Summary
Beskrivs här är en effektiv metod för hur man producerar hög viral titer lager av hepatit E-virus (HEV) för att effektivt infektera hepatoma celler. Med den presenterade metoden kan både icke-hölje, samt höljes virala partiklar skördas och användas för att inokukulera olika cellinjer.
Abstract
Hepatit E-virus är den främsta orsaken till levercirros och leversvikt med ökande prevalens över hela världen. Det ensträngade RNA-viruset överförs huvudsakligen genom blodtransfusioner, otillräckliga sanitära förhållanden och förorenade livsmedelsprodukter. Hittills off-label drogen ribavirin (RBV) är behandling av val för många patienter. En specifik HEV-behandling återstår dock att identifiera. Hittills har kunskapen om HEV livscykel och patogenes allvarligt hämmats på grund av bristen på en effektiv HEV cell kultursystem. Ett robust cellodlingssystem är viktigt för studiet av den virala livscykeln som även omfattar viruspatogenesen. Med den metod som beskrivs här kan man producera virala titrar på upp till 3 x 106 fokusbildande enhet/ml (FFU/mL) av icke-höljeförsörda HEV och upp till 5 x 104 FFU/ml omsluten HEV. Med hjälp av dessa partiklar är det möjligt att infektera en mängd olika celler av olika ursprung, inklusive primära celler och mänskliga, samt djurcellslinjer. Produktionen av infektiösa HEV-partiklar från plasmider utgör en oändlig källa, vilket gör detta protokoll ytterst effektivt.
Introduction
Hepatit E är en ganska underskattad sjukdom med ökande prevalens över hela världen. Omkring 20 miljoner infektioner resulterar i mer än 70.000 dödsfall per år1. Det underliggande medlet, hepatit E-virus (HEV), omplacerades nyligen och klassificeras nu inom familjen Hepeviridae inklusive släktena Orthohepevirus och Piscihepevirus. HEV av olika ursprung klassificeras inom arten Orthohepevirus A-D inklusive isolat från människor, svin, kaniner, råttor, fåglar och andra däggdjur2. För närvarande har åtta olika genotyper (GT) av det positiva, enkelsträngade RNA-viruset identifierats2. Även om de skiljer sig åt i sin sekvensidentitet, överföringsvägar och geografisk fördelning, är deras genomiska struktur mycket bevarad. Mer specifikt är 7,2 kbp HEV-genomet indelat i 3 stora öppna läsramar (ORF1-3). Medan ORF1 kodar alla enzymer som behövs för en lyckad replikering i värdcellen kodar ORF2 capsidproteinet och ORF3-proteinet fungerar som en funktionell jonkanal som krävs för montering och frisättning av infektiösa partiklar3. När de släpps ut i den basala eller apikala lumen HEV finns i båda, quasienveloped och icke-höljeförsedd / naken art beroende på om viruset kommer från blod eller avföring,respektive 4,5.
Medan GT1 och GT2 huvudsakligen finns i utvecklingsländer som enbart infekterar människor6 via fekal-oral väg, GT3, GT4 och GT7 förekommer främst i utvecklade länder1,7 med en mängd olika arter som fungerar som reservoarer, t.ex., svin8,råtta9,kyckling10,,11, rådjur12, mongoose13,fladdermus14,kanin15,,16, vildsvin17 och många fler7,,18,19, som visar zoonos7,,20,,21,22. Förutom otillräckliga sanitära förhållanden23 och förorenade livsmedelsprodukter12,,24,,25,26,överföring via blodtransfusion och organtransplantationer är också möjligt27,28. HEV är en vanlig orsak till levercirros och leversvikt29 särskilt hos patienter med redan existerande leversjukdom, immunkomprometterade individer (genotyp 3, 4 och 7) och gravida kvinnor (genotyp 1). Observera att det också finns extrahepatiska manifestationer som hematopoietisk sjukdom30,,31,32, neurologiska sjukdomar33 och njurskada34.
Hittills är off-label drogen ribavirin (RBV) behandling av val för många infekterade patienter35,36. Fall av behandlingssvikt och dåliga kliniska långsiktiga resultat har dock rapporterats. Behandlingssvikt har kopplats till viral mutagenesis och ökad viral heterogenitet hos kroniskt infekterade patienter37,38,39. Tvärtom kunde en nyligen genomförd europeisk retrospektiv multicenterstudie inte korrelera polymerasmutationer med RBV-behandlingssvikt40. I kliniska observationer och in vitro-experiment, interferon41,42,43, sofosbuvir44,45, zinksalter46 och silvestrol47,48 har också visat antivirala effekter. Icke desto mindre återstår en specifik HEV behandling att finna, hämmas av bristen på kunskap om HEV livscykel och dess patogenes. Därför behövs ett robust cellodlingssystem för virologiska studier och utveckling av nya antivirala läkemedel49.
Tyvärr, liksom andra hepatit virus, HEV är svårt att sprida sig i konventionella cellinjer och oftast fortskrider mycket långsamt leder till låga virusbelastningar. Ändå, vissa grupper kunde öka virusbelastningar av generering av cellinje subkloner50 eller justering av media kosttillskott51. Nyligen generering av cDNA kloner52 och anpassning av primära patienten isolat genom att passera53,54 ytterligare förbättrad HEV förökning i cellkultur55. I detta protokoll använde vi arvsmassan hos en cellkultur anpassad Kernow-C1 stam (kallad p6_WT)54 och en mutant stam som hyser en replikeringshöjande mutation (kallad p6_G1634R)37. Kernow-C1 är den mest använda stammen i HEV cellkultur och kan producera höga virusbelastningar. Genom att bedöma virala RNA-kopieringsnummer kan HEV-replikation övervakas in vitro. Dessa tekniker tillåter dock inte bedömning av antalet smittsamma partiklar som produceras. Därför har vi etablerat en immunofluorescensfärgning för att bestämma Fokusbildande enheter (FFU/mL).
Den här beskrivna metoden56 kan användas för att producera full längd infektiösa viruspartiklar som kan infektera en mängd olika celltyper från olika ursprung, inklusive primära celler och däggdjurs cellinjer. Detta är en grundläggande förutsättning för att dechiffrera viktiga aspekter av HEV-infektion och tropism. Det finns inget behov av inokulering med vanligtvis begränsade patientisolat. Produktionen av infektiösa HEV-partiklar från plasmider utgör en oändlig källa, vilket gör detta protokoll jämförbart effektivt. Dessutom kan detta system användas för omvänd genetik som möjliggör studier av in vivo-identifierade genomförändringar och deras inverkan på HEV-replikation och kondition. Denna teknik övervinner många begränsningar och, kan väg vägen för läkemedelsutveckling, mutagenesis studier och utvärdering av virus-värd interaktioner såsom begränsning eller faktorer inträde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ALLA experiment utförs under BSL-2-tillstånd. Allt material som kommer i kontakt med hepatit E-virus RNA eller smittsamma virus måste sköljas ordentligt med 4% Kohrsolin FF från en avfallsbehållare inuti huven före bortskaffande.
1. Plasmid förberedelse
- Inokulera 200 ml LB medium som innehåller 100 μg/mL ampicillin med transformerad Escherichia coli JM109 som innehåller en plasmidkodning för full längd HEV gt3 Kernow-C1p6 sekvens (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54 eller pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37). Inkubera i 16 timmar vid 37 °C under permanent omrörning (170 varv/min).
OBS: Plasmid isolering utfördes med hjälp av en plasmid extraktion kit (se Tabell över material). - Efter tillverkarprotokollet, snurra ner 200 ml övernattningskultur vid 6 000 x g och 4 °C i 10 minuter och kasta supernatanten. Bakteriepelleten kan frysas och förvaras vid -20 °C.
- Resuspend bakteriepellet i 4 ml Resuspension buffert genom pipettering upp och ner med en 10 ml serologisk pipett och en pipett man. Dessutom virvel rigoröst.
- Tillsätt 4 ml förkrigsbaserad Lysbuffert (30-40 °C). Invertera försiktigt i flera gånger och inkubera i rumstemperatur (RT) i 5 min.
- Tillsätt 4,8 ml neutraliseringsbuffert, vänd försiktigt in och se till att lysate är kvantitativt neutraliserad (se tillverkarens beskrivning). Centrifugera sedan vid 11 000 x g och 4 °C i 20 min.
- Placera en 2 cm x 2 cm mull bit inuti en 1 mL icke-filterspets, ladda resuspended, lysed och neutraliserade supernatant i 10 ml serologisk pipett, tillsätt 1 mL spets med mull till spetsen av den serologiska pipetten och filtrera supernatanten i ett nytt 50 ml-rör.
OBS: Supernatant kan förvaras vid 4 °C i upp till 30 minuter om det behövs. - I flera steg skall 750 μL av det filtrerade supernatanten på totalt 4 filterkolumner (som finns i satsen) och centrifugera vid 11 000 x g i 30 s. Kassera flödet och upprepa denna sekvens tills alla supernatant appliceras på filterkolumnerna.
- Tvätta varje filterkolonn två gånger med 500 μL förvärmd (50 °C) tvättbuffert AW vid 11 000 x g i 30 s och kasta flödet därefter.
- Tvätta varje filterkolonn med 600 μl tvättbuffert A4 genom centrifugering vid 11 000 x g i 30 s. Kassera flödet och torka filterkolumnerna genom centrifugering vid 11 000 x g i 2 min.
- Plasmid-DNA:t från varje filterkolumn genom att överföra 60 μL elueringsbuffert till filterkolonnernas centrum. Inkubera i 1 min vid RT och centrifug på 11 000 x g i 1 min.
- Kombinera eluater och mät koncentrationen av det extraherade plasmid-DNA:t med hjälp av en spektrofotometer.
2. Linjärisering och DNA-rening
Figur 1: Schematisk experimentell inställning för plasmid linjärisering och DNA-rening. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
OBS: Linjäriseringen ökar RNA-utbytet vid in vitro-transkription (steg 3)
- För att linjärisera plasmid-DNA:et( figur 1 ) blanda 10 μg av mallen DNA (extraherad i steg 1), 10 μl av bufferten, 2 μL MluI och justera till en volym av 100 μL med H2O.
- Inkubera i 1 h vid 37 °C och bekräfta linjärisering av plasmid av agaros gelelektrofores (t.ex. ladda icke-smält och smält plasmid DNA [1 μL DNA vardera] på en 1% agares gel och kör elektrofores vid 120 V konstant ström).
- Efter tillverkarens protokoll för DNA-extraktion (se Register över material, figur 1), blanda 500 μL bindningsbuffert, som finns i satsen, med 100 μl linjärt DNA. Applicera provet på en filterkolumn och centrifugera på 17 800 x g i 30 s. Kasta flödet och placera tillbaka filterkolumnerna i samma rör.
- Tvätta filterkolonnen genom att tillsätta 650 μL tvättbuffert och centrifugering vid 17 800 x g i 30 s. Kasta genom flödet och placera tillbaka filterkolonnen i samma rör. För att ta bort den återstående tvättbufferten, torka centrifugen vid 17 800 x g i 60 s och placera varje filterkolonn i ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör efteråt.
- Elute DNA genom att överföra 60 μl förkrigs-H2O (PCR-klass, 70 °C) till mitten av filtret. Inkubera i 1 min vid 70 °C och centrifug vid 18 000 x g i 1 min. Mät koncentrationen av det renade DNA:t med hjälp av en spektrofotometer.
OBS: Förvara DNA vid -20 °C tills in vitro-transkription.
3. In vitro-transkription av hellång HEV-genotyp 3 p6 DNA och RNA-rening
Figur 2: Schematisk experimentell inställning för in vitro-transkription och RNA-rening. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
OBS: In vitro-transkription är nödvändigt för att producera virusgenomiskt RNA från plasmid-DNA.
- För in vitro-transkriptionsblandning 20 μL 5x T7-transkriptionsbuffert, 10 mM DTT, 100 U ribonukleashämmare, 25 mM ATP, CTP och UTP, 12,5 mM GTP, 5 mM Ribo m7G Cap Analog, 2 μg linjär-DNA-mall och 80 U T7 RNA-polymeras. Fyll upp till 100 μL med nukleasfri H2O, blanda väl och inkubera i 2 timmar vid 37 °C.
OBS: Korttidsförvaring vid -20 °C är möjlig efter steg 3.1 till 3.1.2.- Tillsätt 2 μl T7 RNA-polymeras, blanda väl och inkubera ytterligare 2 h vid 37 °C.
- För att smälta den ursprungliga DNA-mallen, tillsätt 7,5 μl DNase (RNase fri, 1 U/μL), blanda väl och inkubera vid 30 min vid 37 °C.
OBS: Rengör alla ytor och pipetter med ytdekontaminant för RNase när du arbetar med RNA för att undvika nedbrytning. Se också till att alla reaktionsrör är RNase-fria och sterila. Använd endast tips med filter och späd enbart med RNase-fritt och sterilt vatten.
- Efter tillverkningens protokoll för RNA-extraktion (se Register över material, figur 2), bered en förblandning av Lysis-buffert och 100 % etanol genom att blanda 330 μl lysisbuffert och 330 μL 100 % etanol för varje in vitro-transkriptionsreaktion. Tillsätt 660 μL Lysbuffert-etanolpremix till 110 μL RNA och virvel. Fyll prov på en filterkolonn och centrifugen vid 8000 x g i 30 s. Kasta flödet och placera tillbaka filterkolonnen i samma rör.
- Tillsätt 600 μl tvättbuffert och centrifug vid 8000 x g i 30 s. Kasta flödet och placera filterkolonnen i samma rör. Tillsätt 350 μl tvättbuffert och centrifug vid 8000 x g i 2 min för att avlägsna resttvättbufferten. Placera varje filterkolonn i ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör. Öppna locket på filterkolonnen och låt kolonnen torka i 3 min.
- Elute RNA genom att placera 50 μL RNase fri H2O i mitten av filterkolonnen. Inkubera i 1 min vid RT och efterföljande centrifug vid 8 000 x g i 1 min. Kontrollera RNA-integriteten genom att lasta 1 μl RNA på en agarad gel och mät koncentrationen av extraherat RNA med hjälp av en spektrofotometer.
OBS: Förvara RNA vid -80 °C tills elektroporation och tina uteslutande RNA på is för att undvika nedbrytning.
4. Beredning av HepG2 celler för cellodling härledda HEV (HEVcc) produktion
Figur 3: Schematisk experimentell inställning för beredning av HepG2-celler för cellodling som härleds HEV (HEVcc) produktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
OBS: För att undvika kontaminering utfördes beredning av celler, elektroporation, infektion, skörd och cellfixering under sterila förhållanden i en anläggning på biosäkerhetsnivå 2. Inkubation steg vid 37 °C som involverar celler2 utfördes i en 5% CO 2-inkubator.
- För att förbereda HepG2-celler för HEVcc-produktion (figur 3), utsädesceller i komplett Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (se tabell 1) på en 15 cm kollagen (se tabell 1, sterilfilter PBS- ättiksyra blanda genom 0,2 μm mesh innan du lägger kollagen) belagda kulturskålen. Inkubera vid 37 °C tills cellerna är 90% konfluenta.
OBS: Varje 15 cm maträtt som innehåller 90% flytande celler kommer att generera tillräckligt med celler för upp till 4 elektroporation. - Ta försiktigt bort mediet från plattan och tvätta cellerna en gång med 10 ml 1x PBS. Trypsinize celler genom att lägga till 3 ml 0,05% trypsin-EDTA på cellerna och inkubera vid 37 °C tills cellerna är fristående helt. Återsuspend celler i 10 ml DMEM komplett medium och överföra cellupphängningen till en 50 ml rör. Bestäm det totala antalet celler.
- Eftersom varje elektroporation kräver 5 x 106 celler, överför lämplig volym i ett nytt 50 ml-rör och fyll upp till minst 35 ml med 1x PBS. Centrifugcellerna vid 200 x g i 5 min och kassera supernatanten försiktigt utan att störa cellpelleten.
- Tvätta cellerna igen med 35 ml 1x PBS vid 200 x g i 5 min. Placera cellerna på is och ta inte bort 1x PBS ännu, för att hålla cellerna i suspension.
5. Elektroporation av HepG2 celler
Figur 4: Schematisk experimentell inställning för elektroporation av HepG2-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- För elektroporation av HepG2-celler (figur 4) förbereda 400 μL Cytomix komplett per elektroporation genom att komplettera 384 μL cytomix (se tabell 1) med 2 mM ATP och 5 mM glutation. Förbered färskt precis före användning och placera direkt på is.
Obs: En korrekt men snabb körning av följande steg är avgörande. Se därför till att allt är ordentligt förberett. - Ta försiktigt bort 1x PBS utan att störa cellpelleten från steg 4.4. Resuspend 5 x 106 celler i 400 μL Cytomix komplett och tillsätt 5 μg RNA från steg 3.2.2. Överför lösningen till en 4 mm cuvette och puls en gång med 975 μF, 270 V för 20 ms med ett elektroporationssystem.
- Efter elektroporation överföring celler så snabbt som möjligt med en Pasteur pipett i 11 ml DMEM komplett per elektroporation.
OBS: För att säkerställa att RNA har transknäckts i HepG2-celler kommer en transfection control (TC) att utföras. Förväntade transfection priser varierar mellan 40-60% av ORF2-positiva celler.
- Efter elektroporation överföring celler så snabbt som möjligt med en Pasteur pipett i 11 ml DMEM komplett per elektroporation.
- Överför 10 ml elektroporerade celler till en 10 cm odlad maträtt belagd med kollagen. Tillsätt 1,3 x 105 elektroprorated celler (300 μL) i en brunn av en kollagen-belagda 24-mikrotitre platta bär ett lock slip (senare används som en transfection kontroll). Fördela cellerna jämnt och inkubera vid 37 °C.
- Efter 24 h, byt medium på 10 cm skålen och byt ut med 10 ml färsk DMEM komplett. Ändra inte transfection-kontrollens medium. Inkubera i ytterligare 6 dagar vid 37 °C.
- Stoppa transfsektionskontrollen i 24 brunnsplatta 5-7 d efter elektroporation beroende på celltätheten genom att fortsätta med immunofluorescensfärgningsprotokollet (steg 8). Transfection effektivitet beräknas genom att räkna antalet ORF2 positiva celler normaliserade till det totala antalet celler.
6. Skörd av intra- och extracellulär HEVcc
Figur 5: Schematisk experimentell inställning för skörd inom och extracellulär HEVcc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- För att skörda extracellulär HEVcc (figur 5), filtrera supernatanten, som erhålls från 10 cm skålen efter 6 dagar (steg 5.3.1), genom en 0,45 μm maska för att avlägsna eventuella cellskräp. Förvara skördad extracellulär HEVcc vid 4 °C för samma dag infektion, annars lagra på -80 °C.
- För att skörda intracellulära HEVcc (Figur 5), tvätta celler med 1x PBS och trypsinize genom att lägga till 1,5 ml 0,05% trypsin-EDTA. Inkubera vid 37 °C tills cellerna är helt fristående. Tillsätt 10 ml DMEM komplett, spolplatta för att lossa celler och överföra cellernas suspension till 50 ml rör. Tvätta cellerna två gånger med PBS. Centrifug på 200 x g i 5 min.
- Kasta supernatanten och återsuspend cellpellet i 1,6 ml DMEM komplett per elektroporation. Överför cellupphängningen till ett 2 ml-reaktionsrör.
OBS: Använd inte större volymer eftersom det dramatiskt skulle minska virusbelastningen. - Frys (i flytande kväve) och tina celler. Upprepa denna sekvens 3 gånger.
OBS: Slå inte samman mer än en elektroporation (1,6 ml) för de 3 frys- och töcyklerna eftersom lyseffektiviteten skulle försämras. Virvla inte cellupphängningen mellan cyklerna. Se till att tina cellfjädringen långsamt (t.ex. rumstemperatur eller på is) för att maximera virusbelastningen. - Höghastighetscentrifugera de lystade cellerna i 10 min vid 10 000 x g för att separera cellskräp. Överför supernatanten i ett nytt rör. Ta supernatanten för infektion, annars förvara på -80 °C.
- Alternativt, koncentrera den extra- och intracellulära HEVcc med hjälp av en koncentrator för att öka virusbelastningen (enligt tillverkarens protokoll).
- Kasta supernatanten och återsuspend cellpellet i 1,6 ml DMEM komplett per elektroporation. Överför cellupphängningen till ett 2 ml-reaktionsrör.
7. Infektion av HepG2/C3A-celler med intra- och extracellulär HEVcc
Figur 6: Schematisk experimentell inställning för infektion av HepG2/C3A celler med intra- och extracellulära HEVcc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
OBS: Infektionen av HepG2/C3A celler skall säkerställa att infektiösa partiklar producerades. Dessutom används titrering av skördade intracellulära och extracellulära HEVcc för att beräkna virustiterna i FFU/ml. Detta kommer senare att kallas infektionskontroll (IC).
- För att förbereda HepG2/C3A-celler för HEVcc-infektion (figur 6), färdigställd förvärm minimalt väsentligt medium (MEM) (se tabell 1) till 37 °C.
- Frö 2 x 104 celler/brunn i 100 μL på kollagenbelagd 96 brunnsmikrotiterplatta en dag före steg 6. Se till att fylla de yttersta brunnarna med 1x PBS för att förhindra avdunstning av mediet inuti de inre 60 brunnarna. Inkubera vid 37 °C i 24 timmar.
- Infektera med extracellulär HEVcc genom att tillsätta 50 μL av supernatanten (från steg 6.1) till HepG2/C3A-cellerna som såtts dagen innan. Blanda väl genom pipettering upp och ner och seriellt späd sex gånger 1:3 genom att överföra 50 μL till nästa brunn. Utför dubbletter av seriell utspädning för tekniska replikat.
- Infektera med intracellulär HEVcc genom att tillsätta 25 μL supernatant (från steg 6.2.3) till HepG2/C3A-cellerna som såtts dagen innan. Blanda väl genom pipettering upp och ner och seriellt späd sex gånger 1:5 genom att överföra 25 μL till nästa brunn. Utför dubbletter av seriell utspädning för teknisk replikering.
- Efter 7 d vid 37 °C stoppa infektionen genom att fortsätta med immunofluorescensfärgningsprotokollet (steg 8).
8. Immunfluorescensfärgning av transfektions- och infektionskontroll
Figur 7: Schematisk experimentell inställning för immunofluorescensfärgning av transfection och infektionskontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- För immunofluorescensfärgning (figur 7), tvätta 3x med 1x PBS och fixera celler genom att dosera 350 μL (transfsektionskontroll [TC]) eller 50 μL (infektionskontroll [IC]) av 4% Fixeringslösning per brunn. Inkubera i 15 min vid RT och tvätta försiktigt två gånger med 1x PBS efteråt.
OBS: Protokollet kan pausas här för transfection kontroll tills infektionen av HepG2/C3A celler stoppas också. Förvara brunnsplattan vid 4 °C. Försegla även med parafilm för att förhindra avdunstning. - Permeabilisera celler genom att tillsätta 350 μL (TC) eller 50 μL (IC) på 0,2% Triton X-100 (i 1 × PBS) i 5 min vid RT. Tvätta sedan försiktigt två gånger med 1x PBS och blockera med 350 μL (TC) eller 50 μL (IC) på 5% Horse Serum (i 1x PBS) för 1 h vid RT under konstant omrörning på en orbital shaker (30 rpm).
OBS: Förbered liten plastskål (30 mm) genom att placera en fuktig vävnad inuti och ett paraffinfilmskikt ovanpå, vilket skapar en fuktig kammare. Överför sedan TC-täckslipen vänd uppåt på paraffinfilmen. Följande steg för TC kommer att utföras i den fuktiga kammaren. - Tillsätt 70 μL (TC) eller 25 μL (IC) primär antikropp anti-ORF2 8282 (HEV-specifika kaninhyperimmune serum,1:5 000 i 5% Hästserum) per brunn och inkubera över natten vid 4 °C under konstant agitation på en orbital shaker (30 rpm).
- Tvätta försiktigt två gånger med 1x PBS och tillsätt 70 μl (TC) eller 25 μL (IC) sekundär antikroppsget antikanin 488 (1:1 000 i 5 % hästserum). Inkubera i 1 h under konstant omrörning på en orbital shaker (30 rpm) i mörker. Återigen, tvätta försiktigt två gånger med 1x PBS
- Tillsätt 70 μl (TC) eller 25 μl (IC) DAPI (1:10 000 i H2O) och inkubera i 1 min. Tvätta försiktigt två gånger med H2O. Ta ut täcksliken från den fuktiga kammaren, montera täcksliken med 6 μL av monteringsreagensen upp och ner på en täckrutschbana (endast för TC) och låt monteringsreagensen torka i 16 timmar vid RT i mörker. Förvara IC i vatten tills avbildning och försegla plattan med paraffinfilm för att undvika torkning på grund av avdunstning.
- Ta bilder för att bekräfta lyckad transfection och infektion.
OBS: Jämförbara resultat erhölls med hjälp av den kommersiellt tillgängliga anti-ORF2 1E6antikroppen 57 (1:200 i 5 % Hästserum) och en sekundär antikroppsåsäknadsantimus (1:1 000 i 5 % hästserum)
9. FFU-bestämning
OBS: En FFU definieras som en eller flera ORF2-positiva celler åtskilda från en annan FFU med minst tre negativa celler.
- För extracellulära HEVcc börja räkna alla ORF2-positiva högborgar av de två brunnarna i de två lägsta utspädningar. Totalt fyra brunnar bör räknas. Fokusbildande enheter (FFU) per milliliter kan beräknas med följande ekvation:
OBS: Förväntade titrar varierar mellan 102 och 5 x 104 FFU/ml. - För intracellulära HEVcc börja räkna alla ORF2-positiva högborgar i brunnar där mellan 50 till 100 högborgar observeras. Dessutom räkna de två brunnarna i nästa högre utspädning. Totalt fyra brunnar bör räknas. Fokusbildande enheter (FFU) per milliliter kan beräknas med följande ekvation:
OBS: Förväntade titrar varierar mellan 105 och 3 x 106 FFU/mL. Faktorerna 20x och 40x används för att extrapolera antalet FFU per 50 μL och 25 μL till 1 ml och kan anpassas därefter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll beskriver vi produktionen av hög titer infektiös HEVcc. Det första steget är att isolera plasmid-DNA (pBluescript_SK_HEVp654 och pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, figur 8a), som sedan linjäriseras genom restförsmältning och renas för in vitro-transkription (figur 1). En framgångsrik linjärisering kan verifieras genom att jämföra den icke-smälta plasmid-DNA till smält plasmid-DNA med hjälp av gel elektrofores. Förutom en storleksförändring bör endast ett DNA-band vara synligt som representerar den linjära formen. Linjäriseringen är klar när de två andra banden ovanför och under den linjära formen, som representerar den snårda cirkeln respektive den superspädrade formen, minskas helt (figur 8b). Avkastningen av det renade DNA:t bör överstiga 150 ng/μL. Endast om dessa egenskaper håller det linjära DNA:et bör användas för in vitro-transkription. In vitro-transkriberat RNA bör också kontrolleras med hjälp av gelelektrofores och vid låg RNase-abundancy bör visa distinkta band snarare än ett suddigt utstryk (figur 8c). Dessutom bör den renade RNA-avkastningen överstiga 500 ng/μL In vitro-transkriberas RNA(figur 2)så småningom elektroporeras till HepG2-celler för virusproduktion (figur 3 och figur 4). Framgångsrik elektroporering övervakas av immunofluorescensfärgning av transfsektionskontrollen (figur 9a). Transfection effektivitet bör överstiga 40%(Figur 9b). En replikeringsbristerad mutant fungerar som en negativ kontroll för att säkerställa specificiteten hos ORF2-färgningen, eftersom inget ORF2-uttryck förväntas (figur 9c). Efter 7 dagars inkubation skördas den omslutna (extracellulära) HEVcc genom att samla in och filtrera cellkulturens supernatant. Icke-hölje (intracellulära) HEVcc frigörs från cellerna genom flera frys- och töcykler. För att avlägsna cellskräp centrifugeras celllysteten med hög hastighet (bild 5). Därefter används båda HEVcc-arter för att infektera HepG2/C3A-celler genom seriell utspädning (figur 6 och figur 9d). Enligt ekvationerna ovan (se steg 9) bestäms virustitrar genom FFU-beräkning.
Representativa resultat visas i figur 9. Kontrollen av transfection bör omfatta cirka 50 % ORF2-positiva celler för att garantera en effektiv mängd virus som produceras (figur 9a,b). Ju mindre ORF2-positiva celler desto lägre blir titeren. Exakt efter de steg som nämns i protokollet kommer att generera titrar som varierar mellan 105 och 3 x 106 FFU/mL för icke-hölje (intracellulära) HEVcc. För de omslutna (extracellulära) HEVcc-titrarna förväntas mellan 102 och 5 x104 FFU/ml (figur 9e). Dessutom observerades förhöjda FFU-räknas för G1634R mutanten. Vid beräkning av förhållandet mellan genomkopior och infektiösa viruspartiklar befanns den producerade intracellulära HEVcc för både p6_WT och p6_G1634R vara lägre jämfört med den extracellulära HEVCC, vilket tyder på en högre specifik smittsamhet hos de icke-höljeförslutna HEV-arterna (figur 9f).
Figur 8: Generering av in vitro-transkriberat RNA. in vitro
(A) Exempel på ett absorbansspektrum av isolerade Plasmid-DNA. (B)Gel elektrofores av icke-smält och smält Plasmid-DNA. (C)Gel elektrofores av in vitro transkriberas RNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Representativa resultat av hög titer HEVcc produktion.
(A)Transfsektionskontroll av elektroporerade HepG2-celler. Transfected celler var färgas med anti-ORF2 antikroppar (grön, LS-Bio) och DAPI (blå). (B)Transfection effektivitet beräknades av antalet ORF2-positiva celler normaliserade till antalet totala celler. (C)En replikeringsbristerad mutant fungerar som en negativ kontroll för immunofluorescensfärgning, för att säkerställa ORF2-specificitet. DDFör FFU utfördes seriella utspädningar av de producerade viruslagren. ORF2 positiva celler avbildas i vitt. E)Virustiter beräknades genom FFU-räkning och(F)virusbelastningar bestämdes av qPCR och normaliserades till FFU/ml. Staplar visar medelvärdet och standardavvikelsen för 38 respektive 10 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Fungerande lösning | Koncentration | Volym |
| Kollagen | 40 ml | Pbs |
| 40 μl | Ättiksyra | |
| 1 ml | Kollagen R-lösning 0,4% steril | |
| Cytomix (cytomix) | 120 mM | KCl (KCl) |
| 0,15 mM | CaCl2 (På andra sätt) | |
| 10 mM | K2HPO4 (pH 7.4) | |
| 25 mM | HEPES (AVSPES) | |
| 2 mM | EGTA (EGTA) | |
| DMEM klar | 500 ml | DMEM (ANDRA) |
| 5 ml | Penna/Strep | |
| 5 ml | MEM NEAA (100X) | |
| 5 ml | L-glutamin | |
| 50 ml | Fetala bovin serum | |
| MEM komplett | 500 ml | Mem |
| 5 ml | NatriumPyruvat | |
| 5 ml | Gentamycin (av ) | |
| 5 ml | MEM NEAA (100X) | |
| 5 ml | L-glutamin | |
| 50 ml | ultra-låg IgG |
Tabell 1: Tabell över buffertsammansättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Från och med plasmidpreparatet bör DNA-avkastningen överstiga 150 ng/μL för att kunna utföra flera linjäriseringar från samma plasmidlager, vilket minimerar risken för bakterieinducerad mutagenes av avgörande genomsekvenser. Dessutom är det viktigt att kontrollera begränsningen sammandrag för fullständig plasmid linjärisering av gel elektrofores (figur 8b). En brist på linjäriserad plasmid DNA skulle inducera rullande cirkel förstärkning orsakar in vitro transkription vara mindre effektiv. Dessutom bör RNA-integritet bekräftas för att utvärdera förekomsten av RNases i provet (figur 8c). Först då bör en elektroporation av målceller övervägas. Observera, innan du börjar med beredningen av HepG2 celler, se till att allt är till hands och väl förberedda undvika långa väntetider. Särskilt, försäkra korttidslagring av cellerna och RNA i Cytomix tills elektroporation. För att kringgå uppvärmningen av cellerna under elektroporation är det viktigt att kyla bufferten på is i förväg. Pulsens varaktighet bör inte överstiga 20-25 ms och 270 V. Efter elektroporation cellerna kräver en snabb överföring till färskt medium för att säkerställa cellens livskraft. Före infektion av målceller bör TC kontrolleras med för procentandelen ORF2-positiva celler. Om TC visar inga ORF2-positiva celler är det mest troligt att elektroporationen har misslyckats eller färgning inte fungerade, och experimentet bör upprepas.
Vid skörd intracellulära HEVcc bör särskild uppmärksamhet ägnas åt hastigheten på frysnings- och töcyklerna. Virustiter kan ökas genom att frysa i flytande kväve snarare än vid -80 °C. Tvärtom bör upptiningen ske på det långsammaste sättet som tyder på lagring på is tills cellfjädringen likvideras helt. Icke desto mindre är det också möjligt att tina cellfjädringen vid rumstemperatur, i en 37 °C inkubator eller vattenbad, men ju snabbare upptiningen kommer att utföras desto mer kommer titrar att minska.
Beroende på följande experiment är det också möjligt att göra frysning och tina cykler i MEM komplett eller 1x PBS utan dramatisk förlust av viral titrar, men man bör komma ihåg att detta orsakar extracellulära HEVcc att vara i ett annat medium än den intracellulära HEVcc.
Efter dessa avgörande steg i protokollet varierar förväntade titrar mellan 105 och 3 x 106 FFU/ml för den icke-höljesbaserade (intracellulära) HEVcc. För de omslutna (extracellulära) HEVcc-titrarna mellan 102 och 5 x 104 FFU/ml är väntade (figur 9e). Hittills har studier som använder HEV cell kultur system övervaka viral replikering och förökning främst av qPCR. Bedömningen av RNA-genomkopior ger ännu ingen insikt i montering och utsläpp av smittsamma partiklar.
En tidigare studie58 framgångsrikt propagerade patienten isolat i cellodling med maximal titers på 103 TCID50/mL. Som visat nyligen är det också möjligt att framgångsrikt passage HEVcc i cellkultur och anpassa vårt protokoll till andra stammar, såsom 47832c och 83-2 som inte hyser en insättning i den hypervariable regionen56. Dessutom, om patienten härledda sekvenser kan klonas i Bluescript vektor ryggraden och fortfarande ger hög viral titers testades inte. Med den introducerade metoden kan icke-höljeförslutna såväl som höljeförslutna viruspartiklar skördas och användas för att vaccinera en mängd naiva cellinjer som A549, Huh7.5, Jeg-3 och primära mänskliga och svinhepatocyter, vilket ger en fördel för framtida tillämpningar såsom undersökning av HEV tropism, patogenes, läkemedelsutveckling, viral och värdinteraktioner, inaktiveringsstudier, neutraliserande antikroppar och många fler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Suzanne Emerson för hepatit E-viruset p6 klon. HEV-specifika kanin hyperimmune serum tillhandahölls vänligt av Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Tyskland. Dessutom tackar vi alla medlemmar i institutionen för molekylär och medicinsk virologi vid Ruhruniversitetet Bochum för deras stöd och diskussion. Siffrorna 1-7 genererades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm mesh | Sarstedt | 83.1826 | Harvest extracellular Virus |
| 4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | Immunofluorescence |
| Acetic acid | CarlRoth | 6755.1 | Collagen working solution |
| Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | Virus harvesting |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | Selection of transformed bacteria |
| ATP | Roche | 11140965001 | in vitro transcription and electroporation |
| BioRender | BioRender | Figure Generation | |
| CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
| Collagen R solution 0.4 % sterile | Serva | 47256.01 | Collagen working solution |
| CTP | Roche | 11140922001 | in vitro transcription |
| Cuvette | Biorad | 165-2088 | Electroporation |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | Immunofluorescence |
| DMEM | gibco | 41965-039 | Cell culture |
| DNAse | Promega | M6101 | in vitro transcription |
| DTT | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
| Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformation |
| Fetal bovine serum | gibco | 10270106 | Cell culture |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Immunofluorescence |
| GenePulser Xcell Electroporation System | BioRad | 1652660 | Electroporation |
| Gentamycin | gibco | 15710049 | Cell culture |
| GTP | Roche | 11140957001 | in vitro transcription |
| H2O | Braun | 184238001 | Immunofluorescence |
| Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
| Horse serum | gibco | 16050122 | Immunofluorescence |
| K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
| KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
| L-Glutamin | gibco | 25030081 | Cell culture |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
| MEM | gibco | 31095-029 | Cell culture |
| MEM NEAA (100×) | gibco | 11140-035 | Cell culture |
| MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
| Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA concentration |
| MluI enzyme | NEB | R0198L | Linearization |
| NEB buffer | NEB | included in R0198L | Linearization |
| NucleoSpin Plasmid kit | Macherey & Nagel | 740588.250 | Plasmid preparation |
| NucleoSpin RNA Clean-up Kit | Macherey & Nagel | 740948.250 | RNA purification |
| PBS | gibco | 70011051 | Cell culture |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Cell culture |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) | Todt et.al | Virus production | |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) | Shukla et al. | GenBank accession no. JQ679013 | Virus production |
| Primary antibody 1E6 | LS-Bio | C67675 | Immunofluorescence |
| Primary antibody 8282 | Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | DNA extraction |
| Ribo m7G Cap Analog | Promega | P1711 | in vitro transcription |
| RNase away | CarlRoth | A998.3 | RNA purification |
| RNasin (RNase inhibitor) | Promega | N2515 | in vitro transcription |
| Secondary antibody donkey anti-mouse 488 | Thermo Fisher | A-21202 | Immunofluorescence |
| Secondary antibody goat anti-rabbit 488 | Thermo Fisher | A-11008 | Immunofluorescence |
| Sodium Pyruvat | gibco | 11360070 | Cell culture |
| T7 RNA polymerase | Promega | P2077 | in vitro transcription |
| Transcription Buffer | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| Triton X-100 | CarlRoth | 3051.3 | Immunofluorescence |
| Trypsin-EDTA (0.5 %) | gibco | 15400054 | Cell culture |
| ultra-low IgG | gibco | 1921005PJ | Cell culture |
| UTP | Roche | 11140949001 | in vitro transcription |
References
- Wedemeyer, H., Pischke, S., Manns, M. P. Pathogenesis and treatment of hepatitis e virus infection. Gastroenterology. 142 (6), 1388-1397 (2012).
- Smith, D. B., et al. Proposed reference sequences for hepatitis E virus subtypes. The Journal of General Virology. 97 (3), 537-542 (2016).
- Ding, Q., et al. Hepatitis E virus ORF3 is a functional ion channel required for release of infectious particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (5), 1147-1152 (2017).
- Chapuy-Regaud, S., et al. Characterization of the lipid envelope of exosome encapsulated HEV particles protected from the immune response. Biochimie. 141, 70-79 (2017).
- Yin, X., Ambardekar, C., Lu, Y., Feng, Z. Distinct Entry Mechanisms for Nonenveloped and Quasi-Enveloped Hepatitis E Viruses. Journal of Virology. 90 (8), 4232-4242 (2016).
- Khuroo, M. S., Khuroo, M. S., Khuroo, N. S. Hepatitis E: Discovery, global impact, control and cure. World Journal of Gastroenterology. 22 (31), 7030-7045 (2016).
- Rasche, A., et al. Hepatitis E Virus Infection in Dromedaries, North and East Africa, United Arab Emirates, and Pakistan, 1983-2015. Emerging Infectious Diseases. 22 (7), 1249-1252 (2016).
- Hsieh, S. Y., et al. Identity of a novel swine hepatitis E virus in Taiwan forming a monophyletic group with Taiwan isolates of human hepatitis E virus. Journal of Clinical Microbiology. 37 (12), 3828-3834 (1999).
- Johne, R., et al. Detection of a novel hepatitis E-like virus in faeces of wild rats using a nested broad-spectrum RT-PCR. The Journal of General Virology. 91, Pt 3 750-758 (2010).
- Payne, C. J., Ellis, T. M., Plant, S. L., Gregory, A. R., Wilcox, G. E. Sequence data suggests big liver and spleen disease virus (BLSV) is genetically related to hepatitis E virus. Veterinary Microbiology. 68 (1-2), 119-125 (1999).
- Haqshenas, G., Shivaprasad, H. L., Woolcock, P. R., Read, D. H., Meng, X. -J. Genetic identification and characterization of a novel virus related to human hepatitis E virus from chickens with hepatitis–splenomegaly syndrome in the United States. Journal of General Virology. 82, 2449-2462 (2001).
- Tei, S., Kitajima, N., Takahashi, K., Mishiro, S. Zoonotic transmission of hepatitis E virus from deer to human beings. The Lancet. 362 (9381), 371-373 (2003).
- Nakamura, M., et al. Hepatitis E virus infection in wild mongooses of Okinawa, Japan: Demonstration of anti-HEV antibodies and a full-genome nucleotide sequence. Hepatology Research: the Official Journal of the Japan Society of Hepatology. 34 (3), 137-140 (2006).
- Drexler, J. F., et al. Bats worldwide carry hepatitis E virus-related viruses that form a putative novel genus within the family Hepeviridae. Journal of Virology. 86 (17), 9134-9147 (2012).
- Zhao, C., et al. A novel genotype of hepatitis E virus prevalent among farmed rabbits in China. Journal of Medical Virology. 81 (8), 1371-1379 (2009).
- Lhomme, S., et al. Risk of zoonotic transmission of HEV from rabbits. Journal of Clinical Virology: the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 58 (2), 357-362 (2013).
- Kaci, S., Nöckler, K., Johne, R. Detection of hepatitis E virus in archived German wild boar serum samples. Veterinary Microbiology. 128 (3-4), 380-385 (2008).
- Liu, B., et al. Avian hepatitis E virus infection of duck, goose, and rabbit in northwest China. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 76 (2018).
- Raj, V. S., et al. Novel hepatitis E virus in ferrets, the Netherlands. Emerging Infectious Diseases. 18 (8), 1369-1370 (2012).
- Dong, C., et al. Restricted enzooticity of hepatitis E virus genotypes 1 to 4 in the United States. Journal of Clinical Microbiology. 49 (12), 4164-4172 (2011).
- Goens, S. D., Perdue, M. L. Hepatitis E viruses in humans and animals. Animal Health Research Reviews. 5 (2), 145-156 (2004).
- Geng, Y., Wang, Y. Transmission of Hepatitis E Virus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 948, 89-112 (2016).
- Naik, S. R., Aggarwal, R., Salunke, P. N., Mehrotra, N. N. A large waterborne viral hepatitis E epidemic in Kanpur, India. Bulletin of the World Health Organization. 70 (5), 597-604 (1992).
- Feagins, A. R., Opriessnig, T., Guenette, D. K., Halbur, P. G., Meng, X. -J. Detection and characterization of infectious Hepatitis E virus from commercial pig livers sold in local grocery stores in the USA. The Journal of General Virology. 88, Pt 3 912-917 (2007).
- Colson, P., et al. Pig liver sausage as a source of hepatitis E virus transmission to humans. The Journal of Infectious Diseases. 202 (6), 825-834 (2010).
- Wenzel, J. J., et al. Detection of hepatitis E virus (HEV) from porcine livers in Southeastern Germany and high sequence homology to human HEV isolates. Journal of Clinical Virology: the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 52 (1), 50-54 (2011).
- Colson, P., et al. Transfusion-associated Hepatitis E, France. Emerging Infectious Diseases. 13 (4), 648-649 (2007).
- Kamp, C., et al. Impact of hepatitis E virus testing on the safety of blood components in Germany - results of a simulation study. Vox Sanguinis. , (2018).
- Kamar, N., Dalton, H. R., Abravanel, F., Izopet, J. Hepatitis E virus infection. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 116-138 (2014).
- Pischke, S., Behrendt, P., Manns, M. P., Wedemeyer, H. HEV-associated cryoglobulinaemia and extrahepatic manifestations of hepatitis E. The Lancet Infectious Diseases. 14 (8), 678-679 (2014).
- Colson, P., et al. Severe thrombocytopenia associated with acute hepatitis E virus infection. Journal of Clinical Microbiology. 46 (7), 2450-2452 (2008).
- Mishra, P., Mahapatra, M., Kumar, R., Pati, H. P. Autoimmune hemolytic anemia and erythroid hypoplasia associated with hepatitis E. Indian Journal of Gastroenterology: Official Journal of the Indian Society of Gastroenterology. 26 (4), 195-196 (2007).
- Sood, A., Midha, V., Sood, N. Guillain-Barré syndrome with acute hepatitis E. The American Journal of Gastroenterology. 95 (12), 3667-3668 (2000).
- Fousekis, F. S., Mitselos, I. V., Christodoulou, D. K. Extrahepatic manifestations of hepatitis E virus: An overview. Clinical and Molecular Hepatology. 26 (1), 16-23 (2020).
- Pischke, S., et al. Ribavirin treatment of acute and chronic hepatitis E: A single-centre experience. Liver International: Official Journal of the International Association for the Study of the Liver. 33 (5), 722 (2013).
- Kamar, N., et al. Ribavirin for Chronic Hepatitis E Virus Infection in Transplant Recipients. The New England Journal of Medicine. 370, 1111-1120 (2014).
- Todt, D., et al. In vivo evidence for ribavirin-induced mutagenesis of the hepatitis E virus genome. Gut. 65, 1733-1743 (2016).
- Todt, D., Walter, S., Brown, R. J. P., Steinmann, E. Mutagenic Effects of Ribavirin on Hepatitis E Virus-Viral Extinction versus Selection of Fitness-Enhancing Mutations. Viruses. 8 (10), 8100283 (2016).
- Todt, D., Meister, T. L., Steinmann, E. Hepatitis E virus treatment and ribavirin therapy: Viral mechanisms of nonresponse. Current Opinion in Virology. 32, 80-87 (2018).
- Kamar, N., et al. Ribavirin for Hepatitis E Virus Infection After Organ Transplantation: A Large European Retrospective Multicenter Study. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. , (2019).
- Kamar, N., et al. Influence of immunosuppressive therapy on the natural history of genotype 3 hepatitis-E virus infection after organ transplantation. Transplantation. 89 (3), 353-360 (2010).
- Kamar, N., et al. Pegylated interferon-alpha for treating chronic hepatitis E virus infection after liver transplantation. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 50 (5), 30-33 (2010).
- Todt, D., et al. Antiviral Activities of Different Interferon Types and Subtypes against Hepatitis E Virus Replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (4), 2132-2139 (2016).
- Dao Thi, V. L., et al. Sofosbuvir Inhibits Hepatitis E Virus Replication In Vitro and Results in an Additive Effect When Combined with Ribavirin. Gastroenterology. 150 (1), 82-85 (2016).
- van der Valk, M., Zaaijer, H. L., Kater, A. P., Schinkel, J. Sofosbuvir shows antiviral activity in a patient with chronic hepatitis E virus infection. Journal of Hepatology. 66 (1), 242-243 (2017).
- Kaushik, N., et al. Zinc Salts Block Hepatitis E Virus Replication by Inhibiting the Activity of Viral RNA-Dependent RNA Polymerase. Journal of Virology. 91 (21), (2017).
- Todt, D., et al. The natural compound silvestrol inhibits hepatitis E virus (HEV) replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 157, 151-158 (2018).
- Glitscher, M., et al. Inhibition of Hepatitis E Virus Spread by the Natural Compound Silvestrol. Viruses. 10 (6), 301 (2018).
- Kinast, V., Burkard, T. L., Todt, D., Steinmann, E. Hepatitis E Virus Drug Development. Viruses. 11 (6), 485 (2019).
- Schemmerer, M., et al. Enhanced Replication of Hepatitis E Virus Strain 47832c in an A549-Derived Subclonal Cell Line. Viruses. 8 (10), 267 (2016).
- Huang, R., et al. Cell Culture of Sporadic Hepatitis E Virus in China. Clinical and Vaccine Immunology. 6 (5), 729-733 (1999).
- Emerson, S. U., et al. Recombinant hepatitis E virus genomes infectious for primates: Importance of capping and discovery of a cis-reactive element. PNAS. 98 (26), 15270-15275 (2001).
- Shukla, P., et al. Cross-species infections of cultured cells by hepatitis E virus and discovery of an infectious virus-host recombinant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2438-2443 (2011).
- Shukla, P., et al. Adaptation of a genotype 3 hepatitis E virus to efficient growth in cell culture depends on an inserted human gene segment acquired by recombination. Journal of Virology. 86 (10), 5697-5707 (2012).
- Meister, T. L., Bruening, J., Todt, D., Steinmann, E. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Research. 163, 34-49 (2019).
- Todt, D., et al. Robust hepatitis E virus infection and transcriptional response in human hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2020).
- Ankavay, M., et al. New insights into the ORF2 capsid protein, a key player of the hepatitis E virus lifecycle. Scientific Reports. 9 (1), 6243 (2019).
- Schemmerer, M., Johne, R., Erl, M., Jilg, W., Wenzel, J. J. Isolation of Subtype 3c, 3e and 3f-Like Hepatitis E Virus Strains Stably Replicating to High Viral Loads in an Optimized Cell Culture System. Viruses. 11 (6), 483 (2019).
