Описанный здесь является эффективным методом о том, как производить высокие вирусные титр запасов вируса гепатита Е (HEV), чтобы эффективно заразить клетки гепатомы. С представленным методом, как неохотные, так и окутанные вирусные частицы могут быть собраны и использованы для прививки различных клеточных линий.
Вирус гепатита Е является основной причиной цирроза печени и печеночной недостаточности с ростом распространенности во всем мире. Одноцепочечный РНК-вирус в основном передается при переливании крови, неадекватных санитарных условиях и загрязненных пищевых продуктах. На сегодняшний день не по этикетке препарат рибавирин (RBV) является лечение выбора для многих пациентов. Тем не менее, конкретные лечения HEV еще предстоит определить. До сих пор знания о жизненном цикле HEV и патогенеза были серьезно затруднены из-за отсутствия эффективной системы культуры Клеток HEV. Надежная система клеточной культуры имеет важное значение для изучения вирусного жизненного цикла, который также включает вирусный патогенез. С методом описанным здесь одно может произвести вирусные titers up to 3 x 106 блока фокусим формирования/mL (FFU/mL) non-enveloped HEV и up to 5 x 104 FFU/mL окутанного HEV. Используя эти частицы, можно заразить различные клетки различного происхождения, включая первичные клетки и человека, а также линии клеток животных. Производство инфекционных частиц HEV из плазмидов представляет собой бесконечный источник, что делает этот протокол чрезвычайно эффективным.
Гепатит Е является довольно недооцененным заболеванием с ростом распространенности во всем мире. Около 20 миллионов случаев инфицирования приводят к более чем 70 000 случаев смерти в год1. Основной агент, вирус гепатита Е (HEV), был недавно переназначен и в настоящее время классифицируется в семье Hepeviridae в том числе рода ортохерепвирус и Piscihepevirus. HEV различного происхождения классифицируются в пределах видов Orthohepevirus A-D в том числе изоляты от людей, свиней, кроликов, крыс, птиц и других млекопитающих2. В настоящее время выявлено восемь различных генотипов (GT) положительно-ориентированного одноцепоченого РНК-вируса2. Хотя они отличаются по последовательности идентичности, маршрутов передачи и географического распределения, их геномная структура очень сохраняется. Более конкретный, геном 7.2 kbp HEV делится на 3 основных открытых считывания кадров (ORF1-3). В то время как ORF1 кодирует все ферменты, необходимые для успешной репликации в клетке-хозяине, ORF2 кодирует капсидный белок, а белок ORF3 работает как функциональный ионный канал, необходимый для сборки и высвобождения инфекционных частиц3. После выпуска в базальных или апических просвета HEV существует в обоих, quasienveloped и не-окутанных / голых видов в зависимости от того, вирус происходит от крови или кала, соответственно4,5.
В то время как GT1 и GT2 в основном встречаются в развивающихся странах, заражая людей6 только по фекально-устному маршруту, GT3, GT4 и GT7 преимущественно встречаются в развитых странах1,7 с различными видами, служащими в качестве резервуаров, например, свиньи8, крыса9, курица10,11, олени12, мангуста13, летучая мышь14, кролик15,16, дикий кабан17 и многое другое7,18,19, предоставляя доказательства зооноза7,20,21,22. Помимо неадекватных санитарных условий23 и загрязненных пищевых продуктов12,,24,25,,26, передача через переливание крови и трансплантации органов также возможно27,28., HEV является распространенной причиной цирроза печени и печеночной недостаточности29 особенно у пациентов с уже существующими заболеваниями печени, иммунокомпромиссных лиц (генотип 3, 4 и 7) и беременных женщин (генотип 1). Следует отметить, Есть также экстра-епатические проявления, такие как гематопоэтическое заболевание30,31,32, неврологические расстройства33 и почечной травмы34.
На сегодняшний день, вне этикетки препарат рибавирин (RBV) является лечение выбора для многих инфицированных пациентов35,36. Тем не менее, случаи отказа лечения и плохих клинических долгосрочных исходов были зарегистрированы. Неудача лечения была связана с вирусным мутагенезом и повышенной вирусной неоднородностью у хронически инфицированных пациентов37,,38,,39. Напротив, недавнее европейское ретроспективное многоцентровое исследование не смогло соотнести мутации полимеразы с неудачей леченияРБВ 40. В клинических наблюдениях и экспериментах в пробирке интерферон41,,42,,43,софосбувир44,,45,соли цинка46 и силвестрол47,48 также показали противовирусные эффекты. Тем не менее, конкретные лечения HEV еще предстоит найти, препятствует отсутствие знаний о жизненном цикле HEV и его патогенеза. Таким образом, надежная система клеточной культуры для вирусологических исследований и разработки новых противовирусных препаратов срочно необходимо49.
К сожалению, как и другие вирусы гепатита, HEV трудно размножаться в обычных клеточных линий и обычно прогрессирует очень медленно, что приводит к низкой вирусной нагрузки. Тем не менее, некоторые группы смогли повысить вирусные нагрузки путем генерации подклонов клеточной линии50 или корректировки медиа-добавок51. Недавно генерация клонов кДНА52 и адаптация первичных изолятов пациента путем прохождения53,54 дальнейшего улучшения распространения HEV в клеточной культуре55. В этом протоколе мы использовали геном клеточной культуры, адаптированной штаммом Kernow-C1 (именуемым p6_WT)54, и штаммом мутанта, укрывающим мутацию, повышающую репликацию (называемую p6_G1634R)37. Kernow-C1 является наиболее часто используемым штаммом в культуре HEV клеток и способен производить высокие вирусные нагрузки. Оценивая вирусные номера копий РНК, репликация HEV может контролироваться in vitro. Тем не менее эти методы не позволяют оценить количество производимых инфекционных частиц. Таким образом, мы установили иммунофлуоресценции окрашивания для определения фокус формирования единиц (FFU/mL).
Описанный здесь метод56 может быть использован для производства полнометражных инфекционных вирусных частиц, способных инфицировать различные типы клеток различного происхождения, включая первичные клетки и клеточные линии млекопитающих. Это является фундаментальным условием для расшифровки важных аспектов инфекции HEV и тропизма. Нет необходимости в прививке с обычно ограниченными изолятами пациента. Производство инфекционных частиц HEV из плазмидов представляет собой бесконечный источник, что делает этот протокол сравнительно эффективным. Кроме того, эта система может быть использована для обратной генетики, позволяющей изучать изменение генома in vivo и их влияние на репликацию и пригодность HEV. Этот метод преодолевает многие ограничения и, может путь путь для разработки лекарств, mutagenesis исследований и оценки вирус-хозяин взаимодействий, таких как ограничения или факторы входа.
Начиная с плазмидной подготовки, урожайность ДНК должна превышать 150 нг/МЛ, чтобы иметь возможность выполнять несколько линейных данных из одного и того же плазмидного запаса, что сводит к минимуму риск индуцированного бактериями мутагенеза важнейших последовательностей генома. Кром?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны Сюзанне Эмерсон за клон вируса гепатита Е p6. HEV-специфический кролик гипериммун сыворотки любезно предоставлена Райнер Ульрих, Фридрих Loeffler институт, Германия. Кроме того, мы благодарим всех членов кафедры молекулярной и медицинской вирусологии Рурского университета Бохума за их поддержку и обсуждение. Цифры 1-7 были получены с BioRender.com.
0.45 µm mesh | Sarstedt | 83.1826 | Harvest extracellular Virus |
4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | Immunofluorescence |
Acetic acid | CarlRoth | 6755.1 | Collagen working solution |
Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | Virus harvesting |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | Selection of transformed bacteria |
ATP | Roche | 11140965001 | in vitro transcription and electroporation |
BioRender | BioRender | Figure Generation | |
CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
Collagen R solution 0.4 % sterile | Serva | 47256.01 | Collagen working solution |
CTP | Roche | 11140922001 | in vitro transcription |
Cuvette | Biorad | 165-2088 | Electroporation |
DAPI | Invitrogen | D21490 | Immunofluorescence |
DMEM | gibco | 41965-039 | Cell culture |
DNAse | Promega | M6101 | in vitro transcription |
DTT | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformation |
Fetal bovine serum | gibco | 10270106 | Cell culture |
Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Immunofluorescence |
GenePulser Xcell Electroporation System | BioRad | 1652660 | Electroporation |
Gentamycin | gibco | 15710049 | Cell culture |
GTP | Roche | 11140957001 | in vitro transcription |
H2O | Braun | 184238001 | Immunofluorescence |
Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
Horse serum | gibco | 16050122 | Immunofluorescence |
K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
L-Glutamin | gibco | 25030081 | Cell culture |
L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
MEM | gibco | 31095-029 | Cell culture |
MEM NEAA (100×) | gibco | 11140-035 | Cell culture |
MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA concentration |
MluI enzyme | NEB | R0198L | Linearization |
NEB buffer | NEB | included in R0198L | Linearization |
NucleoSpin Plasmid kit | Macherey & Nagel | 740588.250 | Plasmid preparation |
NucleoSpin RNA Clean-up Kit | Macherey & Nagel | 740948.250 | RNA purification |
PBS | gibco | 70011051 | Cell culture |
Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Cell culture |
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) | Todt et.al | Virus production | |
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) | Shukla et al. | GenBank accession no. JQ679013 | Virus production |
Primary antibody 1E6 | LS-Bio | C67675 | Immunofluorescence |
Primary antibody 8282 | Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany | ||
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | DNA extraction |
Ribo m7G Cap Analog | Promega | P1711 | in vitro transcription |
RNase away | CarlRoth | A998.3 | RNA purification |
RNasin (RNase inhibitor) | Promega | N2515 | in vitro transcription |
Secondary antibody donkey anti-mouse 488 | Thermo Fisher | A-21202 | Immunofluorescence |
Secondary antibody goat anti-rabbit 488 | Thermo Fisher | A-11008 | Immunofluorescence |
Sodium Pyruvat | gibco | 11360070 | Cell culture |
T7 RNA polymerase | Promega | P2077 | in vitro transcription |
Transcription Buffer | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
Triton X-100 | CarlRoth | 3051.3 | Immunofluorescence |
Trypsin-EDTA (0.5 %) | gibco | 15400054 | Cell culture |
ultra-low IgG | gibco | 1921005PJ | Cell culture |
UTP | Roche | 11140949001 | in vitro transcription |