Summary
Descrito aqui é um método eficaz sobre como produzir altos estoques virais de vírus de hepatite E (HEV) para infectar eficientemente as células hepatomas. Com o método apresentado, tanto não envolta, quanto partículas virais envoltas podem ser colhidas e utilizadas para inocular várias linhas celulares.
Abstract
O vírus da hepatite E é a principal causa de cirrose hepática e insuficiência hepática com prevalência crescente em todo o mundo. O vírus RNA de uma única cadeia é predominantemente transmitido por transfusões de sangue, condições sanitárias inadequadas e produtos alimentares contaminados. Até o momento, a droga fora do rótulo ribavirin (RBV) é o tratamento de escolha para muitos pacientes. No entanto, um tratamento específico de HEV ainda precisa ser identificado. Até agora, o conhecimento sobre o ciclo de vida hev e a patogênese tem sido severamente dificultado devido à falta de um sistema eficiente de cultura celular HEV. Um sistema de cultura celular robusto é essencial para o estudo do ciclo de vida viral que também inclui a patogênese viral. Com o método descrito aqui pode-se produzir titers virais de até 3 x 106 unidade de formação de foco/mL (FFU/mL) de HEV não envolto e até 5 x 104 FFU/mL de HEV envolto. Usando essas partículas, é possível infectar uma variedade de células de diversas origens, incluindo células primárias e humanas, bem como linhas de células animais. A produção de partículas infecciosas de HEV a partir de plasmídeos representa uma fonte infinita, o que torna este protocolo extremamente eficiente.
Introduction
A hepatite E é uma doença bastante subestimada com aumento da prevalência em todo o mundo. Cerca de 20 milhões de infecções resultam em mais de 70.000 mortes por ano1. O agente subjacente, o vírus da Hepatite E (HEV), foi transferido recentemente e agora é classificado dentro da família Hepeviridae, incluindo os gêneros Ortohepevirus e Piscihepevirus. HEV de várias origens são classificados dentro da espécie Orthohepevirus A-D, incluindo isolados de humanos, suínos, coelhos, ratos, aves e outros mamíferos2. Atualmente, foram identificados oito genótipos diferentes (GT) do vírus RNA de rna de apenas encalhe positivamente2. Embora diferam em sua identidade sequencial, rotas de transmissão e distribuição geográfica, sua estrutura genômica é altamente conservada. Mais específico, o genoma HEV de 7,2 kbp é dividido em 3 principais quadros de leitura aberta (ORF1-3). Enquanto o ORF1 codifica todas as enzimas necessárias para uma replicação bem sucedida dentro da célula hospedeira, o ORF2 codifica a proteína capsid, e a proteína ORF3 opera como um canal de íon funcional necessário para montagem e liberação de partículas infecciosas3. Uma vez liberado no lúmen basal ou apical HEV existe em ambas as espécies quasienveloped e não-envolto/nu, dependendo se o vírus se origina de sangue ou fezes,respectivamente 4,5.
Enquanto GT1 e GT2 são encontrados principalmente em países em desenvolvimento infectandoapenas humanos 6 através da rota fecal-oral, GT3, GT4 e GT7 ocorrem predominantemente nos países desenvolvidos1,7 com uma variedade de espécies servindo como reservatórios, por exemplo, suíno8, rato9, frango10,11, veado12, mangusto13, morcego14, coelho15,16, javali selvagem17 e muito mais7,18,19, fornecendo evidências de zoonose7,20,21,22. Além das condições sanitárias inadequadas23 e dos produtos alimentícios contaminados12,24,,25,,26, a transmissão via transfusão de sangue e transplantes de órgãos também é possível27,28. O HEV é uma causa comum de cirrose hepática e insuficiência hepática29 especialmente em pacientes com doença hepática pré-existente, indivíduos imunocomprometidos (genótipo 3, 4 e 7) e gestantes (genótipo 1). Note-se que há também manifestações extrahápticas como a doença hematopoiética30,31,,32, distúrbios neurológicos33 e lesão renal34.
Até o momento, o medicamento off-label ribavirin (RBV) é o tratamento de escolha para muitos pacientes infectados35,36. No entanto, casos de falha no tratamento e desfechos clínicos ruins a longo prazo foram relatados. A falha no tratamento tem sido associada à mutagênese viral e ao aumento da heterogeneidade viral em pacientes cronicamente infectados37,38,39. Pelo contrário, um estudo multicêntrico retrospectivo europeu recente não foi capaz de correlacionar mutações de polimerase à falha do tratamento RBV40. Em observações clínicas e experimentos in vitro, interferon41,42,43, sofosbuvir44,45, sais de zinco46 e silvestrol47,48 também mostraram efeitos antivirais. No entanto, ainda há um tratamento específico de HEV, dificultado pela falta de conhecimento sobre o ciclo de vida hev e sua patogênese. Portanto, éurgenteum sistema de cultura celular robusto para estudos virológicos e o desenvolvimento de novas drogas antivirais.
Infelizmente, como outros vírus da hepatite, o HEV é difícil de propagar em linhas celulares convencionais e geralmente progride muito lentamente levando a baixas cargas virais. No entanto, alguns grupos foram capazes de aumentar as cargas virais pela geração de subclones de linhacelular 50 ou pelo ajuste dos suplementos de mídia51. Recentemente, a geração de clones cDNA52 e a adaptação dos isolados do paciente primário pela passagem53,54 melhorou ainda mais a propagação de HEV na cultura celular55. Neste protocolo, usamos o genoma de uma cultura celular adaptada linhame a cepa Kernow-C1 (chamada de p6_WT)54 e uma cepa mutante que abriga uma mutação que aumenta a replicação (chamada de p6_G1634R)37. Kernow-C1 é a cepa mais usada na cultura celular HEV e é capaz de produzir altas cargas virais. Ao avaliar os números de cópias do RNA viral, a replicação hev pode ser monitorada in vitro. No entanto, essas técnicas não permitem avaliar o número de partículas infecciosas que estão sendo produzidas. Por isso, estabelecemos uma coloração de imunofluorescência para determinar unidades de formação de foco (FFU/mL).
O método56 aqui descrito pode ser usado para produzir partículas virais infecciosas de comprimento total que são capazes de infectar uma variedade de tipos celulares de diversas origens, incluindo células primárias e linhas celulares de mamíferos. Este é um pré-requisito fundamental para decifrar aspectos importantes da infecção por HEV e do tropismo. Não há necessidade de inoculação com isolados geralmente limitados de pacientes. A produção de partículas infecciosas de HEV a partir de plasmídeos representa uma fonte infinita, o que torna este protocolo comparativamente eficiente. Além disso, esse sistema pode ser usado para genética reversa, permitindo o estudo da alteração do genoma identificada in vivo e seu impacto na replicação e aptidão do HEV. Essa técnica supera muitas limitações e pode trilhar o caminho para o desenvolvimento de medicamentos, estudos de mutagênese e a avaliação de interações vírus-hospedeiros, como fatores de restrição ou entrada.
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Protocol
NOTA: Todos os experimentos são realizados sob a condição BSL-2. Todos os materiais que entram em contato com o vírus da hepatite E RNA ou vírus infeccioso devem ser enxaguados adequadamente com 4% de Kohrsolin FF de um recipiente de resíduos dentro do capô antes do descarte.
1. Preparação plasmid
- Inoculado 200 mL LB médio contendo 100 μg/mL ampicillin com Escherichia coli JM109 transformado incorporando uma codificação plasmida para a sequência HEV gt3 Kernow-C1p6 de comprimento completo (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54 ou pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37). Incubar por 16 h a 37 °C sob agitação permanente (170 rpm).
NOTA: O isolamento plasmídeo foi realizado utilizando um kit de extração plasmida (ver Tabela de Materiais). - Seguindo o protocolo de fabricação, gire 200 mL de cultura durante a noite a 6.000 x g e 4 °C por 10 min e descarte o supernaspe. A pelota bacteriana pode ser congelada e armazenada a -20 °C.
- Resuspense a pelota bacteriana em 4 mL de tampão de resuspensão por pipetar para cima e para baixo com uma pipeta sorológica de 10 mL e um homem pipeta. Além disso, vórtice rigorosamente.
- Adicione 4 mL de tampão de lise pré-armado (30-40 °C). Inverta suavemente por várias vezes e incubar à temperatura ambiente (RT) por 5 minutos.
- Adicione 4,8 mL de tampão de neutralização, inverta suavemente e certifique-se de que o liseto seja neutralizado quantitativamente (veja a descrição do fabricante). Em seguida, centrífuga a 11.000 x g e 4 °C por 20 min.
- Coloque uma peça de 2 cm x 2 cm mull dentro de uma ponta não filtrante de 1 mL, carregue resuspended, lise e neutralizada em pipeta sorológica de 10 mL, adicione 1 mL de ponta com mull à ponta da pipeta sorológica e filtre o supernatante em um novo tubo de 50 mL.
NOTA: O supernaspe pode ser armazenado a 4 °C por até 30 min, se necessário. - Em várias etapas aplique 750 μL do supernanato filtrado em um total de 4 colunas de filtro (fornecidas no kit) e centrífuga a 11.000 x g por 30 s. Descarte o fluxo-through e repita esta sequência até que todos os supernadantes sejam aplicados nas colunas do filtro.
- Lave cada coluna de filtro duas vezes com 500 μL de prewarmed (50 °C) lavar o buffer AW a 11.000 x g para 30 s e descartar o fluxo posteriormente.
- Lave cada coluna de filtro com 600 μL de tampão de lavagem A4 por centrifugação a 11.000 x g para 30 s. Descarte o fluxo e seque as colunas do filtro por centrifugação a 11.000 x g por 2 min.
- Elute o DNA plasmídeo de cada coluna de filtro transferindo 60 μL de tampão de elução para o centro das colunas do filtro. Incubar por 1 min no RT e centrífuga a 11.000 x g por 1 min.
- Combine eluatos e meça a concentração do DNA plasmídeo extraído usando um espectotúmetro.
2. Linearização e purificação de DNA
Figura 1: Configuração experimental esquemática para a linearização plasmida e purificação de DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
NOTA: A linearização aumenta o rendimento do RNA durante a transcrição in vitro (etapa 3)
- Para linearizar o DNA plasmídeo (Figura 1) misture 10 μg do DNA do modelo (extraído na etapa 1), 10 μL do tampão, 2 μL de MluI e ajuste a um volume de 100 μL com H2O.
- Incubar por 1h a 37 °C e confirmar a linearização do plasmídeo por eletroforese de gel de agarose (por exemplo, carregar DNA plasmídeo não digerido e digerido [1 μL de DNA cada] em um gel de 1% de agarose e executar eletroforrese a corrente constante de 120 V).
- Seguindo o protocolo dos fabricantes para extração de DNA (ver Tabela de Materiais, Figura 1), misture 500 μL de tampão de ligação, fornecido no kit, com 100 μL de DNA linearizado. Aplique a amostra em uma coluna de filtro e centrífugas a 17.800 x g por 30 s. Descarte o fluxo através e coloque as colunas do filtro de volta no mesmo tubo.
- Lave a coluna do filtro adicionando 650 μL de tampão de lavagem e centrifugação a 17.800 x g por 30 s. Descarte o fluxo-through e coloque a coluna do filtro de volta no mesmo tubo. Para remover o tampão de lavagem residual, a centrífuga seca a 17.800 x g para 60 s e coloque cada coluna de filtro em um tubo de microcentrifuge limpo de 1,5 mL depois.
- DNA elute transferindo 60 μL de H2O pré-armado (grau PCR, 70 °C) para o centro do filtro. Incubar por 1 min a 70 °C e centrífuga a 18.000 x g por 1 min. Meça a concentração do DNA purificado usando um espectotúmetro.
NOTA: Armazene o DNA a -20 °C até a transcrição in vitro.
3. Transcrição in vitro do genótipo HEV de comprimento completo 3 p6 DNA e purificação de RNA
Figura 2: Configuração experimental esquemática para transcrição in vitro e purificação de RNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
NOTA: A transcrição in vitro é necessária para produzir RNA genômica viral a partir do DNA plasmídeo.
- Para a mistura de transcrição in vitro 20 μL de tampão de transcrição 5x T7, 10 mM DTT, 100 U de inibidor de ribonuclease, 25 mM ATP, CTP e UTP, 12,5 mM GTP, 5 mM Ribo m7G Cap Analog, 2 μg de modelo de DNA linearizado, e 80 U de TRNA polymerase. Encha até 100 μL com H2O livre de nuclease, misture bem e incubar por 2h a 37 °C.
NOTA: O armazenamento de curto prazo a -20 °C é possível após a etapa 3.1 a 3.1.2.- Adicione 2 μL de polimerase T7 RNA, misture bem e incubar por mais 2 h a 37 °C.
- Para digerir o modelo inicial de DNA, adicione 7,5 μL de DNase (RNase livre, 1 U/μL), misture bem e incubar a 30 min a 37 °C.
NOTA: Limpe todas as superfícies e pipetas com descontaminante de superfície para RNase ao trabalhar com RNA para evitar a degradação. Além disso, certifique-se de que todos os tubos de reação são livres de RNase e estéreis. Use apenas pontas com filtros e diluir somente com água livre de RNase e estéril.
- Seguindo o protocolo de fabricação para extração de RNA (ver Tabela de Materiais, Figura 2), prepare uma pré-estreia de tampão de lysis e 100% etanol misturando 330 μL de tampão de Lysis e 330 μL de 100% etanol para cada reação de transcrição in vitro. Adicione 660 μL de lysis tampão-etanol pré-mistura a 110 μL de RNA e vórtice. Carregar amostra em uma coluna de filtro e centrífuga a 8000 x g por 30 s. Descarte o fluxo-through e coloque a coluna do filtro de volta no mesmo tubo.
- Adicione 600 μL de tampão de lavagem e centrífuga a 8000 x g por 30 s. Descarte a coluna de filtro de fluxo e coloque a coluna do filtro de volta no mesmo tubo. Adicione 350 μL de tampão de lavagem e centrífuga a 8000 x g por 2 min para remover o tampão de lavagem residual. Coloque cada coluna de filtro em um tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL limpo. Abra a tampa da coluna do filtro e deixe a coluna secar por 3 minutos.
- Elute RNA colocando 50 μL de RNase livre H2O no centro da coluna do filtro. Incubar por 1 min no RT e, posteriormente, centrífuga a 8.000 x g por 1 min. Verifique a integridade do RNA carregando 1 μL de RNA em um gel de agarose e meça a concentração de RNA extraído usando um espect autorofómetro.
NOTA: Armazene o RNA a -80 °C até a eletroporação e descongele exclusivamente o RNA no gelo para evitar a degradação.
4. Preparação de células HepG2 para produção de HEV derivado da cultura celular (HEVcc)
Figura 3: Configuração experimental esquemática para a preparação de células HepG2 para produção derivada da cultura celular HEV (HEVcc). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
NOTA: Para evitar contaminação, a preparação de células, eletroporação, infecção, colheita e fixação celular foram realizadas em condições estéreis em uma instalação de nível 2 de biossegurança. As etapas de incubação a 37 °C que envolvem células foram realizadas em uma incubadora de CO2 de 5%.
- Para preparar as células HepG2 para a produção de HEVcc(Figura 3),as células de sementes no médio de águia modificada (DMEM) completo de Dulbecco (ver Tabela 1) em um colágeno de 15 cm (ver Tabela 1, filtro estéril PBS- ácido acético misturar através de 0,2 μm de malha antes de adicionar colágeno) prato de cultura revestido. Incubar a 37 °C até que as células sejam 90% confluentes.
NOTA: Cada prato de 15 cm contendo 90% de células confluentes gerará células suficientes para até 4 eletroporação. - Remova suavemente o meio da placa e lave as células uma vez com 10 mL de 1x PBS. Células de trypsinize adicionando 3 mL de 0,05% de trypsin-EDTA nas células e incubam a 37 °C até que as células sejam completamente separadas. Células resuspendas em 10 mL DMEM completas médias e transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mL. Determine o número total de células.
- Uma vez que cada eletroporação requer 5 x 106 células, transfira o volume apropriado em um novo tubo de 50 mL e encha pelo menos 35 mL com 1x PBS. Centrífugas células a 200 x g por 5 min e descartam cuidadosamente o supernasce sem perturbar a pelota celular.
- Lave as células mais uma vez com 35 mL de 1x PBS a 200 x g por 5 min. Coloque células no gelo e não remova 1x PBS ainda, para manter as células em suspensão.
5. Eletroporação de células HepG2
Figura 4: Configuração experimental esquemática para a eletroporação de células HepG2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Para eletroporação de células HepG2(Figura 4) prepare 400 μL de Cytomix completo por eletroporação suplementando 384 μL de Citomix (ver Tabela 1) com 2 mM ATP e 5 mM Glutathione. Prepare-se fresco antes do uso e coloque diretamente no gelo.
NOTA: Uma execução correta, mas rápida das seguintes etapas, é crucial. Portanto, certifique-se de que tudo está preparado corretamente. - Remova cuidadosamente 1x PBS sem perturbar a pelota celular da etapa 4.4. Resuspend 5 x 106 células em 400 μL de Cytomix completo e adicionar 5 μg RNA da etapa 3.2.2. Transfira a solução para um cuvette de 4 mm e pulso uma vez com 975 μF, 270 V para 20 ms com um sistema de eletroporação.
- Após a transferência de eletroporação as células o mais rápido possível com uma pipeta Pasteur em 11 mL DMEM completa por eletroporação.
NOTA: Para garantir que o RNA seja transfectado com sucesso em células HepG2, um controle de transfecção (TC) será realizado. As taxas de transfecção esperadas variam entre 40-60% das células ORF2 positivas.
- Após a transferência de eletroporação as células o mais rápido possível com uma pipeta Pasteur em 11 mL DMEM completa por eletroporação.
- Transfira 10 mL de células eletroporadas para um prato de cultura de 10 cm revestido com colágeno. Adicione 1,3 x 105 células eletroprolaradas (300 μL) em um poço de uma placa de 24 microtitre revestida de colágeno carregando um deslizamento de tampa (posteriormente usado como controle de transfecção). Distribua as células uniformemente e incubar a 37 °C.
- Após 24 horas, troque o meio do prato de 10 cm e substitua por DMEM fresco de 10 mL completo. Não altere o meio do controle de transfecção. Incubar por mais 6 dias a 37 °C.
- Pare o controle de transfecção em 24 placas de poço 5-7 d pós eletroporação, dependendo da densidade celular, continuando com o protocolo de coloração de imunofluorescência (etapa 8). A eficiência da transfecção é calculada contando o número de células positivas ORF2 normalizadas para o número total de células.
6. Colheita de HEVcc intra e extracelular
Figura 5: Configuração experimental de esquema para colheita de HEVcc intra e extracelular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Para colher HEVcc extracelular (Figura 5),filtrar o supernasal, obtido a partir do prato de 10 cm após 6 dias (etapa 5.3.1), através de uma malha de 0,45 μm para remover quaisquer detritos celulares. A loja colheu HEVcc extracelular a 4 °C para a infecção do mesmo dia, caso contrário, armazene a -80 °C.
- Para colher HEVcc intracelular (Figura 5),lave as células com 1x PBS e trypsinize adicionando 1,5 mL de 0,05% de trippsina-EDTA. Incubar a 37 °C até que as células se despem completamente. Adicione 10 mL de DMEM completo, lave a placa para desacoplar as células e transferir a suspensão das células para o tubo de 50 mL. Lave as células duas vezes com PBS. Centrifugar a 200 x g por 5 min.
- Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular em 1,6 mL de DMEM completa por eletroporação. Transfira a suspensão da célula para um tubo de reação de 2 mL.
NOTA: Não use volumes maiores, pois diminuiria drasticamente as cargas virais. - Congelar (em nitrogênio líquido) e descongelar células. Repita esta sequência 3 vezes.
NOTA: Não acumule mais de uma eletroporação (1,6 mL) para os 3 ciclos de congelamento e degelo, pois a eficiência da lise seria prejudicada. Não faça o vórtice da suspensão celular entre os ciclos. Certifique-se de descongelar a suspensão celular lentamente (por exemplo, temperatura ambiente ou no gelo) para maximizar as cargas virais. - Centrifugar as células de alta velocidade por 10 minutos a 10.000 x g para separar detritos celulares. Transfira o supernatante em um novo tubo. Tome o supernatante para infecção, caso contrário, armazene a -80 °C.
- Opcionalmente, concentre o HEVcc extra e intracelular usando um concentrador para aumentar as cargas virais (de acordo com o protocolo do fabricante).
- Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular em 1,6 mL de DMEM completa por eletroporação. Transfira a suspensão da célula para um tubo de reação de 2 mL.
7. Infecção de células HepG2/C3A com HEVCC intra e extracelular
Figura 6: Configuração experimental esquemática para a infecção de células HepG2/C3A com HEVcc intra e extracelular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
NOTA: A infecção das células HepG2/C3A deve garantir que partículas infecciosas sejam produzidas. Além disso, a titulação do HEVcc intracelular colhido e extracelular é usada para calcular os tituladores do vírus em FFU/mL. Isso será posteriormente referido como controle de infecção (IC).
- Para preparar as células HepG2/C3A para infecção hevcc(Figura 6),meio essencial mínimo pré-aquecimento (MEM) completa (ver Tabela 1) a 37 °C.
- Semente 2 x 104 células/bem em 100 μL sobre o colágeno revestido 96 placa de microtiter bem um dia antes da etapa 6. Certifique-se de encher os poços mais externos com 1x PBS para evitar a evaporação do meio dentro dos 60 poços internos. Incubar a 37 °C por 24 h.
- Infecte com HEVcc extracelular adicionando 50 μL do supernante (a partir da etapa 6.1) às células HepG2/C3A semeadas no dia anterior. Misture bem por pipetting para cima e para baixo e dilua-se em série seis vezes 1:3 transferindo 50 μL para o próximo poço. Realizar duplicatas de diluição serial para réplicas técnicas.
- Infecte com HEVcc intracelular adicionando 25 μL de supernasce (da etapa 6.2.3) às células HepG2/C3A semeadas no dia anterior. Misture bem por pipetting para cima e para baixo e dilua-se em série seis vezes 1:5 transferindo 25 μL para o próximo poço. Realizar duplicações de diluição seriada para replicação técnica.
- Após 7 d a 37 °C parar a infecção continuando com o protocolo de coloração de imunofluorescência (passo 8).
8. Mancha de imunofluorescência de transfecção e controle de infecções
Figura 7: Configuração experimental esquemática para a coloração da imunofluorescência de transfecção e controle de infecções. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Para coloração de imunofluorescência(Figura 7),lave 3x com PBS 1x e fixe células dispensando 350 μL (controle de transfecção [TC]) ou 50 μL (controle de infecção [IC]) de 4% solução de fixação por poço. Incubar por 15 min no RT e lavar cuidadosamente duas vezes com 1x PBS depois.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui para o controle de transfecção até que a infecção das células HepG2/C3A também seja interrompida. Armazene a placa do poço a 4 °C. Vedar também com parafilm para evitar a evaporação. - Células permeabilizes adicionando 350 μL (TC) ou 50 μL (IC) de 0,2% Triton X-100 (em 1× PBS) por 5 min na RT. Em seguida, lave cuidadosamente duas vezes com 1x PBS e bloqueie com 350 μL (TC) ou 50 μL (IC) de 5% de soro de cavalo (em 1x PBS) por 1 h em RT sob agitação constante em um agitador orbital (30 rpm).
NOTA: Prepare um pequeno prato plástico (30 mm) colocando um tecido úmido dentro e uma camada de filme de parafina em cima, criando uma câmara úmida. Em seguida, transfira o deslizamento de capa TC voltado para o filme de parafina. As seguintes etapas para o TC serão executadas na câmara úmida. - Adicione 70 μL (TC) ou 25 μL (IC) de anticorpo primário anti-ORF2 8282 (soro hiperimune de coelho específico hev,1:5.000 em 5% de Soro de Cavalo) por poço e incubar durante a noite a 4 °C sob agitação constante em um shaker orbital (30 rpm).
- Lave cuidadosamente duas vezes com 1x PBS e adicione 70 μL (TC) ou 25 μL (IC) de anticorpos secundários anti-coelho de cabra 488 (1:1.000 em 5 % de soro de cavalo). Incubar por 1h sob agitação constante em um agitador orbital (30 rpm) no escuro. Novamente, lave cuidadosamente duas vezes com 1x PBS
- Adicione 70 μL (TC) ou 25 μL (IC) de DAPI (1:10.000 em H2O) e incubar por 1 min. Lave cuidadosamente duas vezes com H2O. Retire o deslizamento de cobertura da câmara úmida, coloque o deslizamento da tampa com 6 μL do reagente de montagem de cabeça para baixo em um slide de tampa (apenas para TC) e deixe a montagem do reagente secar por 16 h no RT no escuro. Guarde IC na água até a imagem e sele a placa com filme de parafina para evitar a secagem devido à evaporação.
- Tire imagens para confirmar a transfecção e a infecção bem sucedidas.
NOTA: Os resultados comparáveis foram obtidos utilizando-se o anticorpo anti-ORF2 1E6 comercialmente disponível57 (1:200 em 5 % de soro de cavalo) e um anticorpo secundário anti-rato de burro (1:1.000 em 5 % soro de cavalo)
9. Determinação da FFU
NOTA: Um FFU é definido como uma ou mais células ORF2 positivas separadas de outra FFU por pelo menos três células negativas.
- Para hevcc extracelular começar a contar todos os focos ORF2 positivos dos dois poços nas duas diluições mais baixas. Um total de quatro poços devem ser contados. As unidades de formação de foco (FFU) por mililitro podem ser calculadas com a seguinte equação:
NOTA: Os títulos esperados variam entre 102 e 5 x 104 FFU/mL. - Para hevcc intracelular começam a contar todos os focos ORF2 positivos em poços onde entre 50 e 100 focos são observados. Além disso, conte os dois poços na próxima diluição maior. Um total de quatro poços devem ser contados. As unidades de formação de foco (FFU) por mililitro podem ser calculadas com a seguinte equação:
NOTA: Os títulos esperados variam entre 105 e 3 x 106 FFU/mL. Os fatores 20x e 40x são usados para extrapolar o número de FFU por 50 μL e 25 μL a 1 mL e podem ser adaptados em conformidade.
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Representative Results
Neste protocolo, descrevemos a produção de alto título infeccioso HEVcc. O primeiro passo é isolar o DNA plasmídeo (pBluescript_SK_HEVp654 e pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figura 8a), que então é linearizado pela digestão de restrição e purificado para transcrição in vitro(Figura 1). Uma linearização bem sucedida pode ser verificada comparando o plasmídeo-DNA não digerido com o plasmídeo digerido-DNA usando eletroforese gel. Além de uma mudança de tamanho, apenas uma faixa de DNA deve ser visível representando a forma linear. A linearização é completa quando as duas outras faixas acima e abaixo da forma linear, representando o círculo cortado e a forma supervalada, respectivamente, são completamente diminuídas(Figura 8b). O rendimento do DNA purificado deve exceder 150 ng/μL. Somente se essas características se mantiverem verdadeiras, o DNA linearizado deve ser usado para transcrição in vitro. O RNA transcrito in vitro deve ser bem verificado usando eletroforese de gel e em caso de baixa abundancy RNase deve mostrar bandas distintas em vez de uma mancha borrada(Figura 8c). Além disso, o rendimento purificado de RNA deve exceder 500 ng/μL O RNA transcrito in vitro (Figura 2) eventualmente é eletroporado em células HepG2 para produção de vírus(Figura 3 e Figura 4). A eletroporação bem sucedida é monitorada pela coloração da imunofluorescência do controle de transfecção(Figura 9a). A eficiência da transfecção deve exceder 40%(Figura 9b). Um mutante deficiente de replicação serve como um controle negativo, para garantir a especificidade da coloração ORF2, pois não se espera nenhuma expressão ORF2(Figura 9c). Após 7 dias de incubação, o HEVcc envolto (extracelular) é colhido pela coleta e filtragem da cultura celular supernascida. HEVcc não envolto (intracelular) é liberado das células por vários ciclos de congelamento e degelo. Para remover qualquer detrito celular, a célula é centrifugada em alta velocidade(Figura 5). Posteriormente, ambas as espécies HEVcc são utilizadas para infectar células HepG2/C3A por diluição serial(Figura 6 e Figura 9d). De acordo com as equações acima (ver passo 9) os títulos virais são determinados pelo cálculo da FFU.
Os resultados representativos são retratados na Figura 9. O controle de transfecção deve incluir cerca de 50% de células ORF2 positivas para garantir uma quantidade eficiente de vírus sendo produzida(Figura 9a,b). Quanto menos células ORF2 positivos, menor será o título. Exatamente seguindo as etapas mencionadas no protocolo, os titers variam entre 105 e 3 x 106 FFU/mL para o HEVcc não envolto (intracelular). Para os tituladores HEVcc envoltos (extracelulares) entre 102 e 5 x104 FFU/mL são esperados(Figura 9e). Além disso, foram observadas altas contagens de FFU para o mutante G1634R. Ao calcular a razão entre cópias do genoma e partículas virais infecciosas, o HEVcc intracelular produzido tanto para p6_WT quanto para p6_G1634R foi encontrado menor em comparação com o HEVcc extracelular, sugerindo uma maior infectividade específica da espécie HEV não envolta(Figura 9f).
Figura 8: Geração de RNA transcrito in vitro.
(A) Exemplo de um espectro de absorção de PLASmídeo-DNA isolado. (B) Eletroforese de gel de DNA plasmídeo não digerido e digerido. (C) Eletroforese de gel de RNA transcrito in vitro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Resultados representativos da alta produção de titer HEVcc.
(A) Controle de transfecção de células HepG2 eletroporadas. As células transfeinadas foram manchadas com anticorpo anti-ORF2 (verde, LS-Bio) e DAPI (azul). (B) A eficiência de transfecção foi calculada pelo número de células ORF2 positivas normalizadas para o número de células totais. (C) Um mutante deficiente de replicação serve como um controle negativo para a coloração da imunofluorescência, para garantir a especificidade orf2. (D) Para a determinação da FFU foram realizadas diluições seriais dos estoques de vírus produzidos. As células positivas ORF2 são retratadas em branco. (E) Os títulos virais foram calculados pela contagem de FFU e (F) as cargas virais foram determinadas por qPCR e normalizadas para FFU/mL. As barras mostram o desvio médio e padrão de 38 e 10 experimentos independentes, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução de trabalho | Concentração | Volume |
| Colágeno | 40 mL | Pbs |
| 40 μl | Ácido acético | |
| 1 mL | Solução de colágeno R 0,4% estéril | |
| Citomix | 120 mM | Kcl |
| 0,15 mM | CaCl2 | |
| 10 mM | K2HPO4 (pH 7.4) | |
| 25 mM | HEPES | |
| 2 mM | EGTA | |
| DMEM completo | 500 mL | DMEM |
| 5 mL | Caneta/Estreptococos | |
| 5 mL | MEM NEAA (100X) | |
| 5 mL | L-Glutamina | |
| 50 mL | Soro bovino fetal | |
| MEM completo | 500 mL | Mem |
| 5 mL | Piruva de sódio | |
| 5 mL | Gentamicina | |
| 5 mL | MEM NEAA (100X) | |
| 5 mL | L-Glutamina | |
| 50 mL | IgG ultra-baixo |
Tabela 1: Tabela de Composição do Buffer.
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Discussion
A partir da preparação plasmida, os rendimentos de DNA devem exceder 150 ng/μL para poder realizar uma linearização múltipla a partir do mesmo estoque plasmídeo, o que minimiza o risco de mutagênese induzida por bactérias de sequências de genomas cruciais. Além disso, é importante verificar a digestão de restrição para a linearização plasmida completa por eletroforese gel (Figura 8b). A falta de DNA plasmídeo linearizado induziria a amplificação do círculo de rolamento fazendo com que a transcrição in vitro fosse menos eficiente. Além disso, a integridade do RNA deve ser confirmada para avaliar a abundância de RNases dentro da amostra (Figura 8c). Só então uma eletroporação de células-alvo deve ser considerada. Note-se que antes de começar com a preparação das células HepG2, certifique-se de que tudo esteja à mão e bem preparado evitando longos períodos de espera. Especialmente, garanta o armazenamento de curto prazo das células e do RNA no Cytomix até a eletroporação. Para contornar o aquecimento das células durante a eletroporação é essencial resfriar o tampão no gelo de antemão. A duração do pulso não deve exceder 20-25 ms e 270 V. Após a eletroporação, as células requerem uma transferência rápida para um meio fresco para garantir a viabilidade celular. Antes da infecção das células-alvo, o TC deve ser verificado para a porcentagem de células ORF2 positivas. Caso o TC não mostre células ORF2 positivas, é mais provável que a eletroporação tenha falhado ou a coloração não tenha funcionado, e o experimento deve ser repetido.
Ao colher hevcc intracelular deve ser prestada atenção especial à velocidade dos ciclos de congelamento e degelo. Os títulos virais podem ser aumentados executando o congelamento em nitrogênio líquido em vez de -80 °C. Pelo contrário, o descongelamento deve ocorrer da maneira mais lenta possível sugerindo o armazenamento no gelo até que a suspensão da célula seja liquidada completamente. No entanto, também é possível descongelar a suspensão da célula à temperatura ambiente, em uma incubadora de 37 °C ou banho de água, porém quanto mais rápido o descongelamento for executado, mais os peitos diminuirão.
Dependendo dos seguintes experimentos também é possível fazer os ciclos de congelamento e degelo no MEM completo ou 1x PBS sem perda dramática de títulos virais, no entanto, deve-se ter em mente que isso faz com que o HEVcc extracelular esteja em um meio diferente do HEVcc intracelular.
Seguindo estas etapas cruciais do protocolo, os títulos esperados variam entre 105 e 3 x 106 FFU/mL para o HEVcc não envolto (intracelular). Para os tituladores HEVcc envoltos (extracelulares) entre 102 e 5 x 104 FFU/mL são aguardados(Figura 9e). Até agora, estudos que empregam sistemas de cultura celular HEV monitoram a replicação e propagação viral predominantemente por qPCR. A avaliação das cópias do genoma do RNA ainda não fornece nenhuma visão sobre a montagem e liberação de partículas infecciosas.
Um estudo anterior58 propagaram com sucesso isolados de pacientes na cultura celular com máximas de10 3 TCID50/mL. Como mostrado recentemente, também é possível passar com sucesso o HEVCC na cultura celular e adaptar nosso protocolo a outras cepas, como 47832c e 83-2 que não abrigam uma inserção na região hipervariável56. Além disso, se as sequências derivadas do paciente podem ser clonadas na espinha dorsal do vetor Bluescript e ainda produzir títulos virais elevados não foi testado. Com o método introduzido, partículas virais não envoltas, bem como partículas virais envoltas podem ser colhidas e usadas para inocular uma variedade de linhas celulares ingênuas como A549, Huh7.5, Jeg-3 e hepatócitos humanos e suínos primários, proporcionando um benefício para aplicações futuras como a investigação de tropismo HEV, patogênese, desenvolvimento de drogas, interações virais e hospedeiras, estudos de inativação, neutralização de anticorpos e muito mais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Somos gratos a Suzanne Emerson pelo vírus da hepatite E clone p6. O soro hiperimune de coelho específico do HEV foi gentilmente fornecido por Rainer Ulrich, Instituto Friedrich Loeffler, Alemanha. Além disso, agradecemos a todos os membros do Departamento de Virologia Molecular e Médica da Universidade ruhr Bochum pelo apoio e discussão. Foram gerados números 1-7 com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm mesh | Sarstedt | 83.1826 | Harvest extracellular Virus |
| 4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | Immunofluorescence |
| Acetic acid | CarlRoth | 6755.1 | Collagen working solution |
| Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | Virus harvesting |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | Selection of transformed bacteria |
| ATP | Roche | 11140965001 | in vitro transcription and electroporation |
| BioRender | BioRender | Figure Generation | |
| CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
| Collagen R solution 0.4 % sterile | Serva | 47256.01 | Collagen working solution |
| CTP | Roche | 11140922001 | in vitro transcription |
| Cuvette | Biorad | 165-2088 | Electroporation |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | Immunofluorescence |
| DMEM | gibco | 41965-039 | Cell culture |
| DNAse | Promega | M6101 | in vitro transcription |
| DTT | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
| Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformation |
| Fetal bovine serum | gibco | 10270106 | Cell culture |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Immunofluorescence |
| GenePulser Xcell Electroporation System | BioRad | 1652660 | Electroporation |
| Gentamycin | gibco | 15710049 | Cell culture |
| GTP | Roche | 11140957001 | in vitro transcription |
| H2O | Braun | 184238001 | Immunofluorescence |
| Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
| Horse serum | gibco | 16050122 | Immunofluorescence |
| K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
| KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
| L-Glutamin | gibco | 25030081 | Cell culture |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
| MEM | gibco | 31095-029 | Cell culture |
| MEM NEAA (100×) | gibco | 11140-035 | Cell culture |
| MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
| Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA concentration |
| MluI enzyme | NEB | R0198L | Linearization |
| NEB buffer | NEB | included in R0198L | Linearization |
| NucleoSpin Plasmid kit | Macherey & Nagel | 740588.250 | Plasmid preparation |
| NucleoSpin RNA Clean-up Kit | Macherey & Nagel | 740948.250 | RNA purification |
| PBS | gibco | 70011051 | Cell culture |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Cell culture |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) | Todt et.al | Virus production | |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) | Shukla et al. | GenBank accession no. JQ679013 | Virus production |
| Primary antibody 1E6 | LS-Bio | C67675 | Immunofluorescence |
| Primary antibody 8282 | Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | DNA extraction |
| Ribo m7G Cap Analog | Promega | P1711 | in vitro transcription |
| RNase away | CarlRoth | A998.3 | RNA purification |
| RNasin (RNase inhibitor) | Promega | N2515 | in vitro transcription |
| Secondary antibody donkey anti-mouse 488 | Thermo Fisher | A-21202 | Immunofluorescence |
| Secondary antibody goat anti-rabbit 488 | Thermo Fisher | A-11008 | Immunofluorescence |
| Sodium Pyruvat | gibco | 11360070 | Cell culture |
| T7 RNA polymerase | Promega | P2077 | in vitro transcription |
| Transcription Buffer | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| Triton X-100 | CarlRoth | 3051.3 | Immunofluorescence |
| Trypsin-EDTA (0.5 %) | gibco | 15400054 | Cell culture |
| ultra-low IgG | gibco | 1921005PJ | Cell culture |
| UTP | Roche | 11140949001 | in vitro transcription |
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