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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Un modelo de cultivo celular para producir acciones de virus de la hepatitis E de alto título

Published: June 26, 2020 doi: 10.3791/61373
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Molecular and Medical Virology, Ruhr University Bochum
* These authors contributed equally

Summary

Aquí se describe un método eficaz sobre cómo producir altas existencias de título virales del virus de la hepatitis E (HEV) para infectar eficientemente las células del hepatoma. Con el método presentado, tanto las partículas virales no envueltas, como las envueltas, pueden ser cosechadas y utilizadas para inocular varias líneas celulares.

Abstract

El virus de la hepatitis E es la principal causa de cirrosis hepática e insuficiencia hepática con una prevalencia creciente en todo el mundo. El virus del ARN de una sola cadena se transmite predominantemente por transfusiones de sangre, condiciones sanitarias inadecuadas y productos alimenticios contaminados. Hasta la fecha, el medicamento fuera de etiqueta ribavirina (RBV) es el tratamiento de elección para muchos pacientes. No obstante, queda por identificar un tratamiento específico para el HEV. Hasta ahora, el conocimiento sobre el ciclo de vida del HEV y la patogénesis se ha visto gravemente obstaculizado debido a la falta de un sistema eficiente de cultivo celular HEV. Un sistema de cultivo celular robusto es esencial para el estudio del ciclo de vida viral que también incluye la patogénesis viral. Con el método descrito aquí se pueden producir títulos virales de hasta 3 x 106 unidad de formación de enfoque/ ml (FFU/ml) de HEV no envolvente y hasta 5 x 104 FFU/ml de HEV envuelto. Usando estas partículas, es posible infectar una variedad de células de diversos orígenes incluyendo células primarias y humanas, así como líneas celulares animales. La producción de partículas HEV infecciosas a partir de plásmidos plantea una fuente infinita, lo que hace que este protocolo sea extremadamente eficiente.

Introduction

La hepatitis E es una enfermedad bastante subestimada con una prevalencia cada vez mayor en todo el mundo. Alrededor de 20 millones de infecciones provocan más de 70.000 muertes al año1. El agente subyacente, el virus de la hepatitis E (HEV), fue reasignado recientemente y ahora se clasifica dentro de la familia Hepeviridae incluyendo los géneros Orthohepevirus y Piscihepevirus. HEV de diversos orígenes se clasifican dentro de la especie Orthohepevirus A-D incluyendo aislados de humanos, cerdos, conejos, ratas, aves y otros mamíferos2. En la actualidad, se han identificado ocho genotipos diferentes (GT) del virus de ARN de una sola cadena de orientación positiva2. Aunque difieren en su identidad de secuencia, rutas de transmisión y distribución geográfica, su estructura genómica es altamente conservada. Más específico, el genoma HEV de 7,2 kbp se divide en 3 marcos de lectura abiertos principales (ORF1-3). Mientras ORF1 codifica todas las enzimas necesarias para una replicación exitosa dentro de la célula huésped, ORF2 codifica la proteína capsid, y la proteína ORF3 funciona como un canal iónico funcional necesario para el montaje y liberación de partículas infecciosas3. Una vez liberado en el lumen basal o apical HEV existe en ambas especies, casi biseladas y no envueltas/desnudas dependiendo de si el virus se origina en sangre o heces, respectivamente4,5.

Mientras que GT1 y GT2 se encuentran principalmente en los países en desarrollo que infectan únicamente a los seres humanos6 a través de la vía fecal-oral, GT3, GT4 y GT7 se producen predominantemente en los países desarrollados1,,7 con una variedad de especies que sirven como reservorios, por ejemplo, cerdo8, rata9, pollo10,11, ciervo12, mangosta13, murciélago14, conejo15,16, jabalí17 y muchos más7,18,19, proporcionando evidencia de zoonosis7,20,21,22. Además de las condiciones sanitarias inadecuadas23 y los productos alimenticios contaminados12,24,25,26, la transmisión a través de transfusión de sangre y trasplantes de órganos también es posible27,28. El HEV es una causa frecuente de cirrosis hepática e insuficiencia hepática29, especialmente en pacientes con enfermedad hepática preexistente, individuos inmunocomprometidos (genotipo 3, 4 y 7) y mujeres embarazadas (genotipo 1). Cabe destacar que también hay manifestaciones extrahepáticas como la enfermedad hematopoyética30,31,32, trastornos neurológicos33 y lesión renal34.

Hasta la fecha, el medicamento fuera de etiqueta ribavirina (RBV) es el tratamiento de elección para muchos pacientes infectados35,36. Sin embargo, se han notificado casos de insuficiencia del tratamiento y malos resultados clínicos a largo plazo. La insuficiencia del tratamiento se ha relacionado con la mutagénesis viral y el aumento de la heterogeneidad viral en pacientes infectados crónicamente37,38,39. Por el contrario, un reciente estudio multicéntrico retrospectivo europeo no fue capaz de correlacionar las mutaciones de la polimerasa con la falla del tratamiento con RBV40. En observaciones clínicas y experimentos in vitro, el interferón41,42,43, sofosbuvir44,45, sales de zinc46 y silvestrol47,48 también han mostrado efectos antivirales. No obstante, queda por encontrar un tratamiento específico para el HEV, obstaculizado por la falta de conocimiento sobre el ciclo de vida del HEV y su patogénesis. Por lo tanto, se necesita urgentemente un sistema de cultivo celular robusto para estudios virológicos y el desarrollo de nuevos medicamentos antivirales49.

Desafortunadamente, al igual que otros virus de la hepatitis, el HEV es difícil de propagar en las líneas celulares convencionales y por lo general progresa muy lentamente, lo que conduce a bajas cargas virales. Sin embargo, algunos grupos fueron capaces de aumentar las cargas virales mediante la generación de subclones de línea celular50 o el ajuste de los suplementos de medios51. Recientemente la generación de clones de ADNc52 y la adaptación de aislados primarios de pacientes mediante la transmisiónde 53,,54 mejoraron aún más la propagación del HEV en el cultivo celular55. En este protocolo, utilizamos el genoma de un cultivo celular adaptado a la cepa Kernow-C1 (denominada p6_WT)54 y una cepa mutante que alberga una mutación que mejora la replicación (denominada p6_G1634R)37. Kernow-C1 es la cepa más utilizada en el cultivo celular HEV y es capaz de producir altas cargas virales. Mediante la evaluación de los números de copia de ARN viral, la replicación de HEV se puede monitorear in vitro. Sin embargo, estas técnicas no permiten evaluar el número de partículas infecciosas que se producen. Por lo tanto, hemos establecido una tinción de inmunofluorescencia para determinar las unidades formadoras de enfoque (FFU/ml).

El método56 descrito aquí se puede utilizar para producir partículas virales infecciosas de longitud completa que son capaces de infectar una variedad de tipos de células de diversos orígenes, incluyendo células primarias y líneas celulares de mamíferos. Este es un requisito previo fundamental para descifrar aspectos importantes de la infección por HEV y el tropismo. No hay necesidad de inoculación con aislados de pacientes generalmente limitados. La producción de partículas HEV infecciosas a partir de plásmidos plantea una fuente infinita, lo que hace que este protocolo sea comparativamente eficiente. Además, este sistema se puede utilizar para la genética inversa que permite el estudio de la alteración del genoma identificado in vivo y su impacto en la replicación y la aptitud del HEV. Esta técnica supera muchas limitaciones y, puede buscar el camino para el desarrollo de fármacos, estudios de mutagénesis y la evaluación de interacciones virus-huésped como restricciones o factores de entrada.

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Protocol

NOTA: Todos los experimentos se realizan bajo la condición BSL-2. Todos los materiales que entren en contacto con el ARN del virus de la Hepatitis E o el virus infeccioso deben enjuagarse correctamente con un 4% de Kohrsolin FF desde un contenedor de residuos dentro de la campana antes de su eliminación.

1. Preparación de Plásmido

  1. Inocular 200 ml de medio LB que contiene 100 g/ml de ampicilina con Escherichia coli JM109 transformada incorporando una codificación de plásmido para la secuencia HEV gt3 Kernow-C1p6 de longitud completa (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54 o pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37). Incubar durante 16 h a 37oC bajo agitación permanente (170 rpm).
    NOTA: El aislamiento de plásmido se llevó a cabo utilizando un kit de extracción de plásmido (ver Tabla de materiales).
  2. Siguiendo el protocolo de fabricación, girar 200 mL de cultivo nocturno a 6.000 x g y 4 oC durante 10 min y desechar el sobrenadante. El pellet bacteriano puede congelarse y almacenarse a -20 oC.
    1. Resuspender el pellet bacteriano en 4 ml de tampón de resuspensión pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica de 10 ml y un pipeta. Además, vórtice rigurosamente.
    2. Añadir 4 ml de tampón de lísis preadmanido (30-40 oC). Invertir suavemente durante varias veces e incubar a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
    3. Añadir 4,8 ml de tampón de neutralización, invertir suavemente y asegurarse de que el izado está neutralizado cuantitativamente (ver descripción del fabricante). A continuación, centrifugar a 11.000 x g y 4 oC durante 20 min.
    4. Coloque una pieza de mull de 2 cm x 2 cm dentro de una punta no filtrante de 1 ml, cargue resuspended, el sobrenadado y neutralizado en una pipeta serológica de 10 ml, agregue 1 ml de punta con mull a la punta de la pipeta serológica y filtre el sobrenadante en un nuevo tubo de 50 ml.
      NOTA: El sobrenadante se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 30 minutos si es necesario.
    5. En varios pasos aplicar 750 l del sobrenadante filtrado en un total de 4 columnas de filtro (proporcionado en el kit) y centrífuga a 11.000 x g para 30 s. Deseche el flujo a través y repita esta secuencia hasta que todo el sobrenadante se aplique en las columnas del filtro.
    6. Lave cada columna de filtro dos veces con 500 ml de tampón de lavado precalificado (50 oC) AW a 11.000 x g durante 30 s y deseche el flujo a través después.
    7. Lavar cada columna de filtro con 600 ml de tampón de lavado A4 centrifugando a 11.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo a través y seque las columnas del filtro por centrifugación a 11.000 x g durante 2 min.
    8. Eluir el ADN plásmido de cada columna de filtro mediante la transferencia de 60 ml de tampón de elución al centro de las columnas del filtro. Incubar durante 1 min a RT y centrifugar a 11.000 x g durante 1 min.
    9. Combinar eluidos y medir la concentración del ADN plásmido extraído utilizando un espectrofotómetro.

2. Linealización y purificación del ADN

Figure 1
   
Figura 1: Configuración experimental esquemática para la linealización del plásmido y la purificación del ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

NOTA: La linealización aumenta el rendimiento del ARN durante la transcripción in vitro (paso 3)

  1. Para linealizar el ADN plásmido (Figura 1) mezclar 10 g del ADN de la plantilla (extraído en el paso 1), 10 l del tampón, 2 l de MluI y ajustar a un volumen de 100 l con H2O.
    1. Incubar durante 1 h a 37oC y confirmar la linealización del plásmido mediante electroforesis de gel de agarosa (p. ej., cargar ADN plásmido no digerido y digerido [1 l de ADN cada uno] en un gel de agarosa al 1% y ejecutar electroforesis a 120 V de corriente constante).
  2. Siguiendo el protocolo de los fabricantes para la extracción de ADN (ver Tabla de Materiales, Figura 1), mezclar 500 l de tampón de unión, proporcionado en el kit, con 100 l de ADN linealizado. Aplique la muestra a una columna de filtro y centrífuga a 17.800 x g durante 30 s. Deseche el flujo a través y vuelva a colocar las columnas del filtro en el mismo tubo.
    1. Lave la columna del filtro añadiendo 650 ml de tampón de lavado y centrifugación a 17.800 x g durante 30 s. Deseche el flujo y vuelva a colocar la columna del filtro en el mismo tubo. Para eliminar el tampón de lavado residual, seque la centrífuga a 17.800 x g durante 60 s y coloque cada columna de filtro en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml después.
    2. Eluda el ADN mediante la transferencia de 60 ml de H2O preadtado (grado PCR, 70 oC) al centro del filtro. Incubar durante 1 min a 70oC y centrifugar a 18.000 x g durante 1 min. Medir la concentración del ADN purificado utilizando un espectrofotómetro.
      NOTA: Almacene el ADN a -20 oC hasta la transcripción in vitro.

3. Transcripción in vitro del genotipo HEV de longitud completa 3 p6 de ADN y purificación de ARN

Figure 2
   
Figura 2: Configuración experimental esquemática para la transcripción in vitro y la purificación del ARN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

NOTA: La transcripción in vitro es necesaria para producir ARN genómico viral a partir del ADN plásmido.

  1. Para la mezcla de transcripción in vitro 20 l de tampón de transcripción T7 5x, TDT de 10 mM, 100 U de inhibidor de ribonucleasa, 25 mM DE ATP, CTP y UTP, 12,5 mM GTP, 5 mM Ribo m7G Cap Analog, 2 g de plantilla de ADN linealizado y 80 de T7 dornasa. Llene hasta 100 l con nucleasa libre H2O, mezcle bien e incubar durante 2 h a 37 oC.
    NOTA: El almacenamiento a corto plazo a -20 oC es posible después de los pasos 3.1 a 3.1.2.
    1. Añadir 2 l de ARN polimerasa T7, mezclar bien e incubar durante otras 2 h a 37oC.
    2. Para digerir la plantilla de ADN inicial, agregue 7,5 l de DNase (libre de ADN, 1 U/L), mezcle bien e incubar a 30 min a 37oC.
      NOTA: Limpie todas las superficies y pipetas con descontaminante de superficie para RNase cuando trabaje con ARN para evitar la degradación. Además, asegúrese de que todos los tubos de reacción estén libres de RNase y estériles. Utilice únicamente puntas con filtros y diluya únicamente con agua estéril y libre de RNase.
  2. Siguiendo el protocolo de fabricación para la extracción de ARN (ver Tabla de Materiales, Figura 2), preparar una premezcla de tampón de lysis y 100% etanol mezclando 330 l de tampón de lysis y 330 l de etanol al 100% para cada reacción de transcripción in vitro. Agregue 660 l de premezcla tampón-etanol de lysis a 110 ml de ARN y vórtice. Cargar la muestra en una columna de filtro y centrífuga a 8000 x g durante 30 s. Deseche el flujo a través y vuelva a colocar la columna del filtro en el mismo tubo.
    1. Añadir 600 l de tampón de lavado y centrífuga a 8000 x g durante 30 s. Deseche la columna de flujo y coloque la columna de filtro de nuevo en el mismo tubo. Añadir 350 l de tampón de lavado y centrífuga a 8000 x g durante 2 min para eliminar el tampón de lavado residual. Coloque cada columna de filtro en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml. Abra la tapa de la columna del filtro y deje que la columna se seque durante 3 min.
    2. Eluir el ARN colocando 50 l de RNase libre de H2O en el centro de la columna del filtro. Incubar durante 1 min a RT y centrifugar posteriormente a 8.000 x g durante 1 min. Compruebe la integridad del ARN cargando 1 l de ARN en un gel de agarosa y medir la concentración de ARN extraído utilizando un espectrofotómetro.
      NOTA: Almacene el ARN a -80 oC hasta que la electroporación y descongele exclusivamente el ARN sobre hielo para evitar la degradación.

4. Preparación de células HepG2 para la producción de HEV (HEVcc) derivada del cultivo celular

Figure 3
   
Figura 3: Configuración experimental esquemática para la preparación de células HepG2 para la producción de HEV derivada del cultivo celular (HEVcc). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

NOTA: Para evitar la contaminación, la preparación de células, electroporación, infección, cosecha y fijación celular se llevaron a cabo en condiciones estériles en una instalación de nivel de bioseguridad 2. Los pasos de incubación a 37 oC que involucran células se lograron en una incubadora de 5% deCO2.

  1. Para preparar las células HepG2 para la producción de HEVcc (Figura 3), células de semillas en el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco completo (DMEM) (ver Tabla 1) en un plato de cultivo recubierto de colágeno de 15 cm (ver Tabla 1, filtro estéril PBS- mezcla de ácido acético a través de malla de 0,2 m antes de añadir colágeno). Incubar a 37oC hasta que las células sean confluentes al 90%.
    NOTA: Cada plato de 15 cm que contiene 90% de células confluentes generará suficientes células para hasta 4 electroporación.
  2. Retire suavemente el medio de la placa y lave las células una vez con 10 ml de 1 PBS. Trypsinize cells mediante la adición de 3 ml de 0.05% de trippsina-EDTA a las células e incubar a 37 oC hasta que las células se desprenden por completo. Resuspend células en 10 ml DMEM completo medio y transferir la suspensión celular en un tubo de 50 ml. Determinar el número total de celdas.
  3. Puesto que cada electroporación requiere 5 x 106 células, transfiera el volumen adecuado en un nuevo tubo de 50 ml y llene hasta al menos 35 ml con 1x PBS. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min y deseche cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet celular.
  4. Lavar las células una vez más con 35 ml de 1x PBS a 200 x g durante 5 min. Coloque las células sobre hielo y no retire 1x PBS todavía, para mantener las células en suspensión.

5. Electroporación de células HepG2

Figure 4
   
Figura 4: Configuración experimental esquemática para la electroporación de células HepG2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Para la electroporación de células HepG2 (Figura 4) preparar 400 l de citomix completo por electroporación complementando 384 l de citomix (ver Tabla 1) con 2 mM ATP y 5 mM de glutatión. Prepárese fresco justo antes de usarlo y colóquelo directamente sobre hielo.
    NOTA: Una ejecución correcta pero rápida de los siguientes pasos es crucial. Por lo tanto, asegúrese de que todo está preparado correctamente.
  2. Retire con cuidado 1x PBS sin alterar el pellet celular del paso 4.4. Resuspender 5 x 106 células en 400 l de Cytomix completo y añadir 5 g de ARN del paso 3.2.2. Transfiera la solución a una cubeta de 4 mm y pulse una vez con 975 oF, 270 V para 20 ms con un sistema de electroporación.
    1. Después de la electroporación transferir las células tan pronto como sea posible con una pipeta Pasteur en 11 mL DMEM completa por electroporación.
      NOTA: Para asegurarse de que el ARN se transfectúe correctamente en las células HepG2, se realizará un control de transfección (TC). Las tasas de transfección esperadas varían entre el 40-60% de las células ORF2 positivas.
  3. Transfiera 10 ml de células electroporadas a un plato de cultivo de 10 cm recubierto con colágeno. Añadir 1,3 x 105 células electroprorated (300 oL) en un pocero de una placa de 24 microtitulaciones recubierta de colágeno que lleve un resbalón de cubierta (más tarde utilizado como control de transfección). Distribuya las células uniformemente e incubar a 37 oC.
    1. Después de 24 h, cambie el medio del plato de 10 cm y sustitúyalo con 10 ml de DMEM fresco completo. No cambie el medio del control de transfección. Incubar durante otros 6 días a 37oC.
  4. Detenga el control de transfección en 24 pocillos 5-7 d después de la electroporación dependiendo de la densidad celular continuando con el protocolo de tinción de inmunofluorescencia (paso 8). La eficiencia de la transfección se calcula contando el número de celdas positivas ORF2 normalizadas al número total de celdas.

6. Cosecha de HEVcc intra y extracelular

Figure 5
   
Figura 5: Configuración experimental esquemática para la cosecha de HEVcc intra y extracelular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Para cosechar HEVcc extracelular(Figura 5), filtrar el sobrenadante, obtenido del plato de 10 cm después de 6 días (paso 5.3.1), a través de una malla de 0,45 m para eliminar cualquier residi de celda. Almacene heVcc extracelular cosechado a 4 oC para la infección del mismo día, de lo contrario guárdelo a -80 oC.
  2. Para cosechar HEVcc intracelular (Figura 5), lavar las células con 1x PBS y trippsinizar añadiendo 1,5 ml de 0,05% de trippsina-EDTA. Incubar a 37oC hasta que las células se desprendieran por completo. Añadir 10 ml de DMEM completo, placa de descarga para separar las células y transferir la suspensión de las células en tubo de 50 ml. Lave las células dos veces con PBS. Centrífuga a 200 x g durante 5 min.
    1. Deseche el sobrenadante y resuspendir el pellet celular en 1,6 ml de DMEM completo por electroporación. Transfiera la suspensión celular a un tubo de reacción de 2 ml.
      NOTA: No utilice volúmenes más grandes, ya que reduciría drásticamente las cargas virales.
    2. Congelar (en nitrógeno líquido) y descongelar las células. Repita esta secuencia 3 veces.
      NOTA: No acoba más de una electroporación (1,6 ml) para los 3 ciclos de congelación y descongelación, ya que la eficiencia de la lisis se vería afectada. No vórtice la suspensión celular entre los ciclos. Asegúrese de descongelar la suspensión celular lentamente (por ejemplo, temperatura ambiente o sobre hielo) para maximizar las cargas virales.
    3. Centrifugar la alta velocidad de las células de lesed durante 10 minutos a 10.000 x g para separar los desechos celulares. Transfiera el sobrenadante en un tubo nuevo. Tome el sobrenadante para la infección, de lo contrario almacenar a -80 oC.
    4. Opcionalmente, concentre el HEVcc extra e intracelular utilizando un concentrador para aumentar las cargas virales (según el protocolo del fabricante).

7. Infección de células HepG2/C3A con HEVcc intra y extracelular

Figure 6
   
Figura 6: Configuración experimental esquemática para la infección de células HepG2/C3A con HEVcc intra y extracelular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

NOTA: La infección de las células HepG2/C3A garantizará que se produjeran partículas infecciosas. Además, la valoración del HEVcc intracelular y extracelular cosechado se utiliza para calcular los títulos de virus en FFU/ml. Esto se denominará más adelante control de infecciones (IC).

  1. Para preparar las células HepG2/C3A para la infección por HEVcc (Figura 6), precalentar Medio Esencial Mínimo (MEM) completo (ver Tabla 1) a 37oC.
    1. Semilla 2 x 104 células/pozo en 100 l sobre la placa de microtíter recubierto de colágeno 96 pozos un día antes del paso 6. Asegúrese de llenar los pozos más exteriores con 1x PBS para evitar la evaporación del medio dentro de los 60 pomos internos. Incubar a 37oC durante 24 h.
    2. Infectar con HEVcc extracelular añadiendo 50 l del sobrenadante (desde el paso 6.1) a las células HepG2/C3A sembradas el día anterior. Mezclar bien en pipeteando hacia arriba y hacia abajo y diluir en serie seis veces 1:3 transfiriendo 50 l al siguiente pozo. Realice duplicados de dilución en serie para réplicas técnicas.
    3. Infectar con HEVcc intracelular añadiendo un sobrenadante de 25 l (desde el paso 6.2.3) a las células HepG2/C3A sembradas el día anterior. Mezclar bien en pipeteando hacia arriba y hacia abajo y diluir en serie seis veces 1:5 transfiriendo 25 l al siguiente pozo. Realice la dilución serial de duplicados para la replicación técnica.
    4. Después de 7 d a 37 oC detener la infección continuando con el protocolo de tinción de inmunofluorescencia (paso 8).

8. Tinción de inmunofluorescencia de transfección y control de infecciones

Figure 7
   
Figura 7: Configuración experimental esquemática para la tinción de inmunofluorescencia de la transfección y el control de infecciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Para la tinción de inmunofluorescencia (Figura 7), lavar 3x con 1x PBS y fijar células mediante la dosificación de 350 l (control de transfección [TC]) o 50 l (control de infección [IC]) de 4% solución de fijación por pozo. Incubar durante 15 minutos en RT y lavar cuidadosamente dos veces con 1x PBS después.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí para el control de transfección hasta que la infección de las células HepG2/C3A se detenga también. Conservar la placa del pozo a 4oC. También sellar con parafilm para evitar la evaporación.
  2. Permeabilizar las células mediante la adición de 350 l (TC) o 50 l (IC) de 0,2% Tritón X-100 (en 1 PBS) durante 5 minutos en RT. A continuación, lave cuidadosamente dos veces con 1 PBS y bloquee con 350 l (TC) o 50 l (IC) de 5% de suero de caballo (en 1x PBS) durante 1 h a RT bajo agitación constante en un agitador orbital (30 rpm).
    NOTA: Prepare un plato de plástico pequeño (30 mm) colocando un tejido húmedo en el interior y una capa de película de parafina en la parte superior, creando una cámara húmeda. A continuación, transfiera el resbalón de la cubierta TC mirando hacia arriba a la película de parafina. Los siguientes pasos para el TC se ejecutarán en la cámara húmeda.
  3. Añadir 70 l (TC) o 25 l (IC) de anticuerpo primario anti-ORF2 8282 (suero hiperinmune de conejo específico de HEV,1:5.000 en 5% de suero de caballo) por pozo e incubar durante la noche a 4 oC bajo agitación constante en un agitador orbital (30 rpm).
    1. Lavar cuidadosamente dos veces con 1x PBS y añadir 70 l (TC) o 25 l (IC) de anticuerpo secundario anti-conejo de cabra 488 (1:1,000 en 5 % de suero de caballo). Incubar durante 1 h bajo agitación constante en un agitador orbital (30 rpm) en la oscuridad. Una vez más, lave cuidadosamente dos veces con 1x PBS
  4. Añadir 70 l (TC) o 25 l (IC) de DAPI (1:10.000 en H2O) e incubar durante 1 min. Lavar cuidadosamente dos veces con H2O. Saque el resbalón de la cubierta de la cámara húmeda, monte el resbalón de la cubierta con 6 sl del reactivo de montaje boca abajo en un portaobjetos de cubierta (solo para TC) y deje secar el reactivo de montaje durante 16 h en RT en la oscuridad. Almacene el CI en agua hasta que se cocine la placa y selle la placa con película de parafina para evitar el secado debido a la evaporación.
  5. Tome imágenes para confirmar la transfección y la infección exitosas.
    NOTA: Se obtuvieron resultados comparables utilizando el anticuerpo anti-ORF2 1E6 disponible en el comercio57 (1:200 en 5 % de suero de caballo) y un anticuerpo secundario burro antiratón (1:1.000 en 5 % de suero de caballo)

9. Determinación de la FFU

NOTA: Una FFU se define como una o más células ORF2 positivas separadas de otra FFU por al menos tres células negativas.

  1. Para el HEVcc extracelular empezar a contar todos los focos ORF2 positivos de los dos pozos en las dos diluciones más bajas. Se deben contar un total de cuatro pozos. Las unidades formadoras de enfoque (FFU) por mililitro se pueden calcular con la siguiente ecuación:

    Equation 1
    NOTA: Los títulos esperados varían entre10 2 y 5 x 104 FFU/mL.
  2. Para los HEVcc intracelulares comienzan a contar todos los focos ORF2 positivos en pozos donde se observan entre 50 y 100 focos. Además, cuente los dos pozos en la siguiente dilución más alta. Se deben contar un total de cuatro pozos. Las unidades formadoras de enfoque (FFU) por mililitro se pueden calcular con la siguiente ecuación:

    Equation 2
    NOTA: Los títulos esperados varían entre 105 y 3 x 106 FFU/mL. Los factores 20x y 40x se utilizan para extrapolar el número de FFU por 50 l y de 25 l a 1 ml y se pueden adaptar en consecuencia.

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Representative Results

En este protocolo, describimos la producción de HEVcc infeccioso de alto título. El primer paso es aislar el ADN plásmido (pBluescript_SK_HEVp654 y pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figura 8a), que luego se linealiza mediante la digestión de restricción y se purifica para la transcripción in vitro (Figura 1). Una linealización exitosa se puede verificar comparando el plásmido-ADN no digerido con el plásmido-ADN digerido usando electroforesis de gel. Además de un cambio de tamaño, solo una banda de ADN debe ser visible representando la forma lineal. La linealización se completa cuando las otras dos bandas por encima y por debajo de la forma lineal, que representan el círculo nicked y la forma supercoiled, respectivamente, se reducen por completo (Figura 8b). El rendimiento del ADN purificado debe superar los 150 ng/L. Sólo si estas características son verdaderas, el ADN linealizado debe utilizarse para la transcripción in vitro. El ARN transcrito in vitro debe ser bien revisado usando electroforesis de gel y en caso de baja Abundación de RNase debe mostrar bandas distintas en lugar de un frotis borroso (Figura 8c). Además, el rendimiento de ARN purificado debe superar los 500 ng/L El ARN transcrito in vitro (Figura 2) eventualmente se electroporated en células HepG2 para la producción de virus (Figura 3 y Figura 4). La electroporación exitosa es monitoreada por la tinción de inmunofluorescencia del control de transfección (Figura 9a). La eficiencia de la transfección debe superar el 40%(Figura 9b). Un mutante deficiente de replicación sirve como un control negativo, para garantizar la especificidad de la tinción ORF2, ya que no se espera ninguna expresión ORF2 (Figura 9c). Después de 7 días de incubación, los HEVcc envueltos (extracelulares) se cosechan recogiendo y filtrando el sobrenadante del cultivo celular. HeVcc no envolvente (intracelular) se libera de las células mediante varios ciclos de congelación y descongelación. Para eliminar cualquier resido celular, el izado celular se centrifuga a alta velocidad (Figura 5). Posteriormente, ambas especies de HEVcc se utilizan para infectar las células HepG2/C3A por dilución en serie(Figura 6 y Figura 9d). De acuerdo con las ecuaciones anteriores (ver paso 9) los títulos virales se determinan mediante el cálculo de la FFU.

Los resultados representativos se muestran en la Figura 9. El control de la transfección debe comprender alrededor del 50% de células ORF2 positivas para garantizar una cantidad eficiente de virus que se produce(Figura 9a,b). Cuantos menos células ORF2-positivas, más bajo será el título. Precisamente siguiendo los pasos mencionados en el protocolo se generarán títulos que varían entre 105 y 3 x 106 FFU/ml para el HEVcc no envolvente (intracelular). Para los títulos HEVcc envueltos (extracelulares) entre 102 y 5 x104 FFU/mL se esperan (Figura 9e). Además, se observaron recuentos elevados de FFU para el mutante G1634R. Al calcular la relación entre las copias del genoma y las partículas virales infecciosas, se encontró que el HEVcc intracelular producido tanto para p6_WT como para p6_G1634R era menor en comparación con el HEVcc extracelular, lo que sugiere una mayor infectividad específica de la especie HEV no envuelta (Figura 9f).

Figure 8
   
Figura 8: Generación de ARN transcrito in vitro.
(A) Ejemplo de un espectro de absorbancia de Plásmido-ADN aislado. (B) Electroforesis de gel de Plásmido-DNA no digerido y digerido. (C) Electroforesis de gel de ARN transcrito in vitro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
   
Figura 9: Resultados representativos de la producción de HEVcc de alto título.
(A) Control de la transfección de células HepG2 electroporadas. Las células trans infectadas se tiñeron con anticuerpos anti-ORF2 (verde, LS-Bio) y DAPI (azul). (B) La eficiencia de la transfección se calculó por el número de celdas positivas ORF2 normalizadas al número total de celdas. (C) Un mutante deficiente en replicación sirve como un control negativo para la tinción de inmunofluorescencia, para asegurar la especificidad de ORF2. (D) Para la determinación de FFU se realizaron diluciones en serie de las existencias de virus producidas. Las células positivas ORF2 se representan en blanco. (E) Los títulos virales se calcularon mediante el recuento de FFU y (F) las cargas virales fueron determinadas por qPCR y normalizadas a FFU/mL. Las barras muestran la media y la desviación estándar de 38 y 10 experimentos independientes, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Solución de trabajo Concentración Volumen
Colágeno 40 mL Pbs
40 l Acido acético
1 mL Solución de colágeno R 0,4% estéril
Cytomix 120 mM Kcl
0,15 mM CaCl2
10 mM K2HPO4 (pH 7.4)
25 mM HEPES
2 mM Egta
DMEM completo 500 mL DMEM
5 mL Pluma/Strep
5 mL NEAA MEM (100X)
5 mL L-glutamin
50 mL Suero bovino fetal
MEM completo 500 mL Mem
5 mL Pyruvat de sodio
5 mL Gentamicina
5 mL NEAA MEM (100X)
5 mL L-glutamina
50 mL IgG ultrabajo

Tabla 1: Tabla de composición de búfer.

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Discussion

A partir de la preparación del plásmido, los rendimientos del ADN deben superar los 150 ng/L para poder realizar una linealización múltiple desde el mismo stock de plásmido, lo que minimiza el riesgo de mutagénesis inducida por bacterias de secuencias genomas cruciales. Además, es importante comprobar el resumen de restricción para la linealización completa del plásmido por electroforesis de gel(Figura 8b). La falta de ADN plásmido linealizado induciría la amplificación del círculo rodante haciendo que la transcripción in vitro fuera menos eficiente. Además, se debe confirmar la integridad del ARN para evaluar la abundancia de ARN dentro de la muestra (Figura 8c). Sólo entonces se debe considerar una electroporación de las células diana. Cabe destacar que antes de comenzar con la preparación de las células HepG2, asegúrese de que todo esté a mano y bien preparado evitando largos períodos de espera. Especialmente, asegurar el almacenamiento a corto plazo de las células y el ARN en el Cytomix hasta la electroporación. Para eludir el calentamiento de las células durante la electroporación es esencial enfriar el tampón sobre hielo de antemano. La duración del pulso no debe exceder 20-25 ms y 270 V. Después de la electroporación, las células requieren una transferencia rápida a un medio fresco para garantizar la viabilidad celular. Antes de la infección de las células diana, se debe comprobar el porcentaje de células ORF2 positivas. En caso de que el TC no muestre células ORF2 positivas, lo más probable es que la electroporación haya fallado o que la tinción no haya funcionado, y que el experimento se repita.

Al cosechar intracelular HEVcc se debe prestar especial atención a la velocidad de los ciclos de congelación y descongelación. Los títulos virales se pueden aumentar ejecutando la congelación en nitrógeno líquido en lugar de a -80 oC. Por el contrario, la descongelación debe tener lugar de la manera más lenta posible sugiriendo el almacenamiento en hielo hasta que la suspensión de la célula se liquide por completo. Sin embargo, también es posible descongelar la suspensión celular a temperatura ambiente, en una incubadora de 37 oC o baño de agua, sin embargo, cuanto más rápido se ejecute el descongelación, más disminuirán los títulos.

Dependiendo de los siguientes experimentos también es posible hacer los ciclos de congelación y descongelación en MEM completo o 1x PBS sin pérdida dramática de títulos virales, sin embargo, hay que tener en cuenta que esto hace que el HEVcc extracelular esté en un medio diferente al hevcc intracelular.

Siguiendo estos pasos cruciales del protocolo, los títulos esperados varían entre 105 y 3 x 106 FFU/ml para el HEVcc no envuelto (intracelular). Para los títulos HEVcc envueltos (extracelulares) se esperan títulos entre10 2 y 5 x10 4 FFU/mL (Figura 9e). Hasta ahora, los estudios que emplean sistemas de cultivo celular HEV monitorean la replicación viral y la propagación predominantemente por qPCR. La evaluación de las copias del genoma del ARN todavía no proporciona ninguna visión sobre el ensamblaje y la liberación de partículas infecciosas.

Un estudio anterior58 propagó con éxito aislados de pacientes en cultivo celular con títulos máximos de 103 TCID50/ml. Como se ha demostrado recientemente, también es posible pasar con éxito HEVcc en el cultivo celular y adaptar nuestro protocolo a otras cepas, tales como 47832c y 83-2 que no albergan una inserción en la región hipervariable56. Además, si las secuencias derivadas del paciente se pueden clonar en la columna vertebral del vector Bluescript y aún así no se probaron títulos virales altos. Con el método introducido, las partículas virales no envueltas y envueltas pueden ser cosechadas y utilizadas para inocular una variedad de líneas celulares ingenuas como A549, Huh7.5, Jeg-3 y hepatocitos primarios humanos y porcinos, proporcionando un beneficio para futuras aplicaciones como la investigación del tropismo HEV, la patogénesis, el desarrollo de fármacos, las interacciones virales y de los huéspedes, los estudios de inactivación, los anticuerpos neutralizantes y muchos más.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Estamos agradecidos a Suzanne Emerson por el clon del virus de la hepatitis E p6. Suero hiperinmune de conejo específico de HEV fue amablemente proporcionado por Rainer Ulrich, Instituto Friedrich Loeffler, Alemania. Además, agradecemos a todos los miembros del Departamento de Virología Molecular y Médica de la Universidad del Ruhr Bochum por su apoyo y discusión. Las figuras 1-7 se generaron con BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm mesh Sarstedt 83.1826 Harvest extracellular Virus
4 % Histofix CarlRoth P087.4 Immunofluorescence
Acetic acid CarlRoth 6755.1 Collagen working solution
Amicon Ultra-15 Merck Millipore UFC910024 Virus harvesting
Ampicillin Sigma-Aldrich A1593 Selection of transformed bacteria
ATP Roche 11140965001 in vitro transcription and electroporation
BioRender BioRender Figure Generation
CaCl2 Roth 5239.2 Cytomix
Collagen R solution 0.4 % sterile Serva 47256.01 Collagen working solution
CTP Roche 11140922001 in vitro transcription
Cuvette Biorad 165-2088 Electroporation
DAPI Invitrogen D21490 Immunofluorescence
DMEM gibco 41965-039 Cell culture
DNAse Promega M6101 in vitro transcription
DTT Promega included in P2077 in vitro transcription
EGTA Roth 3054.3 Cytomix
Escherichia coli JM109 Promega L2005 Transformation
Fetal bovine serum gibco 10270106 Cell culture
Fluoromount SouthernBiotech 0100-01 Immunofluorescence
GenePulser Xcell Electroporation System BioRad 1652660 Electroporation
Gentamycin gibco 15710049 Cell culture
GTP Roche 11140957001 in vitro transcription
H2O Braun 184238001 Immunofluorescence
Hepes Invitrogen 15630-03 Cytomix
Horse serum gibco 16050122 Immunofluorescence
K2HPO4 Roth P749.1 Cytomix
KCL Roth 6781.3 Cytomix
KH2PO4 Roth 3904.2 Cytomix
L-Glutamin gibco 25030081 Cell culture
L-Glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251-5G Cytomix
MEM gibco 31095-029 Cell culture
MEM NEAA (100×) gibco 11140-035 Cell culture
MgCl2 Roth 2189.2 Cytomix
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One Thermo Fisher ND-ONE-W DNA/RNA concentration
MluI enzyme NEB R0198L Linearization
NEB buffer NEB included in R0198L Linearization
NucleoSpin Plasmid kit Macherey & Nagel 740588.250 Plasmid preparation
NucleoSpin RNA Clean-up Kit Macherey & Nagel 740948.250 RNA purification
PBS gibco 70011051 Cell culture
Pen/Strep Thermo Fisher 15140122 Cell culture
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) Todt et.al Virus production
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) Shukla et al. GenBank accession no. JQ679013 Virus production
Primary antibody 1E6 LS-Bio C67675 Immunofluorescence
Primary antibody 8282 Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 DNA extraction
Ribo m7G Cap Analog Promega P1711 in vitro transcription
RNase away CarlRoth A998.3 RNA purification
RNasin (RNase inhibitor) Promega N2515 in vitro transcription
Secondary antibody donkey anti-mouse 488 Thermo Fisher A-21202 Immunofluorescence
Secondary antibody goat anti-rabbit 488 Thermo Fisher A-11008 Immunofluorescence
Sodium Pyruvat gibco 11360070 Cell culture
T7 RNA polymerase Promega P2077 in vitro transcription
Transcription Buffer Promega included in P2077 in vitro transcription
Triton X-100 CarlRoth 3051.3 Immunofluorescence
Trypsin-EDTA (0.5 %) gibco 15400054 Cell culture
ultra-low IgG gibco 1921005PJ Cell culture
UTP Roche 11140949001 in vitro transcription

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