Summary
وصف هنا هو وسيلة فعالة على كيفية إنتاج ارتفاع الأسهم تتر الفيروسية من فيروس التهاب الكبد E (HEV) لتصيب خلايا الورم الكبدي بكفاءة. مع طريقة عرض، سواء غير مغلفة، وكذلك الجسيمات الفيروسية المغلفة يمكن حصادها واستخدامها في تلقيح خطوط الخلايا المختلفة.
Abstract
فيروس التهاب الكبد E هو السبب الرئيسي لتليف الكبد وفشل الكبد مع زيادة انتشاره في جميع أنحاء العالم. وينتقل فيروس الحمض النووي الريبي الوحيد في الغالب عن طريق نقل الدم، والظروف الصحية غير الملائمة، والمنتجات الغذائية الملوثة. حتى الآن من خارج التسمية دواء ريبافيرين (RBV) هو العلاج المفضل لكثير من المرضى. ومع ذلك، لا يزال هناك علاج محدد لمعالجات الـ HEV التي لا يزال يتعين تحديدها. حتى الآن، وقد أعاقت بشدة المعرفة حول دورة حياة HEV و pathogenesis بسبب عدم وجود نظام فعال لثقافة الخلايا HEV. نظام قوي لثقافة الخلية ضروري لدراسة دورة الحياة الفيروسية التي تشمل أيضا الإمراض الفيروسية. مع الأسلوب الموصوف هنا يمكن للمرء أن ينتج ال titers الفيروسية تصل إلى 3 × 106 وحدة التركيز تشكيل / مل (FFU / مل) من غير مغلفة HEV وما يصل إلى 5 × 104 FFU / مل من HEV مغلفة. باستخدام هذه الجسيمات، فمن الممكن أن تصيب مجموعة متنوعة من الخلايا من أصول متنوعة بما في ذلك الخلايا الأولية والإنسان، فضلا عن خطوط الخلايا الحيوانية. إنتاج الجسيمات HEV المعدية من البلازميدات يشكل مصدرا لا نهائي، مما يجعل هذا البروتوكول فعالة للغاية.
Introduction
التهاب الكبد E هو مرض أقل من الواقع إلى حد ما مع تزايد انتشاره في جميع أنحاء العالم. حوالي 20 مليون إصابة تؤدي إلى أكثر من 70،000 حالة وفاة سنويا1. تم إعادة تعيين العامل الكامن، فيروس التهاب الكبد E (HEV)، مؤخرًا، وهو الآن مصنف داخل Hepeviridae العائلية بما في ذلك فيروس جينيرا أورثوبي وفيروس بيستشيهيبي. يتم تصنيف HEV من أصول مختلفة ضمن الأنواع Orthohepevirus A-D بما في ذلك عزل عن البشر والخنازير والأرانب والجرذان والطيور والثدييات الأخرى2. في الوقت الحاضر، تم تحديد ثمانية أنواع جينية مختلفة (GT) من فيروس الحمض النووي الريبي الإيجابي الموجه، الذي تقطعت به السبل واحد2. وعلى الرغم من اختلافها في هوية تسلسلها وطرق نقلها وتوزيعها الجغرافي، إلا أن هيكلها الجيني يحافظ عليه بدرجة عالية. أكثر تحديدا، 7.2 كيلو بايت 10000 1000 1000 1000 1000 1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 بينما ORF1 ترميز جميع الإنزيمات اللازمة للنسخ المتماثل الناجح داخل الخلية المضيفة، ORF2 ترميز البروتين capsid، والبروتين ORF3 تعمل كقناة أيون وظيفية مطلوبة للتجميع وإطلاق الجزيئات المعدية3. مرة واحدة أطلقت في التجويف القاعدية أو apical HEV موجود في كل من, شبه مظلومة والأنواع غير مغلفة / عارية اعتمادا على ما إذا كان الفيروس ينشأ من الدم أو البراز, على التوالي4,5.
في حين أن GT1 و GT2 توجدان بشكل رئيسي في البلدان النامية تصيب البشرفقط 6 عبر الطريق الفموي البرازي ، فإن GT3 و GT4 و GT7 تحدث بشكل رئيسي في البلدان المتقدمة1،7 مع مجموعة متنوعة من الأنواع التي تخدم كمكامن ، على سبيل المثال، الخنازير8، الجرذ9، الدجاج10،11، الغزلان12، النمس 13 ، الخفافيش14، الأرانب15،16، الخنزير البري17 والعديد من أكثر7،18،19، تقديم أدلة على zoonosis7،1320،21،22. بالإضافة إلى الظروف الصحية غير كافية23 والمنتجات الغذائية الملوثة12,24,25,26, انتقال عن طريق نقل الدم وزرع الأعضاء هو أيضا ممكن27,28. HEV هو سبب شائع لتليف الكبد وفشل الكبد29 خاصة في المرضى الذين يعانون من أمراض الكبد الموجودة من قبل ، والأفراد المناعيين (النمط الجيني 3 و 4 و 7) والنساء الحوامل (النمط الجيني 1). ملاحظة، وهناك أيضا مظاهر خارج الكبد مثل مرض الدم30،31،32، الاضطرابات العصبية33 والإصابات الكلوية34.
حتى الآن, خارج التسمية المخدرات ريبافيرين (RBV) هو العلاج المفضل بالنسبة للعديد من المرضى المصابين35,36. ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن حالات فشل في العلاج وضعف النتائج السريرية على المدى الطويل. وقد تم ربط فشل العلاج إلى الطفرات الفيروسية وزيادة التجانس الفيروسي في المرضى المصابين بشكل مزمن37,38,39. على العكس من ذلك، لم تكن دراسة متعددة المراكز الأوروبية بأثر رجعي الأخيرة قادرة على ربط طفرات البوليميراز بفشل العلاج RBV40. في الملاحظات السريرية والتجارب في المختبر, إنترفيرون41,,42,,43, sofosbuvir44,45, أملاح الزنك46 و silvestrol47,,48 كما أظهرت آثار مضادة للفيروسات. ومع ذلك، لا يزال هناك علاج محدد لـ HEV لا يزال يتعين العثور عليه، ويعيقه نقص المعرفة حول دورة حياة HEV والعوامل المسببة للمرض. ولذلك، هناك حاجة ماسة إلى نظام قوي لثقافة الخلايا للدراسات الفيروسية وتطوير أدوية جديدة مضادة للفيروسات49.
لسوء الحظ، مثل فيروسات التهاب الكبد الأخرى، من الصعب نشر HEV في خطوط الخلايا التقليدية وعادة ما يتقدم ببطء شديد مما يؤدي إلى انخفاض الأحمال الفيروسية. ومع ذلك، كانت بعض المجموعات قادرة على زيادة الأحمال الفيروسية من خلال توليد من خلية خط subclones50 أو تعديل وسائل الاعلام ملاحق51. في الآونة الأخيرة جيل استنساخ cDNA52 والتكيف مع عزل المريض الابتدائي عن طريق passaging53،54 مزيد من تحسين انتشار HEV في خلية ثقافة55. في هذا البروتوكول، استخدمنا جينوم ثقافة الخلية تكييف Kernow-C1 سلالة (يشار إليها باسم p6_WT)54 وسلالة متحولة إيواء طفرة تعزيز النسخ المتماثل (يشار إليها باسم p6_G1634R)37. Kernow-C1 هو السلالة الأكثر استخداما في ثقافة الخلية HEV وقادرة على إنتاج الأحمال الفيروسية العالية. من خلال تقييم أعداد نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسي ، يمكن رصد النسخ المتماثل HEV في المختبر. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات لا تسمح بتقييم عدد الجسيمات المعدية التي يجري إنتاجها. لذلك، أنشأنا تلطيخ مناعيا لتحديد وحدات تشكيل التركيز (FFU / مل).
يمكن استخدام الطريقة56 الموصوفة هنا لإنتاج جزيئات فيروسية معدية كاملة الطول قادرة على إصابة مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا من أصول متنوعة بما في ذلك الخلايا الأولية وخطوط خلايا الثدييات. هذا هو شرط أساسي لفك الجوانب الهامة من العدوى HEV وtropism. ليست هناك حاجة لللقح مع عزل المريض عادة محدودة. إنتاج الجسيمات HEV المعدية من البلازميدات يشكل مصدرا لا حصر له، مما يجعل هذا البروتوكول فعالة بالمقارنة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا النظام لعلم الوراثة العكسية تمكين دراسة في تحوي تغير الجينوم المحدد وتأثيرها على تكرار HEV واللياقة البدنية. هذه التقنية تتغلب على العديد من القيود ، ويمكن أن المسار الطريق لتطوير المخدرات ، والدراسات المطفرة وتقييم التفاعلات استقبال الفيروس مثل العوامل المقيدة أو الدخول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة التجارب تحت شرط BSL-2. يجب أن تشطف جميع المواد التي تحصل على اتصال مع فيروس التهاب الكبد E RNA أو الفيروس المعدي بشكل صحيح مع 4٪ كوهرسولين FF من حاوية النفايات داخل غطاء محرك السيارة قبل التخلص منها.
1- إعداد بلاسميد
- تلقيح 200 مل LB المتوسطة التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين مع تحويل Escherichia القولونية JM109 دمج ترميز بلازميد لكامل طول HEV gt3 Kernow-C1p6 التسلسل (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54 أو pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37). احتضان لمدة 16 ساعة في 37 درجة مئوية تحت الهياج الدائم (170 دورة في الدقيقة).
ملاحظة: تم إجراء العزل plasmid باستخدام عدة استخراج plasmid (انظر جدول المواد). - بعد بروتوكول المصنوعات، تدور أسفل 200 مل من ثقافة بين عشية وضحاها في 6000 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة والتخلص من افر. يمكن تجميد الكريه البكتيرية وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- Resuspend بيليه البكتيرية في 4 مل من عازلة Resuspension عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مع ماصات المصلية 10 مل ورجل ماصة. بالإضافة إلى ذلك، دوامة صارمة.
- إضافة 4 مل من العازلة Lysis قبل الدفء (30-40 درجة مئوية). عكس بلطف لعدة مرات واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
- إضافة 4.8 مل من العازلة تحييد، عكس بلطف وتأكد من أن يتم تحييد lysate كميا (انظر وصف الشركة المصنعة). ثم الطرد المركزي في 11000 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- ضع قطعة مول 2 سم × 2 سم داخل طرف 1 مل غير مرشح ، وتحميل resuspended ، lysed وتحييد في 10 مل الماصات المصلية ، إضافة 1 مل تلميح مع مول إلى طرف من ماصة المصلية وتصفية ارجح في أنبوب جديد 50 مل.
ملاحظة: يمكن تخزين سوبرنات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 30 دقيقة إذا لزم الأمر. - في عدة خطوات تطبيق 750 ميكرولتر من عظمى تمت تصفيتها على ما مجموعه 4 أعمدة التصفية (المقدمة في مجموعة) والطرد المركزي في 11000 x ز لمدة 30 s. تجاهل تدفق من خلال وتكرار هذا التسلسل حتى يتم تطبيق جميع supernatant على أعمدة التصفية.
- غسل كل عمود فلتر مرتين مع 500 ميكرولتر من ما قبل الدفء (50 درجة مئوية) غسل العازلة AW في 11000 س ز لمدة 30 s والتخلص من تدفق من خلال بعد ذلك.
- غسل كل عمود تصفية مع 600 ميكرولتر من غسيل العازلة A4 عن طريق الطرد المركزي في 11000 x ز لمدة 30 s. تجاهل تدفق من خلال وتجفيف أعمدة التصفية عن طريق الطرد المركزي في 11000 x ز لمدة 2 دقيقة.
- Elute الحمض النووي plasmid من كل عمود تصفية عن طريق نقل 60 ميكرولتر من عازلة elution إلى وسط أعمدة التصفية. احتضان لمدة 1 دقيقة في RT والطرد المركزي في 11،000 س ز لمدة 1 دقيقة.
- الجمع بين الذرات وقياس تركيز الحمض النووي البلازميد المستخرج باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
2. الخطية وتنقية الحمض النووي
الشكل 1: الإعداد التجريبي التخطيطي للتجريد الخطي البلازمي وتنقية الحمض النووي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملاحظة: الخطي يزيد من العائد RNA أثناء النسخ في المختبر (الخطوة 3)
- لتكييف الحمض النووي البلازميد(الشكل 1)مزيج 10 ميكروغرام من الحمض النووي قالب (المستخرجة في الخطوة 1)، 10 ميكرولتر من العازلة، 2 ميكرولتر من MluI والتكيف مع حجم 100 ميكرولتر مع H2O.
- احتضان لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية وتأكيد الخطية من البلازميد بواسطة agarose هلام electrophoresis (على سبيل المثال، تحميل الحمض النووي plasmid غير هضم وهضم [1 μL من الحمض النووي لكل منهما] على 1٪ agarose هلام وتشغيل الكهربائي في 120 V ثابت الحالية).
- بعد بروتوكول المصنعين لاستخراج الحمض النووي (انظر جدول المواد، الشكل 1)، اخلط 500 ميكرولتر من العازلة الملزمة ، المقدمة في المجموعة ، مع 100 ميكرولتر من الحمض النووي الخطي. تطبيق العينة على عمود تصفية، والطرد المركزي في 17800 × ز لمدة 30 s. تجاهل تدفق من خلال ووضع أعمدة التصفية مرة أخرى في نفس الأنبوب.
- اغسل عمود الفلتر بإضافة 650 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت والطرد المركزي عند 17,800 x غم لمدة 30 s. تجاهل التدفق من خلال وضع عمود التصفية مرة أخرى في نفس الأنبوب. لإزالة المخزن المؤقت الغسل المتبقية، الطرد المركزي الجاف في 17,800 x ز لمدة 60 s ووضع كل عمود مرشح في أنبوب 1.5 mL طاردة مركزية صغيرة نظيفة بعد ذلك.
- الحمض النووي Elute عن طريق نقل 60 ميكرولتر من H2O (درجة PCR، 70 درجة مئوية) إلى وسط المرشح. احتضان لمدة 1 دقيقة في 70 درجة مئوية والطرد المركزي في 18000 × ز لمدة 1 دقيقة. قياس تركيز الحمض النووي المنقى باستخدام مقياس الطيف.
ملاحظة: تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية حتى النسخ في المختبر.
3. في المختبر النسخ من كامل طول النمط الجيني HEV 3 p6 الحمض النووي وتنقية RNA
الشكل 2: الإعداد التجريبي التخطيطي للنسخ في المختبر وتنقية RNA. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملاحظة: النسخ في المختبر ضروري لإنتاج الحمض النووي الريبي الجينومي الفيروسي من الحمض النووي البلازميد.
- لمزيج النسخ في المختبر 20 ميكرولتر من 5x T7 النسخ العازلة، 10 M DTT، 100 يو من مثبطات ريبونوكريلاز، 25 mM ATP، CTP، و UTP، 12.5 mM GTP، 5 mM Ribo m7G كاب التناظرية، 2 ميكروغرام من قالب الحمض النووي الخطي، و 80 U من T7 RNAASE. ملء ما يصل إلى 100 ميكرولتر مع النوى الحرة H2O، اخلط جيدا واحتضان لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: التخزين على المدى القصير عند -20 درجة مئوية ممكن بعد الخطوة 3.1 إلى 3.1.2.- إضافة 2 ميكرولتر من T7 RNA البوليميراز، مزيج جيدا واحتضان لآخر 2 ح في 37 درجة مئوية.
- هضم قالب الحمض النووي الأولي، أضف 7.5 ميكرولتر من DNase (RNase Free، 1 U/μL)، اخلطي جيداً وحضن في 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تنظيف جميع الأسطح والماصات مع إزالة التلوث السطحي لRNase عند العمل مع RNA لتجنب التدهور. أيضا، تأكد من أن جميع أنابيب رد الفعل هي RNase خالية ومعقمة. فقط استخدام نصائح مع المرشحات وتمييع فقط مع مياه خالية من RNase ومعقمة.
- بعد بروتوكول تصنيع لاستخراج RNA (انظر جدول المواد، الشكل 2)، إعداد بريميكس من العازلة Lysis والإيثانول 100 ٪ عن طريق خلط 330 ميكرولتر من Lysis العازلة و 330 ميكرولتر من 100 ٪ من الايثانول لكل رد فعل النسخ في المختبر. إضافة 660 ميكرولتر من Lysis العازلة-الإيثانول بريميكس إلى 110 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي ودوامة. عينة تحميل على عمود مرشح والطرد المركزي في 8000 x ز لمدة 30 s. تجاهل تدفق من خلال ووضع عمود التصفية مرة أخرى في نفس الأنبوب.
- أضف 600 ميكرولتر من عازلة الغسل والطرد المركزي عند 8000 x g لمدة 30 s. تجاهل عمود عامل التصفية الذي يتم نقله من خلال التدفق ووضعه مرة أخرى في نفس الأنبوب. أضف 350 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت والطرد المركزي عند 8000 x g لمدة 2 دقيقة لإزالة المخزن المؤقت للغسيل المتبقي. ضع كل عمود تصفية في أنبوب 1.5 مل صغيري. افتح غطاء عمود الفلتر واترك العمود يجف لمدة 3 دقائق.
- إلوت RNA عن طريق وضع 50 ميكرولتر من RNase مجانا H2O في وسط عمود التصفية. احتضان لمدة 1 دقيقة في RT والطرد المركزي لاحقا في 8000 س ز لمدة 1 دقيقة. تحقق من سلامة RNA عن طريق تحميل 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي على هلام agarose وقياس تركيز الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام مقياس الطيف.
ملاحظة: خزّن الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية حتى الكهربة وذوبان الحمض النووي الريبي حصرياً على الجليد لتجنب التدهور.
4. إعداد خلايا HepG2 لثقافة الخلية المشتقة HEV (HEVcc) إنتاج
الشكل 3: إعداد تجريبي تخطيطي لإعداد خلايا HepG2 لإنتاج خلايا HEV (HEVcc) من الخلايا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملاحظة: لتجنب التلوث، تم إعداد الخلايا، والكهربية، والعدوى، والحصاد، و تثبيت الخلايا في ظروف معقمة في مرفق من المستوى 2 للسلامة البيولوجية. تم إنجاز خطوات الحضانة في 37 درجة مئوية التي تنطوي على الخلايا في حاضنة CO2 5٪ .
- لإعداد خلايا HepG2 لإنتاج HEVcc(الشكل 3)،خلايا البذور في كامل Dulbecco 'sصرحة النسر المتوسط (DMEM) (انظر الجدول 1)على الكولاجين 15 سم (انظر الجدول 1، معقم فلتر PBS- حمض الخليك مزيج من خلال 0.2 μm شبكة قبل إضافة الكولاجين) طبق الثقافة المغلفة. احتضان في 37 درجة مئوية حتى الخلايا هي 90٪ التقاء.
ملاحظة: كل طبق 15 سم يحتوي على 90% من الخلايا المضمّنة سيولد خلايا كافية حتى 4 كهربية. - قم بإزالة الوسط بلطف من الصفيحة وغسل الخلايا مرة واحدة مع 10 مل من 1X PBS. الخلايا التربسينيزي بإضافة 3 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA على الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية حتى يتم فصل الخلايا تماما. خلايا resuspend في 10 مل DMEM إكمال المتوسطة ونقل تعليق الخلية في أنبوب 50 مل. تحديد العدد الإجمالي للخلايا.
- منذ كل الكهربائي يتطلب 5 × 106 الخلايا، نقل حجم المناسبة في أنبوب 50 مل جديدة وملء ما يصل إلى 35 مل على الأقل مع 1X PBS. خلايا الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق والتخلص بعناية من افرا دون إزعاج بيليه الخلية.
- غسل الخلايا مرة أخرى مع 35 مل من 1X PBS في 200 س ز لمدة 5 دقائق. مكان الخلايا على الجليد ولا إزالة 1X PBS حتى الآن, للحفاظ على الخلايا في تعليق.
5. الكهربائي من خلايا HepG2
الشكل 4: الإعداد التجريبي التخطيطي للكهربية للخلايا HepG2. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- لكهربية من خلايا HepG2 (الشكل 4) إعداد 400 ميكرولتر من Cytomix كاملة لكل electroporation من خلال استكمال 384 ميكرولتر من Cytomix (انظر الجدول 1) مع 2 M ATP و 5 mM Glutathione. إعداد الحق الطازجة قبل الاستخدام ووضعها مباشرة على الجليد.
ملاحظة: تنفيذ الصحيح بعد السريع للخطوات التالية الهامة. لذلك، تأكد من أن كل شيء يتم إعداده بشكل صحيح. - إزالة بعناية 1X برنامج تلفزيوني دون إزعاج بيليه الخلية من الخطوة 4.4. Resuspend 5 × 106 خلايا في 400 ميكرولتر من Cytomix كاملة وإضافة 5 ميكروغرام RNA من الخطوة 3.2.2. نقل الحل إلى 4 ملم cuvette والنبض مرة واحدة مع 975 μF، 270 V ل20 مللي ثانية مع نظام كهربائي.
- بعد خلايا نقل الكهربائي في أسرع وقت ممكن مع ماصة باستور في 11 مل DMEM كاملة في electroporation.
ملاحظة: للتأكد من أن يتم بنجاح نقل الحمض النووي الريبي إلى خلايا HepG2، سيتم تنفيذ عنصر تحكم transfection (TC). وتتراوح معدلات الإصابة بالتهروب المتوقعة بين 40-60% من الخلايا الإيجابية ORF2.
- بعد خلايا نقل الكهربائي في أسرع وقت ممكن مع ماصة باستور في 11 مل DMEM كاملة في electroporation.
- نقل 10 مل من الخلايا الكهربائية في طبق ثقافة 10 سم المغلفة مع الكولاجين. إضافة 1.3 × 105 الخلايا الكهربائية (300 ميكرولتر) في بئر واحد من الكولاجين المغلفة 24- لوحة microtitre تحمل زلة غطاء (تستخدم في وقت لاحق كتحكم في النقل). توزيع الخلايا بالتساوي واحتضان في 37 درجة مئوية.
- بعد 24 ساعة، تغيير متوسط من 10 سم طبق واستبدالها مع 10 مل جديدة DMEM كاملة. لا تقم بتغيير الوسيطة لعنصر التحكم في عملية النقل. احتضان لمدة 6 أيام أخرى في 37 درجة مئوية.
- وقف التحكم في transfection في 24 لوحة جيدا 5-7 د بعد electroporation اعتمادا على كثافة الخلية عن طريق الاستمرار في بروتوكول تلطيخ المناعة (الخطوة 8). يتم حساب كفاءة النقل عن طريق حساب عدد الخلايا الإيجابية ORF2 تطبيع إلى العدد الإجمالي للخلايا.
6. حصاد HEVcc داخل وخارج الخلية
الشكل 5: الإعداد التجريبي التخطيطي لحصاد HEVcc داخل الخلية وخارجها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- لحصاد HEVcc خارج الخلية(الشكل 5)،تصفية عظمى، تم الحصول عليها من طبق 10 سم بعد 6 أيام (الخطوة 5.3.1)، من خلال شبكة 0.45 ميكرومتر لإزالة أي حطام الخلية. مخزن حصاد HEVcc خارج الخلية في 4 درجة مئوية للعدوى في اليوم نفسه، وإلا تخزين في -80 درجة مئوية.
- لحصاد HEVcc داخل الخلايا(الشكل 5)، وغسل الخلايا مع 1X PBS و trypsinize بإضافة 1.5 مل من 0.05٪ تريبسين-EDTA. احتضان في 37 درجة مئوية حتى يتم فصل الخلايا تماما. إضافة 10 مل من DMEM كاملة، لوحة دافق لفصل الخلايا ونقل تعليق الخلايا إلى أنبوب 50 مل. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. جهاز طرد مركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
- تجاهل عظمى و resuspend بيليه الخلية في 1.6 مل من DMEM كاملة في electroporation. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب رد فعل 2 مل.
ملاحظة: لا تستخدم وحدات تخزين أكبر لأنها قد تقلل بشكل كبير الأحمال الفيروسية. - تجميد (في النيتروجين السائل) وخلايا ذوبان. كرر هذا التسلسل 3 مرات.
ملاحظة: لا تجمع أكثر من إكتروليت واحد (1.6 مل) لدورات التجميد والذوبان 3 كما قد تضعف كفاءة التحلل. لا دوامة تعليق الخلية في بين الدورات. تأكد من ذوبان تعليق الخلايا ببطء (على سبيل المثال، درجة حرارة الغرفة أو على الجليد) لزيادة الأحمال الفيروسية إلى أقصى حد. - عالية السرعة الطرد المركزي الخلايا lysed لمدة 10 دقيقة في 10000 × ز لفصل حطام الخلية. نقل المُندفع في أنبوب جديد. اتخاذ supernatant للعدوى، وإلا تخزين في -80 درجة مئوية.
- اختياريا، والتركيز خارج- والخلايا hevcc باستخدام المكثف لزيادة الأحمال الفيروسية (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة).
- تجاهل عظمى و resuspend بيليه الخلية في 1.6 مل من DMEM كاملة في electroporation. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب رد فعل 2 مل.
7. عدوى خلايا HepG2/C3A مع HEVcc داخل وخارج الخلية
الشكل 6: الإعداد التجريبي التخطيطي للإصابة بالخلايا HepG2/C3A مع HEVcc داخل الخلية وخارجها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملاحظة: يجب أن تضمن عدوى خلايا HepG2/C3A أن تكون الجسيمات المعدية قد أنتجت. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام المعايرة من HEVcc داخل الخلايا والخلايا خارج الخلية لحساب اترات الفيروس في FFU / مل. وسيشار إلى ذلك لاحقاً باسم مكافحة العدوى (IC).
- لإعداد خلايا HepG2/C3A للعدوى HEVcc (الشكل 6) ، prewarm الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية (MEM) كاملة (انظر الجدول 1) إلى 37 درجة مئوية.
- البذور 2 × 104 خلايا / جيدا في 100 ميكرولتر على الكولاجين المغلفة 96 لوحة microtiter جيدا يوم واحد قبل الخطوة 6. تأكد من ملء الآبار الخارجية بـ 1x PBS لمنع تبخر الوسط داخل الآبار الداخلية الـ 60. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- تصيب ب HEVcc خارج الخلية بإضافة 50 ميكرولتر من المابير (من الخطوة 6.1) إلى خلايا HepG2/C3A التي تم زرعها في اليوم السابق. مزيج جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا وتمييع تسلسليا ست مرات 1:3 عن طريق نقل 50 ميكرولتر في البئر المقبل. تنفيذ تكرارات من التخفيف التسلسلي للنسخ المتماثلة الفنية.
- تصيب مع HEVcc داخل الخلايا بإضافة 25 ميكرولتر (من الخطوة 6.2.3) إلى خلايا HepG2/C3A بذر في اليوم السابق. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا وتمييع تسلسليا ست مرات 1:5 عن طريق نقل 25 ميكرولتر في البئر المقبل. تنفيذ التكرارات تخفيف تسلسلي للنسخ المتماثل التقني.
- بعد 7 د عند 37 درجة مئوية وقف العدوى عن طريق الاستمرار في بروتوكول وصمة المناعة (الخطوة 8).
8. تلطّخ المناعة من عدوى - وعدوى مكافحة
الشكل 7: الإعداد التجريبي التخطيطي لتلوين الفلوروس المناعي من العدوى والسيطرة على العدوى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- لصبغ المناعةfluorescence (الشكل 7)، 3x مع 1x PBS وإصلاح الخلايا عن طريق الاستغناء 350 ميكرولتر (التحكم في transfection [TC]) أو 50 ميكرولتر (السيطرة على العدوى [IC]) من 4 ٪ حل التثبيت في البئر. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT وغسل بعناية مرتين مع 1X PBS بعد ذلك.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا للتحكم transfection حتى يتم إيقاف إصابة خلايا HepG2/C3A أيضاً. تخزين لوحة جيدا في 4 °C. أيضا ختم مع parafilm لمنع التبخر. - Permeabilize الخلايا بإضافة 350 ميكرولتر (TC) أو 50 ميكرولتر (IC) من 0.2٪ تريتون X-100 (في 1 × PBS) لمدة 5 دقائق في RT. ثم غسل بعناية مرتين مع 1X PBS وكتلة مع 350 ميكرولتر (TC) أو 50 ميكرولتر (IC) من مصل الحصان 5٪ (في 1X PBS) لمدة 1 ساعة في RT تحت التحريض المستمر على شاكر المدارية (30 دورة في الدقيقة).
ملاحظة: إعداد طبق بلاستيكي صغير (30 مم) عن طريق وضع الأنسجة الرطبة داخل وطبقة فيلم البارافين على القمة، وخلق غرفة رطبة. ثم نقل زلة تغطية TC التي تواجه حتى على فيلم البارافين. سيتم تنفيذ الخطوات التالية لـ TC في الغرفة الرطبة. - إضافة 70 ميكرولتر (TC) أو 25 ميكرولتر (IC) من الأجسام المضادة الأولية ANTI-ORF2 8282 (مصل الأرانب فرط المناعة الخافتة HEV محددة، 1:5،000 في مصل الحصان 5٪ ) في البئر واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية تحت الانفعالات المستمرة على شاكر المداري (30 دورة في الدقيقة).
- غسل بعناية مرتين مع 1X PBS وإضافة 70 ميكرولتر (TC) أو 25 ميكرولتر (IC) من الأجسام المضادة الثانوية الماعز المضادة للأرانب 488 (1:1,000 في مصل الحصان 5٪). احتضان ل 1 ساعة تحت الانفعالات المستمرة على شاكر المدارية (30 دورة في الدقيقة) في الظلام. مرة أخرى، وغسل بعناية مرتين مع 1X برنامج تلفزيوني
- أضف 70 ميكرولتر (TC) أو 25 ميكرولتر (IC) من DAPI (1:10,000 في H2O) وحضن لمدة 1 دقيقة. اغسل بعناية مرتين مع H2O. أخرج زلة الغطاء من الغرفة الرطبة ، ونزل غطاء التحميل مع 6 ميكرولتر من الكاشف المتصاعد رأسًا على عقب على شريحة الغطاء (فقط لـ TC) والسماح للكاشف المتصاعد بالجفاف لمدة 16 ساعة في RT في الظلام. تخزين IC في الماء حتى التصوير وختم لوحة مع فيلم البارافين لتجنب التجفيف بسبب التبخر.
- التقاط الصور لتأكيد نجاح العدوى والعدوى.
ملاحظة: تم الحصول على نتائج قابلة للمقارنة باستخدام الأجسام المضادة مضادة ORF2 1E657 (1:200 في مصل الحصان 5٪) و حمار الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس (1:1,000 في مصل الحصان 5٪)
9. قرار الاتحاد
ملاحظة: يتم تعريف FFU واحد كـ أو أكثر ORD2-positive الخلايا مفصولة عن FFU آخر بواسطة الخلايا السالبة ثلاث على الأقل.
- لبدء HEVcc خارج الخلية لحساب جميع بؤر ORF2 إيجابية من اثنين من الآبار في أدنى اثنين من التخفيفات. وينبغي حساب ما مجموعه أربع آبار. يمكن حساب وحدات تشكيل التركيز (FFU) لكل ملليلتر مع المعادلة التالية:
ملاحظة: تتراوح الاترات المتوقعة بين 102 و5 × 104 FFU/mL. - ل HEVcc داخل الخلايا تبدأ في حساب جميع بؤر ORF2 إيجابية في الآبار حيث يتم ملاحظة ما بين 50 إلى 100 بؤر. بالإضافة إلى ذلك، عد الآبار اثنين في التخفيف أعلى المقبل. وينبغي حساب ما مجموعه أربع آبار. يمكن حساب وحدات تشكيل التركيز (FFU) لكل ملليلتر مع المعادلة التالية:
ملاحظة: تَتَرَكِرُ مُتوقعة تتراوح بين10 5 و3 × 106 FFU/mL. وتستخدم العوامل 20x و 40x لاستقراء عدد FFU لكل 50 ميكرولتر و 25 ميكرولتر إلى 1 مل ويمكن تكييفها وفقا لذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا البروتوكول ، ونحن وصف إنتاج عالية تيتر المعدية HEVcc. الخطوة الأولى هي عزل الحمض النووي plasmid (pBluescript_SK_HEVp654 و pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37، الشكل 8a) ، والتي هي بعد ذلك خطية عن طريق الهضم تقييد وتنقيت للنسخ في المختبر (الشكل 1). ويمكن التحقق من الخطية الناجحة من خلال مقارنة غير هضم plasmid-DNA إلى الحمض النووي البلازميد هضم باستخدام جل electrophoresis. وبالإضافة إلى تحول الحجم، ينبغي أن يكون نطاق واحد فقط من الحمض النووي مرئياً يمثل الشكل الخطي. الخطي هو الكامل عندما اثنين من النطاقات الأخرى أعلاه وتحت الشكل الخطي، التي تمثل دائرة نيكت وشكل supercoiled، على التوالي، وتضاءلت تماما(الشكل 8b). وينبغي أن تتجاوز غلة الحمض النووي المنقى 150 نانوغرام/ميكرولتر. فقط إذا كانت هذه الخصائص عقد صحيح ينبغي استخدام الحمض النووي الخطي للنسخ في المختبر. وينبغي أن يكون في المختبر نسخ الجيش الملكي النيبالي كما فحص جيدا باستخدام جل electrophoresis وفي حالة انخفاض RNase abundancy ينبغي أن تظهر عصابات متميزة بدلا من تشويه غير واضحة(الشكل 8c). بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تتجاوز العائد RNA تنقيتها 500 نانوغرام/ميكرولتر في المختبر النووي منقولة(الشكل 2)في نهاية المطاف هو الكهربائي في خلايا HepG2 لإنتاج الفيروسات(الشكل 3 والشكل 4). يتم رصد الكهربائي الناجح من قبل تلطيخ الفلوروسنس المناعي لمراقبة transfection (الشكل 9a). يجب أن تتجاوز كفاءة النقل 40٪(الشكل 9b). وهناك طفرات ناقصة النسخ بمثابة سيطرة سلبية، لضمان خصوصية تلطيخ ORF2، كما يتوقع أي تعبير ORF2(الشكل 9c). بعد 7 أيام من الحضانة مغلفة (خارج الخلية) HEVcc يتم حصادها عن طريق جمع وتصفية الخلية فوق تربية. غير مغلفة (داخل الخلايا) يتم تحرير HEVcc من الخلايا من قبل عدة دورات التجميد والذوبان. لإزالة أي حطام الخلية يتم طرد الخلية lysate بسرعة عالية (الشكل 5). في وقت لاحق، وتستخدم كل من الأنواع HEVcc لتصيب خلايا HepG2/C3A عن طريق التخفيف التسلسلي(الشكل 6 والشكل 9d). وفقا للمعادلات أعلاه (انظر الخطوة 9) يتم تحديد ال titers الفيروسية عن طريق حساب FFU.
يتم تصوير النتائج التمثيلية في الشكل 9. وينبغي أن تشمل السيطرة على transfection حوالي 50٪ ORF2-positive الخلايا لضمان كمية فعالة من الفيروسات التي يجري إنتاجها(الشكل 9أ، ب). أقل ORF2-positive الخلايا أقل سوف يكون titer أقل. على وجه التحديد بعد الخطوات المذكورة في البروتوكول سوف تولد تارت التي تتراوح بين 105 5 و 3 × 106 FFU / مل لغير مغلفة (داخل الخلايا) HEVcc. بالنسبة للظرف (خارج الخلية) من المتوقع أن يكون هناك 102 و 5 x104 FFU/mL(الشكل 9e). بالإضافة إلى ذلك، لوحظ ارتفاع عدد FFU لـ G1634R متحولة. عند حساب النسبة بين نسخ الجينوم والجسيمات الفيروسية المعدية أنتجت HEVcc داخل الخلايا لكل p6_WT p6_G1634R وجدت لتكون أقل مقارنة مع HEVcc خارج الخلية، مما يشير إلى إصابة محددة أعلى من الأنواع HEV غير المغلفة(الشكل 9F).
الشكل 8: جيل من الحمض النووي الريبي في المختبر.
(أ)مثال على طيف امتصاص معزولة Plasmid-DNA. (ب) جل الكهرباء من غير هضم وهضم Plasmid-DNA. (C) جل الكهرباء من في المختبر نسخت RNA. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: النتائج التمثيلية لإنتاج تيتر HEVcc عالية.
(أ)التحكم في نقل الخلايا الكهربائية HepG2. كانت الخلايا المُصابة بالعدوى مُلطّخة بالأجسام المضادة لـ ORF2 (الأخضر، LS-Bio) و DAPI (الأزرق). (ب)تم حساب كفاءة النقل من خلال عدد الخلايا الإيجابية ORF2 التي تم تطبيعها إلى عدد الخلايا الإجمالية. (C)متحولة نقص النسخ المتماثل بمثابة عنصر تحكم سلبي لتلوين الفلوروسين المناعية، لضمان خصوصية ORF2. (D) لتحديد FFU تم تنفيذ عمليات تخفيف تسلسلي من مخزونات الفيروسات المنتجة. يتم تصوير الخلايا الإيجابية ORF2 باللون الأبيض. (E) تم حساب ال titers الفيروسية من قبل FFU العد و (F) تم تحديد الأحمال الفيروسية من قبل qPCR وتطبيعها إلى FFU / مل. تظهر الأشرطة الانحراف المعياري المتوسط و المعياري لـ 38 و10 تجارب مستقلة، على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| حل العمل | تركيز | حجم |
| الكولاجين | 40 مل | برنامج تلفزيوني |
| 40 ميكرولتر | حمض الخليك | |
| 1 مل | محلول الكولاجين R 0.4% معقمة | |
| Cytomix | 120 mM | KCl |
| 0.15 مليون متر | CaCl2 | |
| 10 mM | K2HPO4 (pH 7.4) | |
| 25 mM | HEPES | |
| 2 mM | EGTA | |
| اكتمال DMEM | 500 مل | DMEM |
| 5 مل | القلم / بكتيريا | |
| 5 مل | MEM NEAA (100X) | |
| 5 مل | ل-الجلوتامين | |
| 50 مل | مصل الأبقار الجنينية | |
| اكتمل MEM | 500 مل | Mem |
| 5 مل | بيروفات الصوديوم | |
| 5 مل | جينتاميسين | |
| 5 مل | MEM NEAA (100X) | |
| 5 مل | ل-الجلوتامين | |
| 50 مل | IgG منخفضة للغاية |
الجدول 1: جدول تكوين العازلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بدءا من إعداد البلازميد، ينبغي أن تتجاوز غلة الحمض النووي 150 نانوغرام/ميكرولتر لتكون قادرة على إجراء خطية متعددة من نفس المخزون البلازميد، مما يقلل من خطر الطفرات الناجمة عن البكتيريا من تسلسلات الجينوم الحاسمة. وعلاوة على ذلك، من المهم للتحقق من خلاصة تقييد لplsmid الخطية كاملة بواسطة جل electrophoresis (الشكل 8b). ومن شأن عدم وجود الحمض النووي البلازمي الخطي أن يحفز تضخيم الدائرة المتداولة مما يتسبب في أن يكون النسخ في المختبر أقل كفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي تأكيد سلامة RNA لتقييم وفرة RNases داخل العينة(الشكل 8c). فقط بعد ذلك ينبغي النظر في كهربائي الخلايا المستهدفة. ملاحظة, قبل البدء في إعداد خلايا HepG2, تأكد من كل شيء في متناول اليد ومحض جيدا تجنب فترات الانتظار الطويلة. خاصة، ضمان التخزين لفترة قصيرة من الخلايا والRNA في Cytomix حتى electroporation. للتحايل على تسخين الخلايا أثناء الكهربة من الضروري تبريد المخزن المؤقت على الجليد مسبقًا. يجب ألا تتجاوز مدة النبض 20-25 مللي ثانية و 270 فولت. بعد الكهربائي الخلايا تتطلب نقل سريع إلى المتوسطة الطازجة لضمان صلاحية الخلية. قبل الإصابة بالخلايا المستهدفة، يجب فحص TC لمعرفة النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ORF2. في حالة TC يظهر أي خلايا ORF2 إيجابية فمن المرجح أن الكهربائي قد فشلت أو تلطيخ لم تنجح، وينبغي تكرار التجربة.
عند حصاد HEVcc داخل الخلايا يجب إيلاء اهتمام خاص لسرعة دورات التجميد والذوبان. يمكن زيادة الاترات الفيروسية عن طريق تنفيذ التجميد في النيتروجين السائل بدلا من -80 درجة مئوية. على العكس من ذلك، ينبغي أن يتم ذوبان أبطأ طريقة ممكنة مما يوحي التخزين على الجليد حتى يتم تصفية تعليق الخلية تماما. ومع ذلك، فمن الممكن أيضا لإذابة تعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة، في حاضنة 37 درجة مئوية أو حمام الماء، ولكن أسرع سيتم تنفيذ ذوبان كلما انخفض الثتر.
اعتمادا على التجارب التالية من الممكن أيضا أن تفعل تجميد وذوبان دورات في MEM كاملة أو 1X برنامج تلفزيوني دون خسارة كبيرة من الثتر الفيروسية، ومع ذلك، ينبغي للمرء أن نضع في اعتبارنا أن هذا يسبب HEVcc خارج الخلية لتكون في وسيلة مختلفة من HEVcc داخل الخلايا.
بعد هذه الخطوات الحاسمة من البروتوكول، وتتراوح الارتصارات المتوقعة بين 105 و 3 × 106 FFU/mL لـ HEVcc غير المغلفة (داخل الخلايا). لظرف (خارج الخلية) HEVcc titers بين 102 و 5 × 104 FFU / مل ينتظرون(الشكل 9e). حتى الآن، والدراسات التي تستخدم نظم ثقافة الخلايا HEV رصد النسخ الفيروسية وانتشار في الغالب من قبل qPCR. لا يوفر تقييم نسخ جينوم الحمض النووي الريبي بعد أي نظرة ثاقبة على تجميع الجزيئات المعدية وإطلاقها.
دراسة سابقة58 نشر بنجاح عزل المريض في ثقافة الخلية مع أقصى 103 TCID50/mL. كما هو مبين مؤخرا، فمن الممكن أيضا أن مرور بنجاح HEVcc في ثقافة الخلية وتكييف بروتوكول لدينا لسلالات أخرى، مثل 47832c و 83-2 التي لا تؤوي الإدراج في المنطقة hypervariable56. أيضا، ما إذا كان يمكن استنساخ تسلسل المستمدة من المريض في العمود الفقري ناقلات بلوسكريبت، ولا تزال تسفر عن ارتفاع فيروسية تم اختبارها. مع الطريقة المقدمة، يمكن حصاد الجزيئات الفيروسية غير المغلفة وكذلك المغلفة واستخدامها لتطعيم مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا الساذجة مثل A549 و Huh7.5 و Jeg-3 و hepatocytes الإنسان والبورسين الأولية ، مما يوفر فائدة للتطبيقات المستقبلية مثل التحقيق في tropism HEV ، والعوامل المسببة للأمراض ، وتطوير المخدرات ، والتفاعلات الفيروسية والمضيف ، ودراسات التعطيل ، وتحييد الأجسام المضادة وغيرها الكثير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نحن ممتنون لسوزان ايمرسون لالتهاب الكبد E فيروس P6 استنساخ. تم توفير مصل الأرانب فرط المناعة الخاصة بHV بلطف من قبل راينر أولريش، معهد فريدريش لوفلر، ألمانيا. وعلاوة على ذلك، نشكر جميع أعضاء قسم علم الفيروسات الجزيئي والطبي في جامعة الرور بوخوم على دعمهم ومناقشتهم. تم إنشاء الأرقام 1-7 مع BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm mesh | Sarstedt | 83.1826 | Harvest extracellular Virus |
| 4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | Immunofluorescence |
| Acetic acid | CarlRoth | 6755.1 | Collagen working solution |
| Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | Virus harvesting |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | Selection of transformed bacteria |
| ATP | Roche | 11140965001 | in vitro transcription and electroporation |
| BioRender | BioRender | Figure Generation | |
| CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
| Collagen R solution 0.4 % sterile | Serva | 47256.01 | Collagen working solution |
| CTP | Roche | 11140922001 | in vitro transcription |
| Cuvette | Biorad | 165-2088 | Electroporation |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | Immunofluorescence |
| DMEM | gibco | 41965-039 | Cell culture |
| DNAse | Promega | M6101 | in vitro transcription |
| DTT | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
| Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformation |
| Fetal bovine serum | gibco | 10270106 | Cell culture |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Immunofluorescence |
| GenePulser Xcell Electroporation System | BioRad | 1652660 | Electroporation |
| Gentamycin | gibco | 15710049 | Cell culture |
| GTP | Roche | 11140957001 | in vitro transcription |
| H2O | Braun | 184238001 | Immunofluorescence |
| Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
| Horse serum | gibco | 16050122 | Immunofluorescence |
| K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
| KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
| L-Glutamin | gibco | 25030081 | Cell culture |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
| MEM | gibco | 31095-029 | Cell culture |
| MEM NEAA (100×) | gibco | 11140-035 | Cell culture |
| MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
| Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA concentration |
| MluI enzyme | NEB | R0198L | Linearization |
| NEB buffer | NEB | included in R0198L | Linearization |
| NucleoSpin Plasmid kit | Macherey & Nagel | 740588.250 | Plasmid preparation |
| NucleoSpin RNA Clean-up Kit | Macherey & Nagel | 740948.250 | RNA purification |
| PBS | gibco | 70011051 | Cell culture |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Cell culture |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) | Todt et.al | Virus production | |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) | Shukla et al. | GenBank accession no. JQ679013 | Virus production |
| Primary antibody 1E6 | LS-Bio | C67675 | Immunofluorescence |
| Primary antibody 8282 | Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | DNA extraction |
| Ribo m7G Cap Analog | Promega | P1711 | in vitro transcription |
| RNase away | CarlRoth | A998.3 | RNA purification |
| RNasin (RNase inhibitor) | Promega | N2515 | in vitro transcription |
| Secondary antibody donkey anti-mouse 488 | Thermo Fisher | A-21202 | Immunofluorescence |
| Secondary antibody goat anti-rabbit 488 | Thermo Fisher | A-11008 | Immunofluorescence |
| Sodium Pyruvat | gibco | 11360070 | Cell culture |
| T7 RNA polymerase | Promega | P2077 | in vitro transcription |
| Transcription Buffer | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| Triton X-100 | CarlRoth | 3051.3 | Immunofluorescence |
| Trypsin-EDTA (0.5 %) | gibco | 15400054 | Cell culture |
| ultra-low IgG | gibco | 1921005PJ | Cell culture |
| UTP | Roche | 11140949001 | in vitro transcription |
References
- Wedemeyer, H., Pischke, S., Manns, M. P. Pathogenesis and treatment of hepatitis e virus infection. Gastroenterology. 142 (6), 1388-1397 (2012).
- Smith, D. B., et al. Proposed reference sequences for hepatitis E virus subtypes. The Journal of General Virology. 97 (3), 537-542 (2016).
- Ding, Q., et al. Hepatitis E virus ORF3 is a functional ion channel required for release of infectious particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (5), 1147-1152 (2017).
- Chapuy-Regaud, S., et al. Characterization of the lipid envelope of exosome encapsulated HEV particles protected from the immune response. Biochimie. 141, 70-79 (2017).
- Yin, X., Ambardekar, C., Lu, Y., Feng, Z. Distinct Entry Mechanisms for Nonenveloped and Quasi-Enveloped Hepatitis E Viruses. Journal of Virology. 90 (8), 4232-4242 (2016).
- Khuroo, M. S., Khuroo, M. S., Khuroo, N. S. Hepatitis E: Discovery, global impact, control and cure. World Journal of Gastroenterology. 22 (31), 7030-7045 (2016).
- Rasche, A., et al. Hepatitis E Virus Infection in Dromedaries, North and East Africa, United Arab Emirates, and Pakistan, 1983-2015. Emerging Infectious Diseases. 22 (7), 1249-1252 (2016).
- Hsieh, S. Y., et al. Identity of a novel swine hepatitis E virus in Taiwan forming a monophyletic group with Taiwan isolates of human hepatitis E virus. Journal of Clinical Microbiology. 37 (12), 3828-3834 (1999).
- Johne, R., et al. Detection of a novel hepatitis E-like virus in faeces of wild rats using a nested broad-spectrum RT-PCR. The Journal of General Virology. 91, Pt 3 750-758 (2010).
- Payne, C. J., Ellis, T. M., Plant, S. L., Gregory, A. R., Wilcox, G. E. Sequence data suggests big liver and spleen disease virus (BLSV) is genetically related to hepatitis E virus. Veterinary Microbiology. 68 (1-2), 119-125 (1999).
- Haqshenas, G., Shivaprasad, H. L., Woolcock, P. R., Read, D. H., Meng, X. -J. Genetic identification and characterization of a novel virus related to human hepatitis E virus from chickens with hepatitis–splenomegaly syndrome in the United States. Journal of General Virology. 82, 2449-2462 (2001).
- Tei, S., Kitajima, N., Takahashi, K., Mishiro, S. Zoonotic transmission of hepatitis E virus from deer to human beings. The Lancet. 362 (9381), 371-373 (2003).
- Nakamura, M., et al. Hepatitis E virus infection in wild mongooses of Okinawa, Japan: Demonstration of anti-HEV antibodies and a full-genome nucleotide sequence. Hepatology Research: the Official Journal of the Japan Society of Hepatology. 34 (3), 137-140 (2006).
- Drexler, J. F., et al. Bats worldwide carry hepatitis E virus-related viruses that form a putative novel genus within the family Hepeviridae. Journal of Virology. 86 (17), 9134-9147 (2012).
- Zhao, C., et al. A novel genotype of hepatitis E virus prevalent among farmed rabbits in China. Journal of Medical Virology. 81 (8), 1371-1379 (2009).
- Lhomme, S., et al. Risk of zoonotic transmission of HEV from rabbits. Journal of Clinical Virology: the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 58 (2), 357-362 (2013).
- Kaci, S., Nöckler, K., Johne, R. Detection of hepatitis E virus in archived German wild boar serum samples. Veterinary Microbiology. 128 (3-4), 380-385 (2008).
- Liu, B., et al. Avian hepatitis E virus infection of duck, goose, and rabbit in northwest China. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 76 (2018).
- Raj, V. S., et al. Novel hepatitis E virus in ferrets, the Netherlands. Emerging Infectious Diseases. 18 (8), 1369-1370 (2012).
- Dong, C., et al. Restricted enzooticity of hepatitis E virus genotypes 1 to 4 in the United States. Journal of Clinical Microbiology. 49 (12), 4164-4172 (2011).
- Goens, S. D., Perdue, M. L. Hepatitis E viruses in humans and animals. Animal Health Research Reviews. 5 (2), 145-156 (2004).
- Geng, Y., Wang, Y. Transmission of Hepatitis E Virus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 948, 89-112 (2016).
- Naik, S. R., Aggarwal, R., Salunke, P. N., Mehrotra, N. N. A large waterborne viral hepatitis E epidemic in Kanpur, India. Bulletin of the World Health Organization. 70 (5), 597-604 (1992).
- Feagins, A. R., Opriessnig, T., Guenette, D. K., Halbur, P. G., Meng, X. -J. Detection and characterization of infectious Hepatitis E virus from commercial pig livers sold in local grocery stores in the USA. The Journal of General Virology. 88, Pt 3 912-917 (2007).
- Colson, P., et al. Pig liver sausage as a source of hepatitis E virus transmission to humans. The Journal of Infectious Diseases. 202 (6), 825-834 (2010).
- Wenzel, J. J., et al. Detection of hepatitis E virus (HEV) from porcine livers in Southeastern Germany and high sequence homology to human HEV isolates. Journal of Clinical Virology: the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 52 (1), 50-54 (2011).
- Colson, P., et al. Transfusion-associated Hepatitis E, France. Emerging Infectious Diseases. 13 (4), 648-649 (2007).
- Kamp, C., et al. Impact of hepatitis E virus testing on the safety of blood components in Germany - results of a simulation study. Vox Sanguinis. , (2018).
- Kamar, N., Dalton, H. R., Abravanel, F., Izopet, J. Hepatitis E virus infection. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 116-138 (2014).
- Pischke, S., Behrendt, P., Manns, M. P., Wedemeyer, H. HEV-associated cryoglobulinaemia and extrahepatic manifestations of hepatitis E. The Lancet Infectious Diseases. 14 (8), 678-679 (2014).
- Colson, P., et al. Severe thrombocytopenia associated with acute hepatitis E virus infection. Journal of Clinical Microbiology. 46 (7), 2450-2452 (2008).
- Mishra, P., Mahapatra, M., Kumar, R., Pati, H. P. Autoimmune hemolytic anemia and erythroid hypoplasia associated with hepatitis E. Indian Journal of Gastroenterology: Official Journal of the Indian Society of Gastroenterology. 26 (4), 195-196 (2007).
- Sood, A., Midha, V., Sood, N. Guillain-Barré syndrome with acute hepatitis E. The American Journal of Gastroenterology. 95 (12), 3667-3668 (2000).
- Fousekis, F. S., Mitselos, I. V., Christodoulou, D. K. Extrahepatic manifestations of hepatitis E virus: An overview. Clinical and Molecular Hepatology. 26 (1), 16-23 (2020).
- Pischke, S., et al. Ribavirin treatment of acute and chronic hepatitis E: A single-centre experience. Liver International: Official Journal of the International Association for the Study of the Liver. 33 (5), 722 (2013).
- Kamar, N., et al. Ribavirin for Chronic Hepatitis E Virus Infection in Transplant Recipients. The New England Journal of Medicine. 370, 1111-1120 (2014).
- Todt, D., et al. In vivo evidence for ribavirin-induced mutagenesis of the hepatitis E virus genome. Gut. 65, 1733-1743 (2016).
- Todt, D., Walter, S., Brown, R. J. P., Steinmann, E. Mutagenic Effects of Ribavirin on Hepatitis E Virus-Viral Extinction versus Selection of Fitness-Enhancing Mutations. Viruses. 8 (10), 8100283 (2016).
- Todt, D., Meister, T. L., Steinmann, E. Hepatitis E virus treatment and ribavirin therapy: Viral mechanisms of nonresponse. Current Opinion in Virology. 32, 80-87 (2018).
- Kamar, N., et al. Ribavirin for Hepatitis E Virus Infection After Organ Transplantation: A Large European Retrospective Multicenter Study. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. , (2019).
- Kamar, N., et al. Influence of immunosuppressive therapy on the natural history of genotype 3 hepatitis-E virus infection after organ transplantation. Transplantation. 89 (3), 353-360 (2010).
- Kamar, N., et al. Pegylated interferon-alpha for treating chronic hepatitis E virus infection after liver transplantation. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 50 (5), 30-33 (2010).
- Todt, D., et al. Antiviral Activities of Different Interferon Types and Subtypes against Hepatitis E Virus Replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (4), 2132-2139 (2016).
- Dao Thi, V. L., et al. Sofosbuvir Inhibits Hepatitis E Virus Replication In Vitro and Results in an Additive Effect When Combined with Ribavirin. Gastroenterology. 150 (1), 82-85 (2016).
- van der Valk, M., Zaaijer, H. L., Kater, A. P., Schinkel, J. Sofosbuvir shows antiviral activity in a patient with chronic hepatitis E virus infection. Journal of Hepatology. 66 (1), 242-243 (2017).
- Kaushik, N., et al. Zinc Salts Block Hepatitis E Virus Replication by Inhibiting the Activity of Viral RNA-Dependent RNA Polymerase. Journal of Virology. 91 (21), (2017).
- Todt, D., et al. The natural compound silvestrol inhibits hepatitis E virus (HEV) replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 157, 151-158 (2018).
- Glitscher, M., et al. Inhibition of Hepatitis E Virus Spread by the Natural Compound Silvestrol. Viruses. 10 (6), 301 (2018).
- Kinast, V., Burkard, T. L., Todt, D., Steinmann, E. Hepatitis E Virus Drug Development. Viruses. 11 (6), 485 (2019).
- Schemmerer, M., et al. Enhanced Replication of Hepatitis E Virus Strain 47832c in an A549-Derived Subclonal Cell Line. Viruses. 8 (10), 267 (2016).
- Huang, R., et al. Cell Culture of Sporadic Hepatitis E Virus in China. Clinical and Vaccine Immunology. 6 (5), 729-733 (1999).
- Emerson, S. U., et al. Recombinant hepatitis E virus genomes infectious for primates: Importance of capping and discovery of a cis-reactive element. PNAS. 98 (26), 15270-15275 (2001).
- Shukla, P., et al. Cross-species infections of cultured cells by hepatitis E virus and discovery of an infectious virus-host recombinant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2438-2443 (2011).
- Shukla, P., et al. Adaptation of a genotype 3 hepatitis E virus to efficient growth in cell culture depends on an inserted human gene segment acquired by recombination. Journal of Virology. 86 (10), 5697-5707 (2012).
- Meister, T. L., Bruening, J., Todt, D., Steinmann, E. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Research. 163, 34-49 (2019).
- Todt, D., et al. Robust hepatitis E virus infection and transcriptional response in human hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2020).
- Ankavay, M., et al. New insights into the ORF2 capsid protein, a key player of the hepatitis E virus lifecycle. Scientific Reports. 9 (1), 6243 (2019).
- Schemmerer, M., Johne, R., Erl, M., Jilg, W., Wenzel, J. J. Isolation of Subtype 3c, 3e and 3f-Like Hepatitis E Virus Strains Stably Replicating to High Viral Loads in an Optimized Cell Culture System. Viruses. 11 (6), 483 (2019).
