Summary

Модель клеточной культуры для производства высокой тетер гепатита E Вирус Запасы

Published: June 26, 2020
doi:

Summary

Описанный здесь является эффективным методом о том, как производить высокие вирусные титр запасов вируса гепатита Е (HEV), чтобы эффективно заразить клетки гепатомы. С представленным методом, как неохотные, так и окутанные вирусные частицы могут быть собраны и использованы для прививки различных клеточных линий.

Abstract

Вирус гепатита Е является основной причиной цирроза печени и печеночной недостаточности с ростом распространенности во всем мире. Одноцепочечный РНК-вирус в основном передается при переливании крови, неадекватных санитарных условиях и загрязненных пищевых продуктах. На сегодняшний день не по этикетке препарат рибавирин (RBV) является лечение выбора для многих пациентов. Тем не менее, конкретные лечения HEV еще предстоит определить. До сих пор знания о жизненном цикле HEV и патогенеза были серьезно затруднены из-за отсутствия эффективной системы культуры Клеток HEV. Надежная система клеточной культуры имеет важное значение для изучения вирусного жизненного цикла, который также включает вирусный патогенез. С методом описанным здесь одно может произвести вирусные titers up to 3 x 106 блока фокусим формирования/mL (FFU/mL) non-enveloped HEV и up to 5 x 104 FFU/mL окутанного HEV. Используя эти частицы, можно заразить различные клетки различного происхождения, включая первичные клетки и человека, а также линии клеток животных. Производство инфекционных частиц HEV из плазмидов представляет собой бесконечный источник, что делает этот протокол чрезвычайно эффективным.

Introduction

Гепатит Е является довольно недооцененным заболеванием с ростом распространенности во всем мире. Около 20 миллионов случаев инфицирования приводят к более чем 70 000 случаев смерти в год1. Основной агент, вирус гепатита Е (HEV), был недавно переназначен и в настоящее время классифицируется в семье Hepeviridae в том числе рода ортохерепвирус и Piscihepevirus. HEV различного происхождения классифицируются в пределах видов Orthohepevirus A-D в том числе изоляты от людей, свиней, кроликов, крыс, птиц и других млекопитающих2. В настоящее время выявлено восемь различных генотипов (GT) положительно-ориентированного одноцепоченого РНК-вируса2. Хотя они отличаются по последовательности идентичности, маршрутов передачи и географического распределения, их геномная структура очень сохраняется. Более конкретный, геном 7.2 kbp HEV делится на 3 основных открытых считывания кадров (ORF1-3). В то время как ORF1 кодирует все ферменты, необходимые для успешной репликации в клетке-хозяине, ORF2 кодирует капсидный белок, а белок ORF3 работает как функциональный ионный канал, необходимый для сборки и высвобождения инфекционных частиц3. После выпуска в базальных или апических просвета HEV существует в обоих, quasienveloped и не-окутанных / голых видов в зависимости от того, вирус происходит от крови или кала, соответственно4,5.

В то время как GT1 и GT2 в основном встречаются в развивающихся странах, заражая людей6 только по фекально-устному маршруту, GT3, GT4 и GT7 преимущественно встречаются в развитых странах1,7 с различными видами, служащими в качестве резервуаров, например, свиньи8, крыса9, курица10,11, олени12, мангуста13, летучая мышь14, кролик15,16, дикий кабан17 и многое другое7,18,19, предоставляя доказательства зооноза7,20,21,22. Помимо неадекватных санитарных условий23 и загрязненных пищевых продуктов12,,24,25,,26, передача через переливание крови и трансплантации органов также возможно27,28., HEV является распространенной причиной цирроза печени и печеночной недостаточности29 особенно у пациентов с уже существующими заболеваниями печени, иммунокомпромиссных лиц (генотип 3, 4 и 7) и беременных женщин (генотип 1). Следует отметить, Есть также экстра-епатические проявления, такие как гематопоэтическое заболевание30,31,32, неврологические расстройства33 и почечной травмы34.

На сегодняшний день, вне этикетки препарат рибавирин (RBV) является лечение выбора для многих инфицированных пациентов35,36. Тем не менее, случаи отказа лечения и плохих клинических долгосрочных исходов были зарегистрированы. Неудача лечения была связана с вирусным мутагенезом и повышенной вирусной неоднородностью у хронически инфицированных пациентов37,,38,,39. Напротив, недавнее европейское ретроспективное многоцентровое исследование не смогло соотнести мутации полимеразы с неудачей леченияРБВ 40. В клинических наблюдениях и экспериментах в пробирке интерферон41,,42,,43,софосбувир44,,45,соли цинка46 и силвестрол47,48 также показали противовирусные эффекты. Тем не менее, конкретные лечения HEV еще предстоит найти, препятствует отсутствие знаний о жизненном цикле HEV и его патогенеза. Таким образом, надежная система клеточной культуры для вирусологических исследований и разработки новых противовирусных препаратов срочно необходимо49.

К сожалению, как и другие вирусы гепатита, HEV трудно размножаться в обычных клеточных линий и обычно прогрессирует очень медленно, что приводит к низкой вирусной нагрузки. Тем не менее, некоторые группы смогли повысить вирусные нагрузки путем генерации подклонов клеточной линии50 или корректировки медиа-добавок51. Недавно генерация клонов кДНА52 и адаптация первичных изолятов пациента путем прохождения53,54 дальнейшего улучшения распространения HEV в клеточной культуре55. В этом протоколе мы использовали геном клеточной культуры, адаптированной штаммом Kernow-C1 (именуемым p6_WT)54, и штаммом мутанта, укрывающим мутацию, повышающую репликацию (называемую p6_G1634R)37. Kernow-C1 является наиболее часто используемым штаммом в культуре HEV клеток и способен производить высокие вирусные нагрузки. Оценивая вирусные номера копий РНК, репликация HEV может контролироваться in vitro. Тем не менее эти методы не позволяют оценить количество производимых инфекционных частиц. Таким образом, мы установили иммунофлуоресценции окрашивания для определения фокус формирования единиц (FFU/mL).

Описанный здесь метод56 может быть использован для производства полнометражных инфекционных вирусных частиц, способных инфицировать различные типы клеток различного происхождения, включая первичные клетки и клеточные линии млекопитающих. Это является фундаментальным условием для расшифровки важных аспектов инфекции HEV и тропизма. Нет необходимости в прививке с обычно ограниченными изолятами пациента. Производство инфекционных частиц HEV из плазмидов представляет собой бесконечный источник, что делает этот протокол сравнительно эффективным. Кроме того, эта система может быть использована для обратной генетики, позволяющей изучать изменение генома in vivo и их влияние на репликацию и пригодность HEV. Этот метод преодолевает многие ограничения и, может путь путь для разработки лекарств, mutagenesis исследований и оценки вирус-хозяин взаимодействий, таких как ограничения или факторы входа.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты выполняются в состоянии BSL-2. Все материалы, которые соприкасаются с вирусом гепатита Е РНК или инфекционным вирусом, должны быть промыты должным образом с 4% Kohrsolin FF из контейнера для отходов внутри капота до удаления. 1. Плазмидная подготовка …

Representative Results

В этом протоколе мы описываем производство высокотер инфекционных HEVcc. Первый шаг заключается в том, чтобы изолировать плазмид ДНК (pBluescript_SK_HEVp654 и pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Рисунок 8a), который затем линейный ограничения пищеварения и очищены для in vitro тра…

Discussion

Начиная с плазмидной подготовки, урожайность ДНК должна превышать 150 нг/МЛ, чтобы иметь возможность выполнять несколько линейных данных из одного и того же плазмидного запаса, что сводит к минимуму риск индуцированного бактериями мутагенеза важнейших последовательностей генома. Кром?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны Сюзанне Эмерсон за клон вируса гепатита Е p6. HEV-специфический кролик гипериммун сыворотки любезно предоставлена Райнер Ульрих, Фридрих Loeffler институт, Германия. Кроме того, мы благодарим всех членов кафедры молекулярной и медицинской вирусологии Рурского университета Бохума за их поддержку и обсуждение. Цифры 1-7 были получены с BioRender.com.

Materials

0.45 µm mesh Sarstedt 83.1826 Harvest extracellular Virus
4 % Histofix CarlRoth P087.4 Immunofluorescence
Acetic acid CarlRoth 6755.1 Collagen working solution
Amicon Ultra-15 Merck Millipore UFC910024 Virus harvesting
Ampicillin Sigma-Aldrich A1593 Selection of transformed bacteria
ATP Roche 11140965001 in vitro transcription and electroporation
BioRender BioRender Figure Generation
CaCl2 Roth 5239.2 Cytomix
Collagen R solution 0.4 % sterile Serva 47256.01 Collagen working solution
CTP Roche 11140922001 in vitro transcription
Cuvette Biorad 165-2088 Electroporation
DAPI Invitrogen D21490 Immunofluorescence
DMEM gibco 41965-039 Cell culture
DNAse Promega M6101 in vitro transcription
DTT Promega included in P2077 in vitro transcription
EGTA Roth 3054.3 Cytomix
Escherichia coli JM109 Promega L2005 Transformation
Fetal bovine serum gibco 10270106 Cell culture
Fluoromount SouthernBiotech 0100-01 Immunofluorescence
GenePulser Xcell Electroporation System BioRad 1652660 Electroporation
Gentamycin gibco 15710049 Cell culture
GTP Roche 11140957001 in vitro transcription
H2O Braun 184238001 Immunofluorescence
Hepes Invitrogen 15630-03 Cytomix
Horse serum gibco 16050122 Immunofluorescence
K2HPO4 Roth P749.1 Cytomix
KCL Roth 6781.3 Cytomix
KH2PO4 Roth 3904.2 Cytomix
L-Glutamin gibco 25030081 Cell culture
L-Glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251-5G Cytomix
MEM gibco 31095-029 Cell culture
MEM NEAA (100×) gibco 11140-035 Cell culture
MgCl2 Roth 2189.2 Cytomix
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One Thermo Fisher ND-ONE-W DNA/RNA concentration
MluI enzyme NEB R0198L Linearization
NEB buffer NEB included in R0198L Linearization
NucleoSpin Plasmid kit Macherey & Nagel 740588.250 Plasmid preparation
NucleoSpin RNA Clean-up Kit Macherey & Nagel 740948.250 RNA purification
PBS gibco 70011051 Cell culture
Pen/Strep Thermo Fisher 15140122 Cell culture
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) Todt et.al Virus production
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) Shukla et al. GenBank accession no. JQ679013 Virus production
Primary antibody 1E6 LS-Bio C67675 Immunofluorescence
Primary antibody 8282 Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 DNA extraction
Ribo m7G Cap Analog Promega P1711 in vitro transcription
RNase away CarlRoth A998.3 RNA purification
RNasin (RNase inhibitor) Promega N2515 in vitro transcription
Secondary antibody donkey anti-mouse 488 Thermo Fisher A-21202 Immunofluorescence
Secondary antibody goat anti-rabbit 488 Thermo Fisher A-11008 Immunofluorescence
Sodium Pyruvat gibco 11360070 Cell culture
T7 RNA polymerase Promega P2077 in vitro transcription
Transcription Buffer Promega included in P2077 in vitro transcription
Triton X-100 CarlRoth 3051.3 Immunofluorescence
Trypsin-EDTA (0.5 %) gibco 15400054 Cell culture
ultra-low IgG gibco 1921005PJ Cell culture
UTP Roche 11140949001 in vitro transcription

References

  1. Wedemeyer, H., Pischke, S., Manns, M. P. Pathogenesis and treatment of hepatitis e virus infection. Gastroenterology. 142 (6), 1388-1397 (2012).
  2. Smith, D. B., et al. Proposed reference sequences for hepatitis E virus subtypes. The Journal of General Virology. 97 (3), 537-542 (2016).
  3. Ding, Q., et al. Hepatitis E virus ORF3 is a functional ion channel required for release of infectious particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (5), 1147-1152 (2017).
  4. Chapuy-Regaud, S., et al. Characterization of the lipid envelope of exosome encapsulated HEV particles protected from the immune response. Biochimie. 141, 70-79 (2017).
  5. Yin, X., Ambardekar, C., Lu, Y., Feng, Z. Distinct Entry Mechanisms for Nonenveloped and Quasi-Enveloped Hepatitis E Viruses. Journal of Virology. 90 (8), 4232-4242 (2016).
  6. Khuroo, M. S., Khuroo, M. S., Khuroo, N. S. Hepatitis E: Discovery, global impact, control and cure. World Journal of Gastroenterology. 22 (31), 7030-7045 (2016).
  7. Rasche, A., et al. Hepatitis E Virus Infection in Dromedaries, North and East Africa, United Arab Emirates, and Pakistan, 1983-2015. Emerging Infectious Diseases. 22 (7), 1249-1252 (2016).
  8. Hsieh, S. Y., et al. Identity of a novel swine hepatitis E virus in Taiwan forming a monophyletic group with Taiwan isolates of human hepatitis E virus. Journal of Clinical Microbiology. 37 (12), 3828-3834 (1999).
  9. Johne, R., et al. Detection of a novel hepatitis E-like virus in faeces of wild rats using a nested broad-spectrum RT-PCR. The Journal of General Virology. 91, 750-758 (2010).
  10. Payne, C. J., Ellis, T. M., Plant, S. L., Gregory, A. R., Wilcox, G. E. Sequence data suggests big liver and spleen disease virus (BLSV) is genetically related to hepatitis E virus. Veterinary Microbiology. 68 (1-2), 119-125 (1999).
  11. Haqshenas, G., Shivaprasad, H. L., Woolcock, P. R., Read, D. H., Meng, X. -. J. Genetic identification and characterization of a novel virus related to human hepatitis E virus from chickens with hepatitis–splenomegaly syndrome in the United States. Journal of General Virology. 82, 2449-2462 (2001).
  12. Tei, S., Kitajima, N., Takahashi, K., Mishiro, S. Zoonotic transmission of hepatitis E virus from deer to human beings. The Lancet. 362 (9381), 371-373 (2003).
  13. Nakamura, M., et al. Hepatitis E virus infection in wild mongooses of Okinawa, Japan: Demonstration of anti-HEV antibodies and a full-genome nucleotide sequence. Hepatology Research: the Official Journal of the Japan Society of Hepatology. 34 (3), 137-140 (2006).
  14. Drexler, J. F., et al. Bats worldwide carry hepatitis E virus-related viruses that form a putative novel genus within the family Hepeviridae. Journal of Virology. 86 (17), 9134-9147 (2012).
  15. Zhao, C., et al. A novel genotype of hepatitis E virus prevalent among farmed rabbits in China. Journal of Medical Virology. 81 (8), 1371-1379 (2009).
  16. Lhomme, S., et al. Risk of zoonotic transmission of HEV from rabbits. Journal of Clinical Virology: the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 58 (2), 357-362 (2013).
  17. Kaci, S., Nöckler, K., Johne, R. Detection of hepatitis E virus in archived German wild boar serum samples. Veterinary Microbiology. 128 (3-4), 380-385 (2008).
  18. Liu, B., et al. Avian hepatitis E virus infection of duck, goose, and rabbit in northwest China. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 76 (2018).
  19. Raj, V. S., et al. Novel hepatitis E virus in ferrets, the Netherlands. Emerging Infectious Diseases. 18 (8), 1369-1370 (2012).
  20. Dong, C., et al. Restricted enzooticity of hepatitis E virus genotypes 1 to 4 in the United States. Journal of Clinical Microbiology. 49 (12), 4164-4172 (2011).
  21. Goens, S. D., Perdue, M. L. Hepatitis E viruses in humans and animals. Animal Health Research Reviews. 5 (2), 145-156 (2004).
  22. Geng, Y., Wang, Y. Transmission of Hepatitis E Virus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 948, 89-112 (2016).
  23. Naik, S. R., Aggarwal, R., Salunke, P. N., Mehrotra, N. N. A large waterborne viral hepatitis E epidemic in Kanpur, India. Bulletin of the World Health Organization. 70 (5), 597-604 (1992).
  24. Feagins, A. R., Opriessnig, T., Guenette, D. K., Halbur, P. G., Meng, X. -. J. Detection and characterization of infectious Hepatitis E virus from commercial pig livers sold in local grocery stores in the USA. The Journal of General Virology. 88, 912-917 (2007).
  25. Colson, P., et al. Pig liver sausage as a source of hepatitis E virus transmission to humans. The Journal of Infectious Diseases. 202 (6), 825-834 (2010).
  26. Wenzel, J. J., et al. Detection of hepatitis E virus (HEV) from porcine livers in Southeastern Germany and high sequence homology to human HEV isolates. Journal of Clinical Virology: the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 52 (1), 50-54 (2011).
  27. Colson, P., et al. Transfusion-associated Hepatitis E, France. Emerging Infectious Diseases. 13 (4), 648-649 (2007).
  28. Kamp, C., et al. Impact of hepatitis E virus testing on the safety of blood components in Germany – results of a simulation study. Vox Sanguinis. , (2018).
  29. Kamar, N., Dalton, H. R., Abravanel, F., Izopet, J. Hepatitis E virus infection. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 116-138 (2014).
  30. Pischke, S., Behrendt, P., Manns, M. P., Wedemeyer, H. HEV-associated cryoglobulinaemia and extrahepatic manifestations of hepatitis E. The Lancet Infectious Diseases. 14 (8), 678-679 (2014).
  31. Colson, P., et al. Severe thrombocytopenia associated with acute hepatitis E virus infection. Journal of Clinical Microbiology. 46 (7), 2450-2452 (2008).
  32. Mishra, P., Mahapatra, M., Kumar, R., Pati, H. P. Autoimmune hemolytic anemia and erythroid hypoplasia associated with hepatitis E. Indian Journal of Gastroenterology: Official Journal of the Indian Society of Gastroenterology. 26 (4), 195-196 (2007).
  33. Sood, A., Midha, V., Sood, N. Guillain-Barré syndrome with acute hepatitis E. The American Journal of Gastroenterology. 95 (12), 3667-3668 (2000).
  34. Fousekis, F. S., Mitselos, I. V., Christodoulou, D. K. Extrahepatic manifestations of hepatitis E virus: An overview. Clinical and Molecular Hepatology. 26 (1), 16-23 (2020).
  35. Pischke, S., et al. Ribavirin treatment of acute and chronic hepatitis E: A single-centre experience. Liver International: Official Journal of the International Association for the Study of the Liver. 33 (5), 722 (2013).
  36. Kamar, N., et al. Ribavirin for Chronic Hepatitis E Virus Infection in Transplant Recipients. The New England Journal of Medicine. 370, 1111-1120 (2014).
  37. Todt, D., et al. In vivo evidence for ribavirin-induced mutagenesis of the hepatitis E virus genome. Gut. 65, 1733-1743 (2016).
  38. Todt, D., Walter, S., Brown, R. J. P., Steinmann, E. Mutagenic Effects of Ribavirin on Hepatitis E Virus-Viral Extinction versus Selection of Fitness-Enhancing Mutations. Viruses. 8 (10), 8100283 (2016).
  39. Todt, D., Meister, T. L., Steinmann, E. Hepatitis E virus treatment and ribavirin therapy: Viral mechanisms of nonresponse. Current Opinion in Virology. 32, 80-87 (2018).
  40. Kamar, N., et al. Ribavirin for Hepatitis E Virus Infection After Organ Transplantation: A Large European Retrospective Multicenter Study. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. , (2019).
  41. Kamar, N., et al. Influence of immunosuppressive therapy on the natural history of genotype 3 hepatitis-E virus infection after organ transplantation. Transplantation. 89 (3), 353-360 (2010).
  42. Kamar, N., et al. Pegylated interferon-alpha for treating chronic hepatitis E virus infection after liver transplantation. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 50 (5), 30-33 (2010).
  43. Todt, D., et al. Antiviral Activities of Different Interferon Types and Subtypes against Hepatitis E Virus Replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (4), 2132-2139 (2016).
  44. Dao Thi, V. L., et al. Sofosbuvir Inhibits Hepatitis E Virus Replication In Vitro and Results in an Additive Effect When Combined with Ribavirin. Gastroenterology. 150 (1), 82-85 (2016).
  45. van der Valk, M., Zaaijer, H. L., Kater, A. P., Schinkel, J. Sofosbuvir shows antiviral activity in a patient with chronic hepatitis E virus infection. Journal of Hepatology. 66 (1), 242-243 (2017).
  46. Kaushik, N., et al. Zinc Salts Block Hepatitis E Virus Replication by Inhibiting the Activity of Viral RNA-Dependent RNA Polymerase. Journal of Virology. 91 (21), (2017).
  47. Todt, D., et al. The natural compound silvestrol inhibits hepatitis E virus (HEV) replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 157, 151-158 (2018).
  48. Glitscher, M., et al. Inhibition of Hepatitis E Virus Spread by the Natural Compound Silvestrol. Viruses. 10 (6), 301 (2018).
  49. Kinast, V., Burkard, T. L., Todt, D., Steinmann, E. Hepatitis E Virus Drug Development. Viruses. 11 (6), 485 (2019).
  50. Schemmerer, M., et al. Enhanced Replication of Hepatitis E Virus Strain 47832c in an A549-Derived Subclonal Cell Line. Viruses. 8 (10), 267 (2016).
  51. Huang, R., et al. Cell Culture of Sporadic Hepatitis E Virus in China. Clinical and Vaccine Immunology. 6 (5), 729-733 (1999).
  52. Emerson, S. U., et al. Recombinant hepatitis E virus genomes infectious for primates: Importance of capping and discovery of a cis-reactive element. PNAS. 98 (26), 15270-15275 (2001).
  53. Shukla, P., et al. Cross-species infections of cultured cells by hepatitis E virus and discovery of an infectious virus-host recombinant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2438-2443 (2011).
  54. Shukla, P., et al. Adaptation of a genotype 3 hepatitis E virus to efficient growth in cell culture depends on an inserted human gene segment acquired by recombination. Journal of Virology. 86 (10), 5697-5707 (2012).
  55. Meister, T. L., Bruening, J., Todt, D., Steinmann, E. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Research. 163, 34-49 (2019).
  56. Todt, D., et al. Robust hepatitis E virus infection and transcriptional response in human hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2020).
  57. Ankavay, M., et al. New insights into the ORF2 capsid protein, a key player of the hepatitis E virus lifecycle. Scientific Reports. 9 (1), 6243 (2019).
  58. Schemmerer, M., Johne, R., Erl, M., Jilg, W., Wenzel, J. J. Isolation of Subtype 3c, 3e and 3f-Like Hepatitis E Virus Strains Stably Replicating to High Viral Loads in an Optimized Cell Culture System. Viruses. 11 (6), 483 (2019).

Play Video

Cite This Article
Meister, T. L., Klöhn, M., Steinmann, E., Todt, D. A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks. J. Vis. Exp. (160), e61373, doi:10.3791/61373 (2020).

View Video