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Immunology and Infection

उच्च टाइटर हेपेटाइटिस ई वायरस स्टॉक्स के उत्पादन के लिए एक सेल संस्कृति मॉडल

Published: June 26, 2020 doi: 10.3791/61373
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Molecular and Medical Virology, Ruhr University Bochum
* These authors contributed equally

Summary

यहां वर्णित कैसे हेपेटाइटिस ई वायरस (HEV) के उच्च वायरल टाइटर स्टॉक का उत्पादन करने के लिए कुशलतापूर्वक हेपेटोमा कोशिकाओं को संक्रमित करने पर एक प्रभावी तरीका है । प्रस्तुत विधि के साथ, दोनों गैर-छा, साथ ही छा वायरल कणों को काटा जा सकता है और विभिन्न कोशिका रेखाओं को फिर से प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Abstract

हेपेटाइटिस ई वायरस दुनिया भर में बढ़ती व्यापकता के साथ जिगर सिरोसिस और जिगर की विफलता का प्रमुख कारण है । एकल फंसे आरएनए वायरस मुख्य रूप से रक्त चढ़ाने, अपर्याप्त स्वच्छता की स्थिति और दूषित खाद्य उत्पादों से फैलता है । ऑफ लेबल दवा रिबेनाविरिन (आरबीवी) को डेट करने के लिए कई रोगियों के लिए पसंद का इलाज है। फिर भी, एक विशिष्ट HEV उपचार की पहचान की जानी बाकी है । अब तक, एचईवी जीवन चक्र और रोगजनन के बारे में ज्ञान एक कुशल एचईवी सेल संस्कृति प्रणाली की कमी के कारण गंभीर रूप से बाधित हुआ है। वायरल जीवन चक्र के अध्ययन के लिए एक मजबूत सेल कल्चर सिस्टम जरूरी है जिसमें वायरल रोगजनक भी शामिल है । यहां वर्णित विधि के साथ एक गैर-छा एचईवी की 3 x 106 फोकस बनाने इकाई/एमएल (FFU/mL) और 5 x 104 FFU/mL तक छा HEV के वायरल टाइटर्स का उत्पादन कर सकते हैं । इन कणों का उपयोग करके, प्राथमिक कोशिकाओं और मानव, साथ ही पशु कोशिका लाइनों सहित विविध मूल की विभिन्न कोशिकाओं को संक्रमित करना संभव है। प्लाज्मिड्स से संक्रामक एचईवी कणों का उत्पादन एक अनंत स्रोत बन गया है, जो इस प्रोटोकॉल को बेहद कुशल बनाता है।

Introduction

हेपेटाइटिस ई दुनिया भर में बढ़ती व्यापकता के साथ एक काफी कम करके आंका रोग है । लगभग 20 मिलियन संक्रमणों के परिणामस्वरूप प्रति वर्ष 70,000 से अधिक मौतेंहोतीहैं । अंतर्निहित एजेंट, हेपेटाइटिस ई वायरस (HEV), हाल ही में फिर से असाइन किया गया था और अब जेनेरा ऑर्थोहेपेवायरस और पिसिहेपेवायरस सहित परिवार Hepeviridae के भीतर वर्गीकृत किया गया है । विभिन्न मूल के एचईवी को ऑर्थोहेपेवायरस ए-डी प्रजातियों के भीतर वर्गेड किया जाता है जिसमें मनुष्यों, सूअर, खरगोशों, चूहों, पक्षियों और अन्य स्तनधारियों2से आइसोलेट्स शामिल हैं। वर्तमान में, सकारात्मक केंद्रित, एकल फंसे आरएनए वायरस के आठ विभिन्न जीनोटाइप (जीटी) की पहचान की गई है। यद्यपि वे अपनी अनुक्रम पहचान, पारेषण और भौगोलिक वितरण के मार्गों में भिन्न होते हैं, लेकिन उनकी जीनोमिक संरचना अत्यधिक संरक्षित होती है। अधिक विशिष्ट, 7.2 केबीपी एचईवी जीनोम को 3 प्रमुख ओपन रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ 1-3) में विभाजित किया गया है। जबकि ORF1 मेजबान सेल के भीतर एक सफल प्रतिकृति के लिए आवश्यक सभी एंजाइमों को एन्कोड करता है, ओआरएफ 2 कैप्सिड प्रोटीन को एन्कोड करता है, और ओआरएफ 3 प्रोटीन असेंबली और संक्रामक कणों की रिहाई के लिए आवश्यक एक कार्यात्मक आयन चैनल के रूप में संचालित होता है3। एक बार बेसल या एपिकल ल्यूमेन हेव में छोड़े जाने के बाद, क्रमशः4,,5,5 के आधार पर वायरस रक्त या मल से उत्पन्न होता है या नहीं, दोनों में क्वासिएलोप्ड और गैर-छा/नग्न प्रजातियां मौजूद हैं।

जबकि GT1 और GT2 मुख्य रूप से विकासशील देशों में पाए जाते हैं केवल मल-मौखिक मार्ग के माध्यम से मनुष्यों को संक्रमित6, GT3, GT4 और GT7 मुख्य रूप से विकसित देशों में होते हैं1,,7 जलाशयों के रूप में सेवारत प्रजातियों की एक किस्म के साथ, उदाहरण के लिए, सूअर8,चूहा9,चिकन10,,11,हिरण12,नेवला13,बल्ले14,खरगोश15,,16,जंगली सूअर17 और कई और अधिक7, 18,,,19,ज़ूनोसिस7,20,18,,21,,22के सबूत प्रदान करते हैं । अपर्याप्त स्वच्छता स्थितियों के अलावा23 और दूषित खाद्य उत्पाद12,24,25,26, रक्ताधान और अंग प्रत्यारोपण के माध्यम से संचरण भी संभव है27,28.26 HEV जिगर सिरोसिस और जिगर की विफलता का एक आम कारण है29 विशेष रूप से पहले से मौजूद जिगर की बीमारी के साथ रोगियों में, इम्यूनोसमझे व्यक्तियों (जीनोटाइप 3, 4 और 7) और गर्भवती महिलाओं (जीनोटाइप 1) । ध्यान दें, हेमेटोपोइटिक रोग30 , 31,,32,,न्यूरोलॉजिकल विकार33और गुर्दे की चोट34 जैसे बाहरी अभिव्यक्तियां भी हैं।34

आज तक, ऑफ-लेबल दवा रिबाविरिन (आरबीवी) कई संक्रमित रोगियों35, 36,36के लिए पसंद का उपचार है। हालांकि, उपचार विफलता और खराब नैदानिक दीर्घकालिक परिणामों के मामलों की सूचना दी गई है । उपचार की विफलता को वायरल म्यूटेनेसिस से जोड़ा गया है और लंबे समय से संक्रमित रोगियों में वायरल विषमता में वृद्धि हुई है37,38,,39. इसके विपरीत, हाल ही में एक यूरोपीय पूर्वव्यापी मल्टीसेंटर अध्ययन आरबीवी उपचार विफलता40के लिए पॉलीमरेज म्यूटेशन को सहसंबंधित करने में सक्षम नहीं था। नैदानिक टिप्पणियों और इन विट्रो प्रयोगों में इंटरफेरॉन41,42, 43,,43सोफोस्बुविर44,,45,जिंक साल्ट46 और सिल्वेस्ट्रोल47,,48 ने भी एंटीवायरल प्रभाव दिखाया है।, बहरहाल, एक विशिष्ट HEV उपचार के लिए पाया जा रहा है, HEV जीवन चक्र और उसके रोगजनन के बारे में ज्ञान की कमी से बाधित । इसलिए, वायरलॉजिकल अध्ययनों के लिए एक मजबूत सेल कल्चर सिस्टम और नई एंटीवायरल दवाओं के विकास की तत्काल आवश्यकताहै।

दुर्भाग्य से, अन्य हेपेटाइटिस वायरस की तरह, एचईवी पारंपरिक सेल लाइनों में प्रचारित करना मुश्किल है और आमतौर पर बहुत धीरे-धीरे कम वायरल लोड की ओर बढ़ता है। फिर भी, कुछ समूह सेल लाइन उपकक्षों की पीढ़ी50 या मीडिया की खुराक51के समायोजन द्वारा वायरल भार को बढ़ावा देने में सक्षम थे। हाल ही में सीडीएनए क्लोन52 का उत्पादन और प्राथमिक रोगी का अनुकूलन 53,54को और बेहतर करके कोशिका संस्कृति55में एचईवी प्रचार में सुधार हुआ।54 इस प्रोटोकॉल में, हमने केर्नो-सी1 तनाव (जिसे p6_WT के रूप में संदर्भित किया जाता है)54 और एक उत्परिवर्ती तनाव को एक प्रतिकृति बढ़ाने वाले उत्परिवर्तन (जिसे p6_G1634R के रूप में संदर्भित)37के जीनोम का उपयोग किया। Kernow-C1 HEV सेल संस्कृति में सबसे अधिक बार इस्तेमाल किया तनाव है और उच्च वायरल भार का उत्पादन करने में सक्षम है । वायरल आरएनए कॉपी नंबरों का आकलन करके, एचईवी प्रतिकृति विट्रो में निगरानी की जा सकती है। इसके बावजूद ये तकनीकें पैदा किए जा रहे संक्रामक कणों की संख्या के आकलन की अनुमति नहीं देतीं । इसलिए, हमने फोकस फॉर्मिंग यूनिट्स (एफएफयू/एमएल) निर्धारित करने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला स्थापित किया है।

यहां वर्णित विधि५६ पूर्ण लंबाई संक्रामक वायरल कणों का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो प्राथमिक कोशिकाओं और स्तनधारी कोशिका लाइनों सहित विविध मूल से विभिन्न प्रकार के कोशिका प्रकारों को संक्रमित करने में सक्षम हैं । यह एचईवी संक्रमण और ट्रोपिज्म के महत्वपूर्ण पहलुओं को समझने के लिए एक मौलिक शर्त है। आमतौर पर सीमित रोगी आइसोलेशन के साथ टीका लगाने की कोई आवश्यकता नहीं है। प्लाज्मिड्स से संक्रामक एचईवी कणों का उत्पादन एक अनंत स्रोत बन गया है, जो इस प्रोटोकॉल को तुलनात्मक रूप से कुशल बनाता है। इसके अलावा, इस प्रणाली रिवर्स आनुवंशिकी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वीवो में की पहचान जीनोम परिवर्तन और HEV प्रतिकृति और फिटनेस पर उनके प्रभाव के अध्ययन को सक्षम करने । यह तकनीक कई सीमाओं पर काबू पा रही है और, दवा विकास, म्यूटेनेसिस अध्ययन और प्रतिबंध या प्रवेश कारकों जैसे वायरस-मेजबान इंटरैक्शन के मूल्यांकन के लिए रास्ता तय कर सकती है।

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Protocol

नोट: सभी प्रयोग बीएसएल-2 स्थिति के तहत किए जाते हैं। हेपेटाइटिस ई वायरस आरएनए या संक्रामक वायरस के संपर्क में आने वाली सभी सामग्रियों को निपटान से पहले हुड के अंदर एक अपशिष्ट कंटेनर से 4% कोहरसोलिन एफएफ के साथ ठीक से धोया जाना चाहिए।

1. प्लाज्मिड तैयारी

  1. 200 मिलीलीटर पौंड माध्यम जिसमें 100 μg/mL एम्पीसिलिन होता है जिसमें परिवर्तित एस्चेरिचिया कोलाई जेएम109 के साथ पूर्ण लंबाई वाले एचईवी जीटी3 केर्नो-सी 1पी6 अनुक्रम (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54 या pBluescript_SK_HEVp6-G1634R377 केलिए एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग शामिल है)। स्थायी आंदोलन (170 आरपीएम) के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: प्लाज्मिड अलगाव एक प्लाज्मिड निष्कर्षण किट का उपयोग करके किया गया था (सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. विनिर्माण प्रोटोकॉल के बाद, 6,000 x ग्राम पर रात भर संस्कृति के 200 एमएल नीचे स्पिन और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और सुपरनैंट त्यागें। बैक्टीरियल गोली को -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए और संग्रहीत किया जा सकता है।
    1. 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट और एक पिपेट मैन के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग करके रीसुस्पेन बफर के 4 एमएल में बैक्टीरियल पेलेट को फिर से खर्च करें। इसके अतिरिक्त, भंवर कड़ाई से।
    2. प्रीवार्मेड लाइसिस बफर (30-40 डिग्री सेल्सियस) का 4 एमएल जोड़ें। कई बार के लिए धीरे उलटा और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट ।
    3. बेअसर बफर के 4.8 एमएल जोड़ें, धीरे-धीरे उलटा और सुनिश्चित करें कि lysate मात्रात्मक रूप से बेअसर है (निर्माता का विवरण देखें)। फिर 11,000 x g पर सेंट्रलाइज और 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
    4. 1 एमएल नॉन-फिल्टर टिप के अंदर 2 सेमी x 2 सेमी मुल पीस रखें, 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट में लोड री सस्पेंड, लिस्ड और बेअसर सुपरनेट, सीरोलॉजिकल पिपेट की नोक के साथ 1 एमएल टिप डालें और एक नए 50 एमएल ट्यूब में सुपरनैट को फिल्टर करें।
      नोट: यदि आवश्यक हो तो सुपरनैंट को 30 मिनट तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    5. कई चरणों में कुल 4 फ़िल्टर कॉलम (किट में प्रदान) पर फ़िल्टर किए गए सुपरनेटेंट के 750 माइक्रोन लागू होते हैं और 30 एस के लिए 11,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र होते हैं। इस अनुक्रम को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी सुपरनैंट कॉलम फ़िल्टर पर लागू न हो जाए।
    6. प्रत्येक फ़िल्टर कॉलम को प्रीवार्मेड (50 डिग्री सेल्सियस) के 500 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं बफर एडब्ल्यू को 30 एस के लिए 11,000 x ग्राम पर धोएं और बाद में प्रवाह को त्यागें।
    7. प्रत्येक फ़िल्टर कॉलम को 30 एस के लिए 11,000 x ग्राम पर अपकेंद्री द्वारा वॉश बफर A4 के 600μL से धोएं। 2 मिनट के लिए 11,000 x g पर अपकेंद्रित्र द्वारा फ़िल्टर कॉलम को सुखाएं।
    8. फिल्टर कॉलम के केंद्र पर एल्यूशन बफर के 60 माइक्रोन स्थानांतरित करके प्रत्येक फ़िल्टर कॉलम से प्लाज्मिड डीएनए को एल्यूट करें। आरटी में 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट और 1 मिनट के लिए 11,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    9. एलुएट्स को मिलाएं और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निकाले गए प्लाज्मिड डीएनए की एकाग्रता को मापें।

2. रैखिकीकरण और डीएनए शुद्धि

Figure 1
   
चित्रा 1: प्लाज्मिड रैखिकीकरण और डीएनए शुद्धिकरण के लिए योजनाबद्ध प्रायोगिक सेटअप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नोट: रैखिकीकरण इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (चरण 3) के दौरान आरएनए उपज को बढ़ाता है

  1. प्लाज्मिड डीएनए(चित्रा 1)को रेखित करने के लिए टेम्पलेट डीएनए के 10 माइक्रोन को मिलाएं (चरण 1 में निकाला गया), बफर का 10 माइक्रोन, MluI का 2 माइक्रोन और एच2ओ के साथ 100 माइक्रोन की मात्रा में समायोजित करें।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट और एगरॉंग जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (उदाहरण के लिए, लोड गैर-पचाने और पचाने वाले प्लाज्मिड डीएनए [डीएनए के 1 माइक्रोन] द्वारा प्लाज्मिड के रैखिकीकरण की पुष्टि करते हैं और 1% एगर उठे जेल पर इलेक्ट्रोफोरेसिस चलाते हैं और 120 वी निरंतर वर्तमान में इलेक्ट्रोफोरेसिस चलाते हैं)।
  2. डीएनए निष्कर्षण के लिए निर्माताओं के प्रोटोकॉल का पालन करें (सामग्री की तालिकादेखें, चित्रा 1),किट में प्रदान की गई बाध्यकारी बफर के 500 माइक्रोन मिलाएं, जिसमें 100 माइक्रोनल रैखिक डीएनए है। एक फिल्टर कॉलम के लिए नमूना लागू करें, और 30 s के लिए १७,८०० x ग्राम पर अपकेंद्रित्र प्रवाह के माध्यम से त्यागें और फिल्टर कॉलम एक ही ट्यूब में वापस जगह है ।
    1. 30 एस के लिए 17,800 x ग्राम पर वॉश बफर और अपकेंद्रित्र के 650 माइक्रोन जोड़कर फिल्टर कॉलम धोएं। 30 एस के लिए फ्लो-थ्री को त्यागें और फिल्टर कॉलम को वापस उसी ट्यूब में रखें। अवशिष्ट वॉश बफर को हटाने के लिए, 60 एस के लिए 17,800 x ग्राम पर शुष्क अपकेंद्रित्र करें और प्रत्येक फ़िल्टर कॉलम को बाद में एक साफ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें।
    2. फिल्टर के केंद्र में प्रीवार्मेड एच2ओ (पीसीआर ग्रेड, 70 डिग्री सेल्सियस) के 60 माइक्रोन स्थानांतरित करके Elute डीएनए। 70 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट और 1 मिनट के लिए 18,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके शुद्ध डीएनए की एकाग्रता को मापें।
      नोट: इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन तक डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. पूर्ण लंबाई हेव जीनोटाइप 3 पी6 डीएनए और आरएनए शुद्धिकरण का इन-विट्रो ट्रांसक्रिप्शन

Figure 2
   
चित्रा 2: इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन और आरएनए शुद्धिकरण के लिए योजनाबद्ध प्रायोगिक सेटअप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नोट: इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्लाज्मिड डीएनए से वायरल जीनोमिक आरएनए का उत्पादन करने के लिए आवश्यक है।

  1. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन मिक्स के लिए 5x T7 ट्रांसक्रिप्शन बफर के 20 माइक्रोन, 10 एमएम डीटीटी, 100 यू ऑफ राइबोन्यूलेज अवरोधक, 25 एमएम एटीपी, सीटीपी और यूटीपी, 12.5 एमएम जीटीपी, 5 एमएम रिबो एम7जी कैप एनालॉग, 2 μg ऑफ रैखिक डीएनए टेम्पलेट, और 80 यू ऑफ टी7 आरएनए पॉलीमेरेज। नाभिक मुक्त एच2ओ के साथ 100 माइक्रोल तक भरें, 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
    नोट: 3.1 से 3.1.2 चरण के बाद -20 डिग्री सेल्सियस पर अल्पकालिक भंडारण संभव है।
    1. T7 आरएनए पॉलीमरेज के 2 माइक्रोन जोड़ें, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 2 घंटे के लिए अच्छी तरह से मिश्रण और इनक्यूबेट।
    2. प्रारंभिक डीएनए टेम्पलेट को पचाने के लिए, DNase (RNase मुक्त, 1 U/μL) के 7.5 माइक्रोन जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: गिरावट से बचने के लिए आरएनए के साथ काम करते समय आरएनए के लिए सतह विसंदूषक के साथ सभी सतहों और पिपेट को साफ करें। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि सभी प्रतिक्रिया ट्यूब RNase-मुक्त और बाँझ हैं। केवल फिल्टर के साथ सुझावों का उपयोग करें और पूरी तरह से RNase मुक्त और बाँझ पानी के साथ पतला ।
  2. आरएनए निष्कर्षण के लिए निर्माण के प्रोटोकॉल के बाद (सामग्री की तालिकादेखें, चित्रा 2),लाइसिस बफर के 330 माइक्रोन और प्रत्येक इन-विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया के लिए 100% इथेनॉल के 330 माइक्रोन मिलाकर लाइसिस बफर और 100% इथेनॉल का प्रीमिक्स तैयार करें। आरएनए और भंवर के 110 माइक्रोन में लाइसिस बफर-इथेनॉल प्रीमिक्स के 660 माइक्रोन जोड़ें। 30 एस के लिए 8000 x ग्राम पर एक फ़िल्टर कॉलम और अपकेंद्रित्र पर लोड नमूना प्रवाह को त्यागें और फिल्टर कॉलम को वापस उसी ट्यूब में रखें।
    1. 30 एस के लिए 8000 x ग्राम पर वॉश बफर और सेंट्रलाइज के 600 माइक्रोन जोड़ें। 10 एस फ्लो-थ्री को छोड़ें और फिल्टर कॉलम को वापस एक ही ट्यूब में रखें। अवशिष्ट वॉश बफर को हटाने के लिए 2 मिनट के लिए 8000 x ग्राम पर वॉश बफर और सेंट्रलाइज के 350 माइक्रोन जोड़ें। प्रत्येक फ़िल्टर कॉलम को एक साफ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें। फिल्टर कॉलम का ढक्कन खोलें और कॉलम को 3 मिनट के लिए सूखने दें।
    2. फिल्टर कॉलम के केंद्र में RNase मुक्त एच2ओ के 50 माइक्रोन रखकर Elute आरएनए। आरटी में 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट और बाद में 1 मिनट के लिए 8,000 x g पर अपकेंद्रित्र। एक एगर उठे जेल पर आरएनए के 1 माइक्रोल लोड करके आरएनए अखंडता की जांच करें और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निकाले गए आरएनए की एकाग्रता को मापें।
      नोट: इलेक्ट्रोपॉशन तक -80 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए स्टोर करें और गिरावट से बचने के लिए बर्फ पर विशेष रूप से आरएनए गल जाएं।

4. सेल संस्कृति व्युत्पन्न HEV (HEVcc) उत्पादन के लिए HepG2 कोशिकाओं की तैयारी

Figure 3
   
चित्रा 3: सेल संस्कृति के लिए हेपजी2 कोशिकाओं की तैयारी के लिए योजनाबद्ध प्रायोगिक सेटअप एचईवी (एचईवीसीसी) उत्पादन प्राप्त करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नोट: संदूषण से बचने के लिए, कोशिकाओं की तैयारी, इलेक्ट्रोपाउशन, संक्रमण, कटाई और सेल निर्धारण एक जैव सुरक्षा स्तर 2 सुविधा में बाँझ परिस्थितियों में किया गया । 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन कदम है कि कोशिकाओं को शामिल एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में पूरा किया गया।

  1. HEVcc उत्पादन(चित्रा 3)के लिए HepG2 कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, पूर्ण Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में बीज कोशिकाओं (तालिका 1देखें) एक 15 सेमी कोलेजन पर (तालिका 1 देखें, बाँझ फिल्टर PBS-एसीटिक एसिड मिश्रण कोलेजन जोड़ने से पहले ०.२ माइक्रोन जाल के माध्यम से) लेपित संस्कृति पकवान । 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जब तक कोशिकाओं को 90% ढुलमुल हैं।
    नोट: 90% कन्फ्लूएंंट कोशिकाओं वाले प्रत्येक 15 सेमी डिश 4 इलेक्ट्रोपाउशन के लिए पर्याप्त कोशिकाएं उत्पन्न करेंगे।
  2. धीरे-धीरे 1x पीबीएस के 10 एमएल के साथ एक बार प्लेट और वॉश सेल से माध्यम को हटा दें। कोशिकाओं पर 0.05% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 3 एमसीएल जोड़कर कोशिकाओं को ट्रिपसिनाइज करें और कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 10 एमएल डीएमईएम पूर्ण माध्यम में कोशिकाओं को पुनर्सुल व्यय करें और सेल निलंबन को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करें।
  3. चूंकि प्रत्येक इलेक्ट्रोपाउशन के लिए 5 x 106 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, इसलिए उचित मात्रा को एक नई 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 1x पीबीएस के साथ कम से कम 35 एमएल तक भरें। 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं और सेल पैलेट को परेशान किए बिना सुपरनेट को सावधानी से त्यागें।
  4. कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर 1x PBS के 35 एमएल के साथ एक बार फिर धोएं। कोशिकाओं को निलंबित रखने के लिए, बर्फ पर कोशिकाओं को रखें और अभी तक 1x पीबीएस को न हटाएं।

5. हेपजी2 कोशिकाओं का इलेक्ट्रोपॉशन

Figure 4
   
चित्रा 4: हेपजी2 कोशिकाओं के इलेक्ट्रोपाउरेशन के लिए योजनाबद्ध प्रायोगिक सेटअप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. हेपजी2 कोशिकाओं के विद्युतीकरण के लिए(चित्रा 4)2 एमएम एटीपी और 5 एमएम ग्लूटाथिएक के साथ साइटोमिक्स (टेबल 1देखें) के 384 माइक्रोन को पूरक करके प्रति इलेक्ट्रोपॉज को पूरा करें। उपयोग से पहले ताजा तैयार करें और सीधे बर्फ पर रखें।
    नोट: निम्नलिखित चरणों का सही अभी तक त्वरित निष्पादन महत्वपूर्ण है। इसलिए, सुनिश्चित करें कि सब कुछ ठीक से तैयार किया गया है।
  2. सावधानी से चरण 4.4 से सेल गोली परेशान किए बिना 1x पीबीएस हटा दें। 400 माइक्रोन में 5 x10 6 कोशिकाओं को फिर से आता है और चरण 3.2.2 से 5 माइक्रोन आरएनए जोड़ें। एक इलेक्ट्रोपॉपरेशन सिस्टम के साथ 20 एमएस के लिए 975 माइक्रोन, 270 वी के साथ एक बार 4 मिमी क्यूवेट और पल्स में समाधान स्थानांतरित करें।
    1. इलेक्ट्रोपाउशन ट्रांसफर कोशिकाओं के बाद 11 एमएल डीएमईएम प्रति इलेक्ट्रोपाउरेशन पूरा करने के लिए एक पाश्चर पिपेट के साथ जितनी जल्दी हो सके कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि आरएनए सफलतापूर्वक HepG2 कोशिकाओं में संक्रमित है, एक ट्रांसफैक्शन नियंत्रण (टीसी) किया जाएगा । अपेक्षित ट्रांसफेक्शन दर ओआरएफ 2-सकारात्मक कोशिकाओं के 40-60% के बीच भिन्न होती है।
  3. कोलेजन के साथ लेपित 10 सेमी कल्चर डिश में इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं के 10 एमएल ट्रांसफर करें। कवर स्लिप (बाद में ट्रांसफेक्शन नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाने वाला कोलेजन-लेपित 24-माइक्रोटिट्र प्लेट के एक कुएं में 1.3 x 105 इलेक्ट्रोप्रोरेटेड कोशिकाओं (300 माइक्रोलीटर) जोड़ें। कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    1. 24 घंटे के बाद, 10 सेमी डिश के माध्यम को बदलें और 10 एमएल ताजा डीएमईएम पूर्ण के साथ बदलें। ट्रांसफेक्शन कंट्रोल का माध्यम न बदलें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 6 दिनों के लिए इनक्यूबेट।
  4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग प्रोटोकॉल (चरण 8) के साथ जारी रखकर सेल घनत्व के आधार पर 24 वेल प्लेट 5-7 डी पोस्ट इलेक्ट्रोपॉशन में ट्रांसफैक्शन नियंत्रण बंद करें। ट्रांसफैक्शन दक्षता की गणना कोशिकाओं की कुल संख्या के लिए सामान्य रूप से की गई ORF2 सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या की गणना करके की जाती है।

6. इंट्रा- और एक्सट्रासेलुलर एचईवीसीसी की कटाई

Figure 5
   
चित्रा 5: इंट्रा हार्वेस्टिंग इंट्रा-और एक्स्ट्रासेलुलर एचईवीसीसी के लिए योजनाबद्ध प्रायोगिक सेटअप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. किसी भी कोशिका मलबे को हटाने के लिए 0.45 माइक्रोन जाल के माध्यम से 6 दिनों (चरण 5.3.1) के बाद 10 सेमी डिश से प्राप्त सुपरनेट को फ़िल्टर करने के लिए, एक्सपेरिमेंटल एचईवीसीसी(चित्रा5) को फ़िल्टर करें। एक ही दिन के संक्रमण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर काटा एक्स्ट्रासेलुलर एचईवीसीसी स्टोर करें, अन्यथा -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. इंट्रासेलुलर एचईवीसीसी(चित्रा 5)की कटाई के लिए, 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं और 0.05% ट्राइपसिन-ईडीटीए के 1.5 एमएल जोड़कर ट्रिपसिनाइज करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जब तक कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग कर रहे हैं। डीएमईएम के 10 एमएल पूर्ण, फ्लश प्लेट को अलग कोशिकाओं और स्थानांतरित कोशिकाओं को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं। 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    1. सुपरनेट को त्यागें और डीएमईएम के 1.6 एमएल में सेल पेलेट को विद्युत निगम को पूरा करें। सेल निलंबन को 2 एमएल रिएक्शन ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: बड़ी मात्रा का उपयोग न करें क्योंकि यह नाटकीय रूप से वायरल लोड को कम करेगा।
    2. फ्रीज (तरल नाइट्रोजन में) और गल कोशिकाओं। इस क्रम को 3 बार दोहराएं।
      नोट: 3 फ्रीज और गल चक्र के लिए एक से अधिक इलेक्ट्रोपाउशन (1.6 एमएल) पूल न करें क्योंकि लाइसिस दक्षता बिगड़ जाएगी। चक्रों के बीच में सेल निलंबन भंवर मत करो। वायरल भार को अधिकतम करने के लिए धीरे-धीरे (जैसे, कमरे का तापमान या बर्फ पर) सेल निलंबन को पिघलाना सुनिश्चित करें।
    3. उच्च गति अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर lysed कोशिकाओं को अलग सेल मलबे के लिए । सुपरनिटेंट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। संक्रमण के लिए सुपरनेट लें, अन्यथा -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. वैकल्पिक रूप से, वायरल लोड (निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार) को बढ़ाने के लिए एक सांद्रता का उपयोग करके अतिरिक्त और इंट्रासेलुलर एचईवीसीसी को केंद्रित करें।

7. इंट्रा-और एक्स्ट्रासेलुलर एचईवीसीसी के साथ हेपजी2/C3A कोशिकाओं का संक्रमण

Figure 6
   
चित्रा 6: अंतर और बाह्य एचईवीसीसी के साथ HepG2/C3A कोशिकाओं के संक्रमण के लिए योजनाबद्ध प्रायोगिक सेटअप । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नोट: HepG2/C3A कोशिकाओं के संक्रमण यह सुनिश्चित करेगा कि संक्रामक कणों का उत्पादन किया गया । इसके अतिरिक्त, काटा इंट्रासेलुलर और बाह्य कोशिकीय HEVcc के टाइटेशन का उपयोग एफएफयू/एमएल में वायरस टाइटर्स की गणना करने के लिए किया जाता है । इसे बाद में इंफेक्शन कंट्रोल (आईसी) कहा जाएगा।

  1. HEVCC संक्रमण(चित्रा 6),प्रीवार्म मिनिमल एसेंशियल मीडियम (एमईएम) कंप्लीट (टेबल 1देखें) से 37 डिग्री सेल्सियस के लिए HepG2/C3A कोशिकाओं को तैयार करने के लिए।
    1. बीज 2 x 104 कोशिकाओं/अच्छी तरह से १०० μL में कोलेजन लेपित ९६ अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट पर एक दिन पहले कदम 6 । आंतरिक 60 कुओं के अंदर माध्यम के वाष्पीकरण को रोकने के लिए सबसे बाहरी कुओं को 1x पीबीएस के साथ भरना सुनिश्चित करें। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    2. एक दिन पहले वरीयता प्राप्त हेपजी2/C3A कोशिकाओं में सुपरनैट (चरण 6.1 से) के 50 माइक्रोन जोड़कर अतिरिक्त सेलसेलुलर एचईवीसीसी से संक्रमित करें। ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं और अगले कुएं में 50 माइक्रोन स्थानांतरित करके छह बार 1:3 को क्रमिक रूप से पतला करें। तकनीकी प्रतिकृति के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने के डुप्लिकेट प्रदर्शन करते हैं।
    3. 25 μL सुपरनैटेंट (चरण 6.2.3 से) को हेपजी2/C3A कोशिकाओं में जोड़कर इंट्रासेलुलर एचईवीसीसी से संक्रमित करें। ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं और अगले कुएं में 25 माइक्रोन स्थानांतरित करके छह बार 1:5 को क्रमिक रूप से पतला करें। तकनीकी प्रतिकृति के लिए डुप्लिकेट धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 डी के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रोटोकॉल (चरण 8) के साथ जारी रखकर संक्रमण को रोकता है।

8. इम्यूनोफ्लोरेसेंस ट्रांसफैक्शन और संक्रमण नियंत्रण का धुंधला

Figure 7
   
चित्रा 7: ट्रांसफैक्शन और संक्रमण नियंत्रण के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए योजनाबद्ध प्रयोगात्मक सेटअप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग(चित्रा 7)के लिए, 1x पीबीएस के साथ 3x धोएं और 350 माइक्रोन (ट्रांसफैक्शन कंट्रोल [टीसी]) या 50 माइक्रोन (संक्रमण नियंत्रण [आईसी]) को 4% निर्धारण समाधान के रूप में वितरित करके कोशिकाओं को ठीक करें। आरटी में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट और ध्यान से बाद में 1x PBS के साथ दो बार धोने ।
    नोट: प्रोटोकॉल ट्रांसफैक्शन नियंत्रण के लिए यहां रुका जा सकता है जब तक HepG2/C3A कोशिकाओं के संक्रमण के रूप में अच्छी तरह से बंद कर दिया है । अच्छी तरह से प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए पैराफिल्म के साथ सील भी करें।
  2. आरटी में 5 मिनट के लिए 0.2% ट्राइटन एक्स-100 (1 × पीबीएस में) के 350 माइक्रोल (टीसी) या 50 माइक्रोल (आईसी) जोड़कर कोशिकाओं को पार करें। फिर ध्यान से 1x PBS के साथ दो बार धोने और 350 μL (टीसी) या 50 μL (आईसी) के साथ 5% घोड़ा सीरम (1x PBS में) के साथ दो बार धोने के लिए एक कक्षीय शेखर (30 आरपीएम) पर लगातार आंदोलन के तहत आरटी में 1 घंटे के लिए।
    नोट: एक नम ऊतक के अंदर और शीर्ष पर एक पैराफिन फिल्म परत रखकर छोटे प्लास्टिक पकवान (30 मिमी) तैयार करें, एक आर्द्र कक्ष बना रहे हैं। फिर पैराफिन फिल्म पर सामना करना पड़ टीसी कवर पर्ची हस्तांतरण । टीसी के लिए निम्नलिखित कदम आर्द्र कक्ष में निष्पादित किया जाएगा।
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी एंटी-ओआरएफ2 8282 (एचईवी-विशिष्ट खरगोश हाइपरइम्यून सीरम, 5% हॉर्स सीरम में 1:5,000) प्रति अच्छी तरह से 70 माइक्रोल (टीसी) या 25 माइक्रोल (आईसी) जोड़ें और एक ऑर्बिटल शेकर (30 आरपीएम) पर लगातार आंदोलन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    1. ध्यान से 1x पीबीएस के साथ दो बार धोएं और माध्यमिक एंटीबॉडी बकरी विरोधी खरगोश 488 (5% हॉर्स सीरम में 1:1,000) के 70 माइक्रोन (टीसी) या 25 माइक्रोन (आईसी) जोड़ें। अंधेरे में एक कक्षीय शेखर (30 आरपीएम) पर लगातार आंदोलन के तहत 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट। फिर, ध्यान से 1x PBS के साथ दो बार धोने
  4. DAPI के 70 माइक्रोल (टीसी) या 25 माइक्रोन (आईसी) (एच2ओ में 1:10,000) जोड़ें और 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ध्यान से एच2ओ के साथ दो बार धोएं। आर्द्र कक्ष से कवर स्लिप निकालें, बढ़ते अभिकर् य के 6 माइक्रोन के साथ माउंट कवर स्लिप एक कवर स्लाइड पर उल्टा (केवल टीसी के लिए) और अंधेरे में आरटी में 16 घंटे के लिए बढ़ते अभिकर् प सूखी चलो । इमेजिंग तक पानी में आईसी स्टोर करें और वाष्पीकरण के कारण सूखने से बचने के लिए पैराफिन फिल्म के साथ प्लेट को सील करें।
  5. सफल ट्रांसफैक्शन और संक्रमण की पुष्टि करने के लिए छवियां लें।
    नोट: तुलनात्मक परिणाम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विरोधी ORF2 1E6 एंटीबॉडी57 (5% घोड़े सीरम में 1:200) और एक माध्यमिक एंटीबॉडी गधा विरोधी माउस (5% हार्स सीरम में 1:1,000) का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे

9. एफएफयू दृढ़ संकल्प

नोट: एक FFU को कम से कम तीन नकारात्मक कोशिकाओं द्वारा एक और एफएफयू से अलग एक या अधिक ORF2-सकारात्मक कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया है।

  1. एक्स्ट्रासेलुलर एचईवीसीसी के लिए दो सबसे कम कमजोर पड़ने में दो कुओं के सभी ORF2-सकारात्मक foci गिनती शुरू करते हैं । कुल चार कुओं की गणना होनी चाहिए। प्रति मिलीलीटर फोकस बनाने वाली इकाइयों (एफएफयू) की गणना निम्नलिखित समीकरण के साथ की जा सकती है:

    Equation 1
    नोट: अपेक्षित टाइटर्स 10 2 और5 x 104 FFU/mL के बीच बदलती हैं ।
  2. इंट्रासेलुलर एचईवीसीसी के लिए कुओं में सभी ORF2-सकारात्मक फोसी की गिनती शुरू करें जहां 50 से 100 फोसी के बीच मनाया जाता है। इसके अतिरिक्त, अगले उच्च कमजोर पड़ने में दो कुओं की गिनती करें। कुल चार कुओं की गणना होनी चाहिए। प्रति मिलीलीटर फोकस बनाने वाली इकाइयों (एफएफयू) की गणना निम्नलिखित समीकरण के साथ की जा सकती है:

    Equation 2
    नोट: अपेक्षित टाइटर्स 10 5 और3 x 106 FFU/mL के बीच बदलती हैं । कारक 20x और 40x का उपयोग 50 माइक्रोन और 25 माइक्रोन से 1 मिलीएल तक एफएफयू की संख्या को एक्सट्रपलेट करने के लिए किया जाता है और तदनुसार अनुकूलित किया जा सकता है।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, हम उच्च टाइटर संक्रामक एचईवीसीसी के उत्पादन का वर्णन करते हैं। पहला कदम प्लाज्मिड डीएनए (pBluescript_SK_HEVp654 और pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, चित्रा 8a)को अलग करना है, जिसे तब प्रतिबंध पाचन द्वारा रैखिक किया जाता है और इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन(चित्र 1)के लिए शुद्ध किया जाता है। एक सफल रैखिकीकरण को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके पचाए गए प्लाज्मिड-डीएनए से गैर-पचाए गए प्लाज्मिड-डीएनए की तुलना करके सत्यापित किया जा सकता है। एक आकार-बदलाव के अलावा, केवल एक डीएनए बैंड रैखिक रूप का प्रतिनिधित्व करते हुए दिखाई देना चाहिए। रैखिकीकरण तब पूरा होता है जब रैखिक रूप के ऊपर और नीचे दो अन्य बैंड, क्रमशः निकेड सर्कल और सुपरकॉइल्ड फॉर्म का प्रतिनिधित्व करते हैं, पूरी तरह से कम हो जाते हैं(चित्र 8b)। शुद्ध डीएनए की उपज 150 एनजी/माइक्रोन से अधिक होनी चाहिए। केवल अगर इन विशेषताओं सच पकड़ रैखिक डीएनए इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । इन विट्रो लिखित आरएनए को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके अच्छी तरह से जांचा जाना चाहिए और कम आरएनएएस अबुंडेंसी के मामले में धुंधली धब्बा(चित्रा 8c)के बजाय अलग बैंड दिखाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, शुद्ध आरएनए उपज 500 एनजी/μL से अधिक होना चाहिए इन विट्रो लिखित आरएनए(चित्रा 2)अंततः वायरस उत्पादन के लिए हेपजी2 कोशिकाओं में विद्युतीकृत है(चित्रा 3 और चित्रा 4)। सफल इलेक्ट्रोपाउशन की निगरानी ट्रांसफैक्शन कंट्रोल(चित्र 9 ए)के इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा की जाती है। ट्रांसफेक्शन एफिशिएंसी 40%(चित्रा 9b)से अधिक होनी चाहिए। एक प्रतिकृति की कमी उत्परिवर्ती एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, ORF2 धुंधला की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए, के रूप में कोई ORF2 अभिव्यक्ति की उंमीद है(चित्रा 9c)। इनक्यूबेशन के 7 दिनों के बाद छा (बाह्य) एचईवीसीसी को सेल कल्चर सुपरनेट को इकट्ठा और फ़िल्टर करके काटा जाता है। गैर-छा (इंट्रासेल्युलर) एचईवीसीसी कोशिकाओं से कई फ्रीज और गल चक्र द्वारा जारी किया जाता है। किसी भी सेल मलबे को हटाने के लिए सेल lysate उच्च गति(चित्रा 5)पर अपकेंद्रित्र है । इसके बाद, दोनों HEVcc प्रजातियों धारावाहिक कमजोर पड़ने(चित्रा 6 और चित्रा 9d)द्वारा HepG2/C3A कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए उपयोग किया जाता है । ऊपर समीकरणों के अनुसार (चरण 9 देखें) वायरल टाइटर्स FFU गणना द्वारा निर्धारित किए जाते हैं।

प्रतिनिधि परिणाम चित्र 9में चित्रित कर रहे हैं । ट्रांसफैक्शन नियंत्रण में लगभग 50% ORF2-सकारात्मक कोशिकाएं शामिल होनी चाहिए ताकि वायरस की एक कुशल मात्रा का उत्पादन किया जा सके(चित्र 9ए, बी)। कम ORF2-सकारात्मक कोशिकाओं को कम टाइटर होगा । प्रोटोकॉल में उल्लिखित चरणों का ठीक पालन करने से टाइटर्स उत्पन्न होंगे जो गैर-लिफाफे (इंट्रासेलुलर) एचईवीसीसी के लिए 105 और 3 x10 6 एफएफयू/एमएल के बीच भिन्न होते हैं। 102 और 5 x104 FFU/mL के बीच छा (बाह्य) HEVcc titers के लिए(चित्रा 9e)की उम्मीद कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, G1634R उत्परिवर्ती के लिए ऊंचा FFU मायने रखता है मनाया गया । जीनोम प्रतियों और संक्रामक वायरल कणों के बीच अनुपात की गणना करते समय p6_WT और p6_G1634R दोनों के लिए उत्पादित इंट्रासेलुलर एचईवीसीसी को बाह्य एचईवीसीसी की तुलना में कम पाया गया, जो गैर-लिफाफा एचईवी प्रजातियों(चित्रा 9f)की उच्च विशिष्ट संक्रमितता का सुझाव देता है।

Figure 8
   
चित्रा 8: इन विट्रो लिखित आरएनए की पीढ़ी।
(क)अलग-थलग प्लाज्मिड-डीएनए के अवशोषित स्पेक्ट्रम का उदाहरण। (ख)नॉन-डाइजेस्ट और पचाए गए प्लाज्मिड-डीएनए के जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस । (ग)इन विट्रो लिखित आरएनए के जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
   
चित्रा 9: उच्च टाइटर HEVcc उत्पादन के प्रतिनिधि परिणाम।
(ए)इलेक्ट्रोपोरेटेड हेपजी2 कोशिकाओं का ट्रांसफेक्शन नियंत्रण। संक्रमित कोशिकाओं को एंटी-ओआरएफ2 एंटीबॉडी (ग्रीन, एलएस-बायो) और डीएपीआई (नीला) से सना हुआ था। (ख)ट्रांसफैक्शन दक्षता की गणना कुल कोशिकाओं की संख्या में सामान्यीकृत ORF2-सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या द्वारा की गई थी । (ग)एक प्रतिकृति की कमी उत्परिवर्ती इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, ORF2 विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए । (D)FFU दृढ़ संकल्प के लिए उत्पादित वायरस स्टॉक के धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन किया गया । ORF2 सकारात्मक कोशिकाओं को सफेद रंग में चित्रित किया गया है। (ई)वायरल टाइटर्स की गणना एफएफयू काउंटिंग द्वारा की गई थी और(एफ)वायरल लोड का निर्धारण क्यूपीसीआर द्वारा किया गया था और इसे फ्यू/एमएल में सामान्यीकृत किया गया था । बार क्रमशः 38 और 10 स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब और मानक विचलन दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कार्य समाधान एकाग्रता आयतन
कोलेजन 40 एमएल Pbs
40 माइक्रोन एसिटिक एसिड
1 एमएल कोलेजन आर समाधान 0.4% बाँझ
साइटोमिक्स 120 mm केसीएल
0.15 mM सीएसीएल2
10 mm K2एचपीओ4 (पीएच 7.4)
25 एमएमएम हेपेस
2 mM ईजीटीए
डीएमईएम पूरा 500 एमएल डीएमईएम
5 एमएल पेन/स्ट्रेप
5 एमएल एमईएम एनईएए (100X)
5 एमएल एल-ग्लूटामिन
50 एमएल भ्रूण गोजातीय सीरम
एमईएम पूरा 500 एमएल Mem
5 एमएल सोडियम पायरुवेट
5 एमएल जेनटामाइसिन
5 एमएल एमईएम एनईएए (100X)
5 एमएल एल-ग्लूटामाइन
50 एमएल अल्ट्रा-लो आईजीजी

तालिका 1: बफर संरचना की तालिका।

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Discussion

प्लाज्मिड तैयारी के साथ शुरू, डीएनए पैदावार १५० एनजी/μL से अधिक होना चाहिए एक ही प्लाज्मिड स्टॉक से कई रैखिकीकरण करने में सक्षम होना चाहिए, जो महत्वपूर्ण जीनोम दृश्यों के बैक्टीरिया प्रेरित म्यूटाजेनिस के जोखिम को कम करता है । इसके अलावा, जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस(चित्र 8बी)द्वारा पूर्ण प्लाज्मिड रैखिकीकरण के लिए प्रतिबंध डाइजेस्ट की जांच करना महत्वपूर्ण है। रैखिक प्लाज्मिड डीएनए की कमी रोलिंग सर्कल प्रवर्धन को प्रेरित करेगी जिससे इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन कम कुशल हो जाएगा। इसके अलावा, आरएनए अखंडता के नमूने के भीतर RNases की बहुतायत का मूल्यांकन करने की पुष्टि की जानी चाहिए(चित्रा 8c)। तभी लक्ष्य कोशिकाओं के विद्युतीकरण पर विचार किया जाना चाहिए। ध्यान दें, HepG2 कोशिकाओं की तैयारी के साथ शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि सब कुछ हाथ में है और अच्छी तरह से तैयार लंबी प्रतीक्षा अवधि से परहेज करते हैं । विशेष रूप से, इलेक्ट्रोपॉनेशन तक साइटोमिक्स में कोशिकाओं और आरएनए के कम समय के भंडारण को आश्वस्त करें। इलेक्ट्रोपाउशन के दौरान कोशिकाओं के हीटिंग को दरकिनार करने के लिए बर्फ पर बफर को पहले से ठंडा करना आवश्यक है। नाड़ी की अवधि 20-25 एमएस और 270 वी से अधिक नहीं होनी चाहिए। इलेक्ट्रोपाउशन के बाद कोशिकाओं को कोशिका व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए ताजा माध्यम में त्वरित हस्तांतरण की आवश्यकता होती है। लक्ष्य कोशिकाओं के संक्रमण से पहले, टीसी ORF2-सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत के लिए जांच की जानी चाहिए । यदि टीसी कोई ORF2-सकारात्मक कोशिकाओं को दिखाता है तो यह सबसे अधिक संभावना है कि इलेक्ट्रोपाउशन विफल हो गया है या धुंधला काम नहीं करता है, और प्रयोग को दोहराया जाना चाहिए।

जब कटाई इंट्रासेलुलर एचईवीसीसी फ्रीज और गल चक्र की गति पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। वायरल टाइटर्स को -80 डिग्री सेल्सियस के बजाय तरल नाइट्रोजन में ठंड को निष्पादित करके बढ़ाया जा सकता है। इसके विपरीत, विगलन को बर्फ पर भंडारण का सुझाव देने के लिए सबसे धीमी तरीका लेना चाहिए जब तक कि सेल निलंबन पूरी तरह से समाप्त न हो जाए। फिर भी, कमरे के तापमान पर सेल निलंबन को गलना भी संभव है, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर या पानी के स्नान में, हालांकि तेजी से विगलन को निष्पादित किया जाएगा और टाइटर्स कम हो जाएंगे।

निम्नलिखित प्रयोगों के आधार पर वायरल टाइटर्स के नाटकीय नुकसान के बिना एमईएम पूर्ण या 1x पीबीएस में फ्रीज और गल चक्र करना भी संभव है, हालांकि, किसी को यह ध्यान में रखना चाहिए कि यह अंतर्कोशिकीय एचईवीसीसी को इंट्रासेलुलर एचईवीसीसी की तुलना में एक अलग माध्यम में होने का कारण बनता है।

प्रोटोकॉल के इन महत्वपूर्ण चरणों के बाद, अपेक्षित टाइटर्स गैर-छा (इंट्रासेल्युलर) एचईवीसीसी के लिए 105 और 3 x10 6 एमएल के बीच भिन्न होते हैं। 102 और 5 x 104 FFU/mL के बीच छा (बाह्य) HEVcc titers के लिए(चित्रा 9e)की प्रतीक्षा कर रहे हैं । अब तक, एचईवी सेल कल्चर सिस्टम को नियोजित करने वाले अध्ययन मुख्य रूप से क्यूपीसीआर द्वारा वायरल प्रतिकृति और प्रचार की निगरानी करते हैं। आरएनए जीनोम प्रतियों का आकलन अभी तक विधानसभा और संक्रामक कणों की रिहाई में कोई अंतर्दृष्टि प्रदान करता है ।

एक पिछले अध्ययन५८ सफलतापूर्वक प्रचारित रोगी १०३ TCID50/एमएल के अधिकतम titers के साथ सेल संस्कृति में अलग । जैसा कि हाल ही में दिखाया गया है, सेल संस्कृति में एचईवीसीसी को सफलतापूर्वक पारित करना और हमारे प्रोटोकॉल को अन्य उपभेदों जैसे 47832c और 83-2 के अनुकूल बनाना भी संभव है जो अतिवर्णीय क्षेत्र56में प्रविष्टि को आश्रय नहीं देते हैं। इसके अलावा, क्या रोगी व्युत्पन्न दृश्यों ब्लूस्क्रिप्ट वेक्टर रीढ़ में क्लोन किया जा सकता है और अभी भी उच्च वायरल titers उपज परीक्षण नहीं किया गया था । शुरू की विधि के साथ, गैर छा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से छा वायरल कणों काटा जा सकता है और इस तरह के A549 के रूप में भोली सेल लाइनों की एक किस्म टीका लगाने के लिए इस्तेमाल किया, Huh7.5, जीजी-3 और प्राथमिक मानव और पोर्सिन हेपेटोसाइट्स, भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए लाभ प्रदान करते हैं जैसे एचईवी ट्रोपिज्म, रोगजनन, दवा विकास, वायरल और मेजबान बातचीत, निष्क्रियता अध्ययन, एंटीबॉडी को बेअसर करना और कई और अधिक।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम हेपेटाइटिस ई वायरस p6 क्लोन के लिए सुजान इमर्सन के आभारी हैं। हेव-विशिष्ट खरगोश हाइपरइम्यून सीरम को रेनर उल्रिच, फ्रेडरिक लोफलर इंस्टीट्यूट, जर्मनी द्वारा कृपया प्रदान किया गया था। इसके अलावा, हम रूर विश्वविद्यालय बोचम में आणविक और चिकित्सा विषाणु विज्ञान विभाग के सभी सदस्यों को उनके समर्थन और चर्चा के लिए धन्यवाद देते हैं । आंकड़े 1-7 BioRender.com के साथ उत्पन्न किए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm mesh Sarstedt 83.1826 Harvest extracellular Virus
4 % Histofix CarlRoth P087.4 Immunofluorescence
Acetic acid CarlRoth 6755.1 Collagen working solution
Amicon Ultra-15 Merck Millipore UFC910024 Virus harvesting
Ampicillin Sigma-Aldrich A1593 Selection of transformed bacteria
ATP Roche 11140965001 in vitro transcription and electroporation
BioRender BioRender Figure Generation
CaCl2 Roth 5239.2 Cytomix
Collagen R solution 0.4 % sterile Serva 47256.01 Collagen working solution
CTP Roche 11140922001 in vitro transcription
Cuvette Biorad 165-2088 Electroporation
DAPI Invitrogen D21490 Immunofluorescence
DMEM gibco 41965-039 Cell culture
DNAse Promega M6101 in vitro transcription
DTT Promega included in P2077 in vitro transcription
EGTA Roth 3054.3 Cytomix
Escherichia coli JM109 Promega L2005 Transformation
Fetal bovine serum gibco 10270106 Cell culture
Fluoromount SouthernBiotech 0100-01 Immunofluorescence
GenePulser Xcell Electroporation System BioRad 1652660 Electroporation
Gentamycin gibco 15710049 Cell culture
GTP Roche 11140957001 in vitro transcription
H2O Braun 184238001 Immunofluorescence
Hepes Invitrogen 15630-03 Cytomix
Horse serum gibco 16050122 Immunofluorescence
K2HPO4 Roth P749.1 Cytomix
KCL Roth 6781.3 Cytomix
KH2PO4 Roth 3904.2 Cytomix
L-Glutamin gibco 25030081 Cell culture
L-Glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251-5G Cytomix
MEM gibco 31095-029 Cell culture
MEM NEAA (100×) gibco 11140-035 Cell culture
MgCl2 Roth 2189.2 Cytomix
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One Thermo Fisher ND-ONE-W DNA/RNA concentration
MluI enzyme NEB R0198L Linearization
NEB buffer NEB included in R0198L Linearization
NucleoSpin Plasmid kit Macherey & Nagel 740588.250 Plasmid preparation
NucleoSpin RNA Clean-up Kit Macherey & Nagel 740948.250 RNA purification
PBS gibco 70011051 Cell culture
Pen/Strep Thermo Fisher 15140122 Cell culture
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) Todt et.al Virus production
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) Shukla et al. GenBank accession no. JQ679013 Virus production
Primary antibody 1E6 LS-Bio C67675 Immunofluorescence
Primary antibody 8282 Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 DNA extraction
Ribo m7G Cap Analog Promega P1711 in vitro transcription
RNase away CarlRoth A998.3 RNA purification
RNasin (RNase inhibitor) Promega N2515 in vitro transcription
Secondary antibody donkey anti-mouse 488 Thermo Fisher A-21202 Immunofluorescence
Secondary antibody goat anti-rabbit 488 Thermo Fisher A-11008 Immunofluorescence
Sodium Pyruvat gibco 11360070 Cell culture
T7 RNA polymerase Promega P2077 in vitro transcription
Transcription Buffer Promega included in P2077 in vitro transcription
Triton X-100 CarlRoth 3051.3 Immunofluorescence
Trypsin-EDTA (0.5 %) gibco 15400054 Cell culture
ultra-low IgG gibco 1921005PJ Cell culture
UTP Roche 11140949001 in vitro transcription

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 160 हेपेटाइटिस ई वायरस क्वासिएलोप्ड संक्रामक वायरल कण सेल संस्कृति फोकस बनाने वाली इकाइयां वायरस उत्पादन एकल फंसे आरएनए वायरस
उच्च टाइटर हेपेटाइटिस ई वायरस स्टॉक्स के उत्पादन के लिए एक सेल संस्कृति मॉडल
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Meister, T. L., Klöhn, M.,… More

Meister, T. L., Klöhn, M., Steinmann, E., Todt, D. A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks. J. Vis. Exp. (160), e61373, doi:10.3791/61373 (2020).

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