки и Флик его энергично, чтобы убедиться, что содержание переехал из крышки в нижней части трубки
- Центрифуга труб на 3000 х г на 30 с.
- Инкубировать трубки в 42 градусов по Цельсию водяной бане в течение 30 мин.
- Центрифуга труб при 3000 х г в течение 2 мин.
- Перенесите супернатант в новую трубку 0,5 мл и храните ее в -80 градусов по Цельсию.
3. Изоляция РНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола изоляции РНК мы адаптировали протокол из коммерческого комплекта изоляции РНК. Протокол производителя был изменен в соответствии с требованиями контроля качества, установленными для проекта.
- Добавьте 250 МКЛ кондиционированного буфера (CB) к каждому столбецу очистки РНК (PC) и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Центрифуга всех ПК в течение 1 мин при 16000 х г.
- Добавьте 50 л 70% этанола (предусмотрено в комплекте) в трубки с образцами тканей. Смешайте образцы хорошо, трубя вверх и вниз. Не вихрь. Не центрифуга.
- Перенесите смесь в условные ПК и центрифугу на 2 мин при 100 х г (для связывания РНК), быстро следуйте с центрифугой по 30 с при 16 000 х г (для удаления потока через). Повторите этот шаг, если для любого под сегмента доступно более 1 трубки с образцами тканей.
- Добавьте 100 МКЛ из Wash Buffer 1 (WB1) в ПК и центрифугу в течение 1 минуты при 8000 х г.
- Подготовь 40 МКЛ DNase на каждый образец (Добавьте 5 МКЛ DNase к 35 йл буфера RDD). Затем добавьте 40 МКЛ смеси непосредственно на мембрану ПК и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Добавьте 40 МКЛ WB1 на мембрану ПК и центрифугу на 15 с при 8000 х г.
- Добавьте 100 мкл wash Buffer 2 (WB2) на мембрану ПК и центрифугу в течение 1 мин при 8000 х г.
- Добавить 100 МКЛ WB2 на мембрану ПК, центрифугу в течение 2 мин при 16000 х г,сразу же следовать центрифугации в течение 1 мин при 16000 х г.
- Перенесите компьютер на новую трубку 0,5 мл.
- Добавьте 12 мкл Elution Buffer (EB) на мембрану и инкубировать в течение 7 минут при комнатной температуре. Таким образом, конечный объем всех образцов вскрытых тканей составляет 12 мкл на подсектор.
- Центрифуга образцов в течение 1 мин при 1000 х г, а затем в течение 2 мин при 16000 х г.
- Перенесите 2 МКЛ в свежую трубку для анализа биоанализа (для предотвращения событий замораживания-оттепели).
- Храните все трубки в -80 градусов по Цельсию до готовности к дальнейшей обработке.
4. Секвенирование РНК
- Оцените каждый образец, предназначенный для секвенирования, на качество использования коммерческого биоанализа и чипа, предназначенного для измерения небольших количеств РНК.
- Требуются следующие параметры контроля качества (КК) до подготовки и секвенирования библиотеки: количество РНК, более 4 нг для навалом и более 0,5 - 1 нг для каждого подраз сегмента; Процент транскриптов длиннее 200 нуклеотидов (DV200) должен быть больше, чем 25% для образцов LMD (оптимальный nogt; 75%).
- Провести библиотечную подготовку с коммерческим комплектом подготовки библиотеки cDNA, предназначенным для небольших количеств деградированной РНК. Для коммерческого комплекта, перечисленного в дополнении, мы предлагаем использовать вариант 2, который требует минимум DV200 25% и без фрагментации. Некоторые технологии секвенирования могут потребовать более высоких минимальных пороговых значений DV200, таких как 30%7.
- Добавьте адаптеры и индексы cDNA.
- Очистить библиотеки RNAseq с помощью технологии магнитного бисера.
- Истощайте рибосомный cDNA с помощью коммерческого комплекта удаления rRNA до шага усиления библиотеки RNAseq.
- Очистить окончательную библиотеку RNAseq с использованием технологии магнитного бисера с концентрацией библиотеки 2 нг/йл кДНК.
- Проведение РНК-секвенирования 75 bp в паре с коммерческой системой секвенирования с 30 миллионами считывания/образца для навалом и 100 миллионами считывания/образца для подкогментальных секций.
- Используйте справочную РНК (25 мкг) с каждым запуском секвенирования, чтобы обеспечить контроль эффекта партии. Начальная концентрация нашей справочной РНК составляет 1 мкг/л, в то время как окончательная концентрация, используемая в секвенировании, составляет 25 нг/л. Вы запустите эталонную РНК в качестве отдельного образца во время подготовки библиотеки и каждый раз запускайтесь со всеми образцами ЛМД.
- Выполните анализ данных с использованием приложения Fast'C для оценки качества секвенирования, межгенных и митохондриальных считывания и определения считывания, приписываемого гену.
- Используйте интегративную геномику Viewer (IGV) для выравнивания и edgeR/rbamtools для измерения экспрессии транскрипта.
- Удалите образцы с менее чем 100 000 считых. Квантиль нормализует необработанные считывания в наборе данных после фильтрации низко выраженных генов на определенном пользователем пороге.
- Количественная оценка выражения как соотношения под сегмента интереса к среднему показателю по всем другим подсеготов и преобразованию журнала2. Относительную экспрессию одного и того же гена можно сравнить по подсеготов и образцам; однако не идеально сравнивать относительную экспрессию между двумя различными генами из-за потенциальных различий в деградации генов и видов РНК.
- Провести анализ обогащения для сравнения экспрессии генов для набора производителей, характерных для каждого под сегмента нефрона, в то время как эталонные образцы РНК сравниваются между партиями. Эффект партии в пределах 1 стандартного отклонения среднего выражения с значением R Дополнительная нормализация необходима для более высокой оценки эффекта партии. Любой запуск, отклоняемый от эффекта принятой партии, может быть помечен. Для каждого секвенирования пробег должен быть больше, чем 90% для каждого запуска последовательности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Образцы
Мы представляем данные из девяти эталонных нефрэктомий (3 образца, полученных в Университете Индианы и 6 образцов, полученных в рамках проекта почечной точной медицины), используя протокол быстрого окрашивания флуоресценции для изоляции сегментов нефрона почек и интерстициальных областей. Разделы, используемые в этом процессе были получены от умерших доноров почек или незатронутых опухолевых нефрэктомий. Эти образцы не имеют патологических доказательств заболевания, как визуализированы в H и E пятно взято из смежных разделов (Рисунок 1A).
Лазерный контроль качества микродиссекции
Идентификация трубчатых подсегментов в почках осуществляется путем окрашивания антител уникальными трубчатыми маркерами, а также морфологией и структурными ориентирами. Рисунок 1B-C иллюстрирует окрашивание и микроперепись трубчатых подсегментов от репрезентативной нефрэктомии. Это достигается путем окрашивания с DAPI (ядра), FITC-фаллоидин (F-актин), и дополнительные антитела по мере необходимости. Используемое флуоресцентное окрашивание позволяет визуализировать почечные под сегменты с высокой степенью уверенности, далее руководствуясь морфологическими особенностями, а также пространственным позиционированием изображенныхструктур (рисунок 2). Например, гломерули выявлены фаллоидин и DAPI окрашивания с очень отличительной морфологии. Аналогичным образом, сбор воздуховодов визуализируется с использованием ядерной морфологии и отсутствия других пятен. Мегалин/ LRP2 антитела (непосредственно конъюгированные с Alexa Fluor 568) используется здесь для выявления проксимальных труб. Толстая восходящая конечность визуализируется с помощью антитела белка Tamm-Horsfall (THP) (непосредственно спряченного с Alexa Fluor 546). В отличие от интерстиция выкапыется вдоль внешней мембраны труб и включает в себя стромальные и иммунные клетки, а также небольшие капилляры.
Чтобы получить достаточную РНК 0,5 - 1 нг на подсектор, мы стремимся вскрыть минимальную площадь в 500 000мкм 2. Как правило, для получения достаточного количества материала для всех подсегментов требуется от пяти до восьми секций толщиной 12 мкм (1 раздел на слайд). Рассечение любого слайда завершается менее чем за 2 часа, чтобы сохранить качество РНК, что позволяет сократить 4 сегмента на слайд. Приобретенная ткань из одного и того же под сегмента объединяются из нескольких слайдов для секвенирования вниз по течению. Для проверки коллекции подсекторов, представляющих интерес с помощью прикрепленной камеры, получено изображение иммунофлуоресценции до и после LMD. На рисунке 3 разграничены показатели успешности области вскрытия и минимального ввода РНК. В этом репрезентативном наборе данных показатель успешности ввода минимальной площади составил 90%. Если в ткани источника имеется небольшое количество компакт-диска или интерстиция, существует вероятность того, что площадь вскрытия будет ниже 500 000мкм 2 для этих сегментов после использования 8 слайдов. Дополнительные слайды могут быть сокращены в зависимости от потребностей пользователя; однако, как видно на рисунке 3, если площадь близка к 500000мкм 2, желаемые гены обнаружены кол имеет высокий показатель успеха (100%) и общий показатель успешности чтения составляет 98,6% (1 образец упал ниже метрики КК). Таким образом, было достаточно ткани для достижения достаточного количества генов и чтения рассчитывает без использования дополнительных тканей.
Контроль качества секвенирования входных данных
Выбранная платформа подготовки и секвенирования коммерческой библиотеки позволяет воспроизводить измерения экспрессии стенограммы, даже при низком количестве сильно деградированной РНК. Минимальный ввод РНК составляет 500 пг, а минимальный DV200 (доля считывает больше, чем 200 нуклеотидов в длину) выше 25%. Минимальная РИН не существует. Секвенирование с 100 миллионов считывания на образец, мы стремимся насытить доступных читает для того, чтобы обнаружить низко выраженные стенограммы. Общее количество считых данных может быть скорректировано в соответствии с потребностями пользователя.
Это просто, чтобы получить достаточное количество РНК из двух 12 мкм объемных поперечных секций, поэтому мы стремимся получить более высокий минимальный общий объем мРНК 4 нг для массового секвенирования. Как учерчено в протоколе, для каждого подраз сегмента требуется 0,5-1 нг в общей сложности РНК. Оптимальная концентрация РНК после изоляции превышает 50 пг/ДЛ. РНК суммы ниже, чем это может привести к снижению гена обнаружения и чтения рассчитывает наблюдается. Большинство образцов дают 20 000 обнаруженных генов и 1 миллион считых. DV200, более 25% для всех образцов требуется производителю (75% считается оптимальным). Хотя RIN измеряется, процесс лазерного микродиссекции уменьшает RIN и РНК секвенирования платформ были оптимизированы для фрагментированной РНК. Количество и качество РНК оцениваются биоанализом до секвенирования. Быстрое пятно уменьшает количество времени, в течение которого ткань подвергается воздействию комнатной температуры и неблагоприятных условий, тем самым минимизируя, насколько это возможно, деградацию РНК. Метрика контроля качества DV200 для секвенирования ввода также находится на рисунке 3.
Секвенирование контроля качества вывода
Обработка данных ниже по течению использует квантилинную нормализацию для сравнения выборок в разных партиях. В качестве пороговых значений используется минимальное число обнаружения генов в 10 000 и минимальное количество считывок в 1 миллион для включения образцов в квантильной нормализации. Образцы с более низкими уровнями обнаружения генов или считых считых данных исключаются из количественной нормализации и последующего сравнительного анализа. Только 1 из 98 вскрытых подсегментальных выборок не соответствовал этим пороговым значениям(рисунок 3). В 30 фунтов стерлингов (доля читает отображаются на 99,9% доверия) было больше, чем 93% для каждого секвенирования эксперимента (Рисунок 4).
Мы секвенировать человеческую справочную РНК (25 нг) с каждым запуском секвенирования, чтобы обеспечить коррекцию для эффекта партии, если такая коррекция желана или необходима. Измеренный эффект партии должен быть в пределах 1 стандартного отклонения среднего выражения со значением R Если эффект партии выше, для этого секвенирования требуется дополнительная нормализация. Здесь эффект партии был ниже 3% в четырех экспериментах по секвенированию, изображенных на рисунке 4. Таким образом, эффект партии обычно решается с количественной нормализации для всех секвенирования работает, агностик для ссылки РНК. Коррекция, основанная на справочной РНК, пока не осуществлена, но эта информация имеется и может быть использована в зависимости от целей конкретного анализа.
Строгость и воспроизводимость
Важно продемонстрировать строгость в определении типов клеток и структур. После лазерного микроперегибания мы тестируем на обогащение известных маркеров в гломерули, PT, TAL, CD и интерстициуме по сравнению с другимиотсеками (таблица 1). Анализ обогащения используется для сравнения экспрессии генов для заранее определенных ожидаемых маркеров. Экспрессия генов передаетсякак коэффициенты журнала 2 выражения под сегмента интереса по сравнению со средними другими подразимами. Эта метрика выражения была выбрана для образцов человека, поскольку она снижает межим индивидуальную изменчивость, облегчая сравнение типов клеток и отсеков между образцами. Тем не менее, необработанные чтения и количественные нормализованные чтения также можно сравнить в альтернативных анализах. Figure 5 иллюстрирует примеры иммуногистохимического окрашивания этих 5 выбранных известных маркеров, представленных в Атласе белков человека.
Таким образом, мы представляем ортогональные источники данных, которые придают уверенность в правильном подсемейке собирается: 1) изображения, которые включают в себя антитела пятно и морфология сегмента / отсека, и 2) выход выражения показаны известные маркеры выражаются в соответствующем подсегменте.
Региональный транскриптомный анализ генов, выраженных в каждом подсечении, позволяет проводить новую и недооцененную идентификацию маркеров. Рисунок 6 иллюстрирует пример одного маркера для каждого подсегмента, идентифицированного с помощью региональной транскриптомики LMD, который также дал специфическое иммуногистохимическое окрашивание соответствующего подсегмента нефрона.
Чтобы продемонстрировать воспроизводимость и понять влияние изменчивости оператора, мы провели эксперимент по образцу опухолевой нефрэктомии. Этот образец был glomeruli, PT, и TAL повторно рассечены для повышения доверия к результатам секвенирования РНК и в настоящее время служит полезным техническим репликации. Месяцы друг от друга, этот образец прошел второй экземпляр криозирования, окрашивания антител, рассечения LMD, извлечения РНК, библиотеки подготовки, и РНКсеквенирования ( Рисунок 7) из glomeruli, PT и TAL отсеков. Сравнивались две версии (v1 и v2). Гломерулярные, PT и TAL отсеки были сильно коррелированы с значениями r 2,0,95, подобно минимальному эффекту партии нашей эталонной РНК.
Рисунок 1: Репрезентативные изображения почечной ткани.
(A) H и E пятно человеческой ткани эталонной почки. (B) Иммунофторесцентное изображение человеческой ткани эталонной почки с окрашенными толстыми восходящими сегментами конечностей до LMD и (C) сразу после вскрытия одной толстой восходящей структуры конечностей. Масштабная планка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения эталонных почечных подсемечений, визуализированы в 20 раз с использованием специфического иммунофлюоресцентного окрашивания.
(A)a Glomerulus, (B) Проксимальная трубчатая труба, (C) Толстая восходящаяконечность,( D ) Сбор протока, (E) Interstitium. (0,05, р-л; 0,01, р-л; 0,01. л; 0,001 ANOVA). Масштабная планка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Рисунок 3: Метрики контроля качества в сегментной транскриптомике.
(A) Более 90% экспериментальных образцов соответствовали порогу ввода области вскрытия в 500 000мкм 2. (B ) Все образцы, за исключением одного, соответствовали желаемому входу РНК, по крайней мере, 500пг. (C) 100% пилотных образцов соответствовали минимальному порогу производителя DV200 в 25% и (D) 100% образцов соответствовали нашему минимальному порогу в 10 000 обнаруженных генов. (E)Все образцы, за исключением одного, достигли минимального общего количества считывок в 1 миллион. Как и ожидалось, более низкие области вскрытия коррелируют с пониженной концентрацией РНК, более низким числом генов и более низким числом считых. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Контроль качества секвенирования.
(A)Секвенирование работает с использованием эталонной РНК (не количественно нормализованной) сравниваются со средним выражением всех трасс. Существует сильная корреляция с минимальным эффектом партии (все R-gt;0.969). (B) Более 93% наших читает во всех работает были отображены с высокой уверенностью (No 30 или 99,9%). Обратите внимание, что значения в 30 евро предоставляются на основе полосы движения с несколькими полосами движения за пробег. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Примеры иммуногистохимического окрашивания для определения выбранных известных маркеров.
Изображения изображены для (A) NPHS1 (B) LRP2 (C) UMOD (D) SLC4A9 (E) COL6A2. Изображения иммуногистохимии получены из Атласа белков человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Примеры иммуногистохимического окрашивания для иллюстрации экспрессии нетрадиционных генов маркеров в соответствующих подсегментах.
Изображенные стенограммы с соответствующей иммуногистохимией включают в себя (A) SHANK3 в glomerulus, (B) ACSM2B в проксимальной трубообразной трубе, (C) RAP1GAP в толстой восходящей конечности, и (D) L1CAM в сборе протока. Изображения иммуногистохимии получены из Атласа белков человека. (0.0001 от ANOVA) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Корреляция между двумя различными вскрытиями с отдельным секвенированием одного и того же образца.
Высокая степень корреляции наблюдалась между различными вскрытиями в (A) glomerulus, ( B )проксимальнойтрубоубии, и (C) толстый восходящий цикл Henle. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Маркер | Сегмента | Изменение сложите | p-Value |
| NPHS1 | Гломерулус | 32.64 | 1.97E-08 |
| LRP2 | Проксимальная тубула | 4.69 | 1.21E-05 |
| Umod | Толстая восходящая конечность | 24.92 | 2.00E-07 |
| SLC4A9 | Сбор воздуховодов | 4.09 | 0.000133 |
| COL6A2 | Интерститиум | 7.19 | 1.47E-06 |
Таблица 1: Средние значения представительов по каждому подразиму интересов между тремя образцами нефрэктомии по сравнению с остальными подсегментами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Транскриптомика на основе LMD является полезной технологией, которая закрепляет экспрессию генов в определенных областях ткани. Основа этой технологии и ее потенциальное применение в почках было описано ранее8. Однако оптимизация, модернизация и оптимизация вскрытия на основе флуоресценции, специально направленного на высокотокетное вскрытие рнк для секвенирования РНК ниже по течению, менее распространены. Поскольку эта методология пространственно обоснована в тканях, она имеет потенциал, чтобы выявить новые или недооцененные маркеры в структурах тканей, особенно в состояниях болезней. В самом деле, многие общие маркеры клеток могут меняться с болезнью, следовательно, опираясь только на маркеры экспрессии РНК клеток для идентификации решения без пространственного контекста может быть сложной задачей в состояниях болезни. Таким образом, пространственно закрепленный подход LMD, вероятно, дополнит и обеспечит платформу наземной правды для многих других транскрипционных технологий, таких как одноклеточное и одноядерное секвенирование РНК, которые определяют клетки преимущественно по их профилюэкспрессии генов 9. Кроме того, глубина экспрессии генов, предоставляемая LMD (до 20 000 генов на образец), является еще одним преимуществом и важным местом для перекрестного соединения данных из нескольких источников и учета изменений в экспрессии генов, которые не могут быть очевидными без определенной глубины. Еще одной позитивной особенностью этой технологии является рассмотрение экономики тканей, при которой толщина замороженного блока может быть достаточной для всего набора данных LMD. Это позволяет использовать остатки ткани для других аналитических целей.
LMD имеет ограничения. Одним из ожидаемых ограничений лазерного микродиссекции транскрипционные данные приобретения является его более низкая пропускная способность природы. Будущая автоматизация может оказаться важной в улучшениимасштабируемости 10,11. Два дополнительных ограничения транскриптомики LMD включают зависимость от опыта и влияние качества тканей на результаты данных. Непреднамеренный сбор ячеек и материалов вне сегмента интереса является известным ограничением, поскольку собираются обогащенные отсеки клеток, а не одна клетка. LMD опирается на знания пользователя в понимании структуры тканей и, следовательно, требует определенного опыта домена. Таким образом, люди должны быть обучены для выявления соответствующих регионов в почках с и без окрашивания антител. Наконец, влияние качества тканей может повлиять на качество данных ниже по течению. Протокол LMD приводит к деградации тканей, поэтому качество исходного материала имеет важное значение. Однако этот протокол был оптимизирован на архивной биопсии с несколькими образцами только умеренного качества. Включенные данные показывают, что выбранная транскрипциономическая платформа является надежной.
Следует отметить, что используемый изоляционный комплект и методология секвенирования РНК, расположенные ниже по течению, должны быть адаптированы специально для ожидаемой степени деградации РНК. Описанный здесь протокол окрашивания был принят, поскольку он наиболее благоприятно влияет на минимизацию такого эффекта. В этом протоколе, ткань была встроена в OCT для того, чтобы облегчить будущие сравнения по другим транскрипционным технологиям. Тем не менее, формалин фиксированной ткани может быть альтернативой.
Данные, представленные в этой рукописи, свидетельствуют о преимуществах региональной транскриптомики, включая оптимизацию, показатели контроля качества и технологические результаты. Для любой методологии важное значение имеет установление строгих до аналитических и аналитических критериев контроля качества, а также установление убедительных доказательств строгости и воспроизводимости. Будущие применения региональной транскриптомики могут быть широко сгруппированы в биологические приложения, технические достижения и аналитический прогресс. Будущие биологические применения могут быть направлены на допрос тканей из невредимых, раненых и регенерирующих труб, а также трубок в непосредственной близости от воспаления. Эти отсеки могут быть определены в той же биопсии как традиционными морфологическими маркерами, так и антителами для "пути" конкретных маркеров. Два маркера антитела, проверенные для использования в этой технологии, мегалин и уромодулин, высоко выражены в проксимальной трубоубище и толстой восходящей конечности соответственно. Тем не менее, вполне возможно, что эти маркеры могут быть уменьшены в тяжелобольной ткани. В таких ситуациях, дополнительные антитела проверки пути конкретных маркеров или новых маркеров, которые не меняют их уровень выражения может преодолеть эту проблему.
ЛМД, вероятно, является подходящим методом для использования в транскрипционом допросе других органов. Выбор и оптимизация антител, которые работают для быстрого окрашивания будет необходимо. Антитела, которые работают в регулярном протоколе окрашивания не обязательно может работать для быстрого окрашивания протокола, который, вероятно, требует высокого сродства антител. Первичное конъюгируемое антитело сведет к минимуму необходимые шаги и может дать преимущества. Тем не менее, спряжение антитела к флюорофорам может изменить привязку, и пилотные эксперименты должны быть выполнены до включения этих реагентов в протокол.
В заключение, мы описываем трубопровод для флуоресценции на основе лазерного микродиссеции, чтобы изолировать конкретные области и структуры в почках человека, чтобы транскриптомный анализ. Этот подход предлагает важные преимущества и может быть распространен на другие ткани, чтобы обеспечить ткани на основе молекулярного допроса. Региональная транскриптомика дополняет другие транскрипционные технологии, предоставляя гистопатологический якорь для понимания выражения, помогая в интерпретации биологии и подписи здоровья и болезней. Эта технология естественным образом вписывается в видение построения транскриптомного атласа почек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Общие: Авторы хотели бы поблагодарить исследователей проекта точной медицины почек (www.kpmp.org) за их любезное поддержку и советы.
Финансирование: Поддержку этой работе оказал NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Исследования, о них сообщается в этой рукописи, были поддержаны Национальным институтом диабета и заболеваний пищеварения и заболеваний почек (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP) (www.kpmp.org), под номером U2CDK114886.
Доступность данных и материалов: Данные архивируются в Omnibus экспрессии генов (GEO )
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
- Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance. , Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016).
- Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
- Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).
