Summary
여기에 설명된 이종세포를 효율적으로 감염시키기 위해 E형 간염 바이러스(HEV)의 높은 바이러스 성 티터 스톡을 생성하는 방법에 대한 효과적인 방법이 기재되어 있다. 제시된 방법을 통해, 비봉투뿐만 아니라 둘러싸인 바이러스 성 입자를 모두 수확하고 다양한 세포주를 접종하는 데 사용될 수 있다.
Abstract
E형 간염 바이러스는 전 세계적으로 증가하는 보급과 간 간 경변및 간 부전의 주요 원인입니다. 단일 좌초 RNA 바이러스는 주로 수혈, 부적절한 위생 조건 및 오염된 식품에 의해 전달됩니다. 현재까지 오프 라벨 약물 리바비린 (RBV)은 많은 환자를위한 선택의 치료입니다. 그럼에도 불구 하 고, 특정 HEV 치료 확인 될 남아. 지금까지 HEV 수명 주기 및 병인에 대한 지식은 효율적인 HEV 세포 배양 시스템의 부족으로 인해 심각하게 방해받고 있습니다. 강력한 세포 배양 시스템은 또한 바이러스성 병인을 포함하는 바이러스성 생활 주기의 연구 결과에 필수적입니다. 여기에 설명된 방법을 통해 최대 3 x 106 초점 성형 장치/mL(FFU/mL)의 바이러스 성 티터를 생성할 수 있으며, 봉투에 싸인 HEV의 최대 5 x 104 FFU/mL을 생성할 수 있다. 이러한 입자를 이용하여, 동물 세포주뿐만 아니라 1차 세포 및 인간을 포함한 다양한 기원의 세포를 감염시킬 수 있다. 플라스미드에서 전염성 HEV 입자의 생산은 무한한 소스를 제기, 이는이 프로토콜을 매우 효율적으로.
Introduction
E형 간염은 전 세계적으로 보급이 증가하는 상당히 과소 평가된 질병입니다. 대략 2천만 개의 감염은1년에70,000의 죽음 귀착됩니다. 기본 에이전트, E형 간염 바이러스 (HEV), 최근에 재할당되고 지금 제네라 Orthohepevirus 및 Piscihepevirus를 포함하여 가족 Hepeviridae 안에 분류됩니다. 다양한 기원의 HEV는 인간, 돼지, 토끼, 쥐, 조류 및 기타 포유동물2로부터분리된 것을 포함하여 종 오르토헤페바이러스 A-D 종 내에서 분류된다. 현재, 양성 지향성, 단일 좌초 RNA 바이러스의 8가지 상이한 유전자형(GT)이2로확인되었다. 그들은 그들의 순서 정체성, 전송 경로 및 지리적 분포에서 다르지만, 그들의 게놈 구조는 높게 보존됩니다. 보다 구체적으로, 7.2 kbp HEV 게놈은 3개의 주요 개방 판독 프레임(ORF1-3)으로 나뉩니다. ORF1은 숙주 세포 내에서 성공적인 복제에 필요한 모든 효소를 인코딩하는 동안, ORF2는 캡시드 단백질을 인코딩하고, ORF3 단백질은 전염성 입자의 조립 및 방출에 필요한 기능성 이온 채널로작동한다 3. 일단 기저 또는 어형 루멘 HEV에 방출되면 바이러스가 혈액 또는 대변에서 유래하는지 여부에 따라 준 봉투 및 비 봉투 / 벌거 벗은 종, 각각4,,5에존재한다.
GT1과 GT2는 주로 개발 도상국에서 발견 되 고 만 인간을,감염6 배설물 구두 경로 통해, GT3, GT4 및 GT7은 주로 선진국 에서 발생,71,,7 저수지로 봉사 하는 종의 다양한, 예를 들어, 돼지8,쥐9,닭10,,11,사슴12,몽구스13,박쥐14,토끼15,,16,야생 멧돼지17 그리고 더 많은7,,18,,19,동물원의 증거를제공,20, 20.2122 부적절한 위생조건(23)과 오염된식품(12,,24,,,25,26)이외에 수혈 및 장기 이식을 통한 전송도27,,28로가능하다. HEV는 간경변과 간 부전의 일반적인원인(특히 기존 간질환 환자, 면역손상형 3, 4, 7) 및 임산부(유전자형 1)를 가진 환자에서 특히 있다. ,참고로, 조혈질환(30,30,31,32)신경장애(33) 및신장손상(34)과같은 외형증상도 있다.
현재까지, 오프 라벨 약물 리바비린 (RBV)은 많은 감염된 환자에 대한 선택의치료입니다 35,,36. 그러나, 치료 실패와 가난한 임상 장기 결과의 경우 보고 되었습니다. 치료 실패는 만성 감염 환자에서 바이러스 돌연변이 발생 및 증가 된 바이러스 성 이질성에 연결되었습니다37,,38,,39. 반대로, 최근 유럽의 회고전 다중센터 연구는 중합효소 돌연변이를 RBV 치료실패(40)와상관연관시킬 수 없었다. 임상 관찰 및 체외 실험에서 인터페론41,,42,,43,소파부비르44,,45,아연 염46 및 실베스트롤47,,48도 항바이러스 효과를 보였다. 그럼에도 불구 하 고, 특정 HEV 치료 발견 될 남아, HEV 라이프 사이클및 그것의 병인에 대 한 지식의 부족에 의해 방해. 따라서, 바이러스학 연구 및 새로운 항바이러스 약물의 개발을 위한 견고한 세포 배양 시스템이 절실히 필요하다49.
불행히도, 다른 간염 바이러스와 마찬가지로 HEV는 기존의 세포주에서 전파하기가 어렵고 일반적으로 바이러스 부하가 적기 때문에 매우 느리게 진행됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 일부 그룹 셀 주 subclones의 생성에 의해 바이러스 부하를 높일 수 있었다50 또는 미디어 보충제의 조정51. 최근에는 cDNA클론(52)의 생성과 1차 환자의 적응이53,,54로 세포배양에서HEV 전파를 더욱 개선하여 분리한다. 본 프로토콜에서, 우리는 Kernow-C1 균주(p6_WT라고 함)및 복제 강화 돌연변이(p6_G1634R라고 함)를 수용하는 돌연변이 균주(p6_G1634R)를 적응한 세포 배양의 게놈을 사용했다.37 Kernow-C1은 HEV 세포 배양에서 가장 자주 사용되는 변형이며 높은 바이러스 부하를 생성 할 수 있습니다. 바이러스 RNA 복사 번호를 평가함으로써 HEV 복제를 시험관 내에서 모니터링할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 기술은 생성되는 전염성 입자의 수의 평가를 허용하지 않습니다. 따라서, 우리는 초점 성형 단위 (FFU/mL)를 결정하기 위하여 면역 형광 염색을 설치했습니다.
본 설명된방법(56)은 1차 세포 및 포유류 세포주를 포함한 다양한 기원으로부터 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있는 전신 전염성 바이러스 입자를 생산하는 데 사용될 수 있다. 이것은 HEV 감염과 트로피주의의 중요한 측면을 해독하기 위한 근본적인 전제 조건입니다. 일반적으로 제한된 환자 격리를 가진 접종을 위한 필요가 없습니다. 플라스미드에서 전염성 HEV 입자의 생산은 무한한 소스를 포즈, 이 프로토콜을 비교적 효율적으로. 또한, 이 시스템은 생체 내에서 확인된 게놈 변경 및 HEV 복제 및 적합성에 미치는 영향을 연구가능하게 하는 역유전학에 사용될 수 있다. 이 기술은 많은 한계를 극복하고, 약물 개발, 돌연변이 발생 연구 및 제한 또는 진입 요인과 같은 바이러스 호스트 상호 작용의 평가를 위한 길을 길수 있습니다.
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Protocol
참고: 모든 실험은 BSL-2 조건하에서 수행됩니다. E형 간염 바이러스 RNA 또는 전염성 바이러스와 접촉하는 모든 물질은 폐기 전에 후드 내부의 폐기물 용기에서 4% Kohrsolin FF로 올바르게 헹구어야 합니다.
1. 플라스미드 준비
- 100 μg/mL 암피실린을 함유한 이노큐레이트 200 mL LB 배지는 전신 HEV gt3 Kernow-C1p6 서열(pBluescript_SK_HEVp6[JQ679013]54 또는 pBluescript_SK_HEVp6-G163R37)에대한 플라스미드 인코딩을 통합한 변형된 에슈리치아 대장균 JM109를 함유하고 있습니다. 영구 동요 (170 rpm)에서 37 °C에서 16 h에 대한 배양.
참고: 플라스미드 절연은 플라스미드 추출 키트를 사용하여 수행하였다(재료표참조). - 제조 프로토콜에 따라, 10 분 동안 6,000 x g및 4 °C에서 하룻밤 문화의 200 mL을 아래로 회전하고 상체를 폐기하십시오. 세균성 펠릿은 -20°C에서 냉동 및 보관할 수 있다.
- 10mL 세로지 피펫과 파이펫 맨으로 위아래로 피펫을 하여 4mL의 재서스펜션 버퍼에서 세균 펠릿을 재연합니다. 또한, 엄격하게 소용돌이.
- 미리 따뜻해지는 리시스 버퍼(30-40°C)의 4mL를 추가합니다. 여러 번 부드럽게 반전하고 실온 (RT)에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 4.8mL의 중화 버퍼를 추가하고 부드럽게 반전하고 lysate가 정량적으로 중화되는지 확인합니다(제조업체설명 참조). 그런 다음 원심분리기는 11,000 x g및 4°C에서 20분 동안.
- 1mL 비필터 팁 안에 2cm x 2cm 멀 조각을 놓고, 10mL 세로지피테에 재장전, 리스 및 중화 된 상체를 적재하고, 세리컬 피펫 끝에 멀이 있는 1mL 팁을 추가하고 새로운 50mL 튜브에서 상퍼를 필터링합니다.
참고: 수퍼나탄은 필요한 경우 최대 30분 동안 4°C에 보관할 수 있습니다. - 여러 단계에서 필터링된 상체의 750 μL을 총 4개의 필터 열(키트에 제공됨)에 적용하고 원심분리기는 30초 동안 11,000 x g로 적용합니다.
- 각 필터 컬럼을 500 μL(50°C)의 세척 버퍼 AW를 11,000 x g에서 30s로 세척하고 그 후 흐름을 폐기합니다.
- 각 필터 컬럼을 600 μL의 세척 버퍼 A4를 30s에 11,000 x g에서 원심분리하여 세척합니다. x g
- 각 필터 컬럼에서 60 μL의 용출 버퍼를 필터 컬럼의 중앙으로 이송하여 플라스미드 DNA를 엘테. RT에서 1분 동안 인큐베이션을 하고 원심분리기는 11,000 x g에서 1분 동안 배양합니다.
- 용액을 결합하고 분광광계를 사용하여 추출 된 플라스미드 DNA의 농도를 측정합니다.
2. 선형화 및 DNA 정제
도 1: 플라스미드 선형화 및 DNA 정제를 위한 회로도 실험 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
참고: 선형화는 시험관 내 전사 중 RNA 수율을 증가시킵니다(3단계)
- 플라스미드DNA(도 1)를선형화하기 위해 템플릿 DNA의 10 μg(1단계에서 추출), 완충제의 10μL, 2 μL의 MluI를 혼합하고 H2O로 100 μL의 부피에 적응한다.
- 37°C에서 1시간 동안 배양하고 아가로즈 겔 전기포광에 의한 플라스미드의 선형화를 확인한다(예를 들어, 비소화 및 소화된 플라스미드 DNA[DNA의 1μL]를 1% 아가로즈 겔및 120V 상수 전류로 전기포고증을 실행한다).
- DNA 추출을 위한 제조업체의 프로토콜(재료 표, 도 1참조) 키트에 제공된 결합 버퍼의 500 μL을 선형화된 DNA의 100 μL과 혼합합니다. 샘플을 필터 컬럼에 적용하고 원심분리기는 30초 동안 17,800 x g로 적용합니다.
- 30초에 17,800 x g에서 650 μL의 워시 버퍼와 원심분리를 추가하여 필터 컬럼을 세척합니다. 잔류 세척 버퍼를 제거하려면, 60 s에 대한 17,800 x g에서 건조 원심분리기를 하고 그 후 깨끗한 1.5 mL 마이크로 센트심분리기 튜브에 각 필터 컬럼을 배치합니다.
- 예동H2O(PCR등급, 70°C)의 60 μL을 필터의 중심으로 이송하여 DNA를 엘ute DNA. 70°C에서 1분 동안 배양하고 원심분리기는 18,000 x g에서 1분 동안 배양합니다.
참고: 시험관 내 전사가 될 때까지 DNA를 -20°C로 저장합니다.
3. 전신 HEV 유전자형 3 p6 DNA 및 RNA 정제의 시험관 내 전사
도 2: 체외 전사 및 RNA 정제를 위한 회로도 실험 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
참고: 체외 전사는 플라스미드 DNA에서 바이러스 성 게놈 RNA를 생성하는 데 필요합니다.
- 시험관 내 전사 믹스 20 μL 의 5x T7 전사 완충제, 10 mM DTT, 100 U 의 리보누셀리스 억제제, 25 mM ATP, CTP 및 UTP, 12.5 mM GTP, 5 mM 리보 m7G 캡 아날로그, 선형화된 DNA의 2 μg, 및 80 T 폴리머의 U. 최대 100 μL의 뉴클레아제 프리 H2O로 채우고 잘 섞고 37°C에서 2시간 동안 배양하십시오.
참고: -20°C에서 단기 보관은 3.1~ 3.1.2단계 후에 가능하다.- T7 RNA 폴리머라제 2μL을 넣고 잘 섞고 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- 초기 DNA 템플릿을 소화하려면 7.5 μL의 DNase(RNase free, 1 U/μL)를 추가하고 잘 섞고 37°C에서 30분에 배양합니다.
참고: RNA로 작업할 때 RNase용 표면 데온타미닌제로 모든 표면과 파이펫을 청소하여 저하를 방지합니다. 또한 모든 반응 튜브가 RNase가 없고 멸균되었는지 확인하십시오. 필터가 있는 팁만 사용하고 RNase 가 없고 멸균된 물로만 희석하십시오.
- RNA 추출을 위한 제조 프로토콜(재료 표, 도 2참조)에 따라, 각 체외 전사 반응에 대해 330 μL의 Lysis 버퍼 330 μL 및 330 μL을 혼합하여 리시스 버퍼및 100% 에탄올의 프리믹스를 준비한다. 660 μL의 리시스 완충-에탄올 프리믹스를 RNA와 소용돌이의 110 μL에 추가합니다. 필터 컬럼과 원심분리기의 샘플을 8000 x g에서 30초 동안 적재합니다.
- 워시 버퍼 600 μL과 원심분리기를 8000 x g에 넣고 30초 동안 흐름통과를 버리고 필터 컬럼을 같은 튜브에 다시 배치합니다. 잔류 세척 버퍼를 제거하기 위해 워시 버퍼 350 μL과 원심분리기를 8000 x g에 2분 간 추가합니다. 깨끗한 1.5 mL 마이크로 센세이퍼지 튜브에 각 필터 열을 놓습니다. 필터 컬럼의 뚜껑을 열고 컬럼을 3분 동안 건조시다.
- RNase 자유 H2O의 50 μL을 필터 컬럼의 중앙에 배치하여 RNA를 엘ute RNA. RT에서 1분 동안 배양하고 후속 원심분리기에서 8,000 x g에서 1분 동안 배양합니다.
참고: RNA를 -80°C에서 전기포이션까지 저장하고 열화를 피하기 위해 얼음에 RNA를 독점적으로 해동하십시오.
4. 세포 배양 유래 HEV (HEVcc) 생산을위한 HepG2 세포의 준비
도 3: 세포 배양 유래 HEV(HEVcc) 생산을 위한 HepG2 세포의 제조를 위한 회로도 실험 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
참고: 오염을 피하기 위해, 세포의 준비, 전기 기공, 감염, 수확 및 세포 고정은 생물 안전 수준 2 시설에서 멸균 조건하에서 수행되었다. 세포를 포함하는 37°C에서의 배양 단계는 5% CO2 인큐베이터에서 달성되었다.
- HEVcc 생산을 위한 HepG2 세포를 준비하려면(도3),15cm 콜라겐에 전체 덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM 참조)의 종자 세포(표 1,멸균 필터 PBS-아세트산 믹스를 통해 콜라겐을 첨가하기 전에 0.2 μm 메쉬)를 코팅배양접시에 넣습니다. 세포가 90% 컨할 때까지 37°C에서 배양합니다.
참고: 90% 컨물류 세포를 포함하는 각 15cm 접시는 최대 4개의 전기기전을 위한 충분한 세포를 생성합니다. - 접시에서 배지를 부드럽게 제거하고 1x PBS의 10mL로 한 번 세포를 씻으십시오. 세포가 완전히 분리될 때까지 세포에 0.05%의 트립신-EDTA의 3mL을 첨가하여 세포를 37°C에서 배양한다. 10mL DMEM에서 세포를 재중단하고 세포 현탁액을 50mL 튜브로 이송한다. 총 셀 수를 결정합니다.
- 각 전기기화는 5 x 106 세포를 필요로하기 때문에, 새로운 50 mL 튜브에 적절한 볼륨을 전송하고 1 배 PBS와 적어도 35 mL까지 채우기. 원심 분리기 세포는 200 x g에서 5 분 동안 조심스럽게 셀 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 폐기하십시오.
- 다시 한 번 35 mL의 1x PBS200 x g에서 5 분 동안 세포를 세척하고 1 x PBS를 제거하지 않고 세포를 서스펜션상태로 유지합니다.
5. HepG2 세포의 전기화
도 4: HepG2 세포의 전기화를 위한 회로도 실험 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- HepG2 세포의 전기포이팅을위해(도 4)는2mM ATP 및 5mM 글루타티온으로 384 μL의 사이토믹스(표 1참조)를 보충하여 전기포화당 완전한 400μL을 준비한다. 사용하기 직전에 신선한 준비와 얼음에 직접 놓습니다.
참고: 다음 단계를 정확하면서도 빠르게 실행하는 것이 중요합니다. 따라서 모든 것이 제대로 준비되었는지 확인하십시오. - 4.4 단계에서 세포 펠릿을 방해하지 않고 1x PBS를 조심스럽게 제거하십시오. Cytomix의 400 μL에 5 x 106 세포를 다시 중단하고 단계 3.2.2에서 5 μg RNA를 추가합니다. 용액을 4mm 큐벳으로 옮기고 975 μF, 270 V로 한 번 펄스로 전자포기 시스템을 사용할 수 있습니다.
- 전기기 분기 후 전분 당 완료 11 mL DMEM에 파스퇴르 파이펫으로 가능한 한 빨리 세포를 전송합니다.
참고: RNA가 HepG2 세포로 성공적으로 전염되는지 확인하기 위해, 트랜스포메이션 제어(TC)가 수행됩니다. 예상 경질 비율은 ORF2 양성 세포의 40-60% 사이에서 변화합니다.
- 전기기 분기 후 전분 당 완료 11 mL DMEM에 파스퇴르 파이펫으로 가능한 한 빨리 세포를 전송합니다.
- 10mL의 전기폴화 세포를 콜라겐으로 코팅한 10cm 배양 접시로 옮기다. 커버 슬립을 운반하는 콜라겐 코팅 24 마이크로티트 플레이트의 한 웰에 1.3 x105 전극전지(300 μL)를 추가합니다(나중에 는 트랜스퍼션 제어로 사용). 세포를 균등하게 분배하고 37 °C에서 배양합니다.
- 24시간 후, 10cm 접시의 매체를 변경하고 10mL 의 신선한 DMEM완료로 교체하십시오. 형질 전환 제어의 매체를 변경하지 마십시오. 37°C에서 6일 동안 추가로 배양합니다.
- 면역형 염색 프로토콜(Step 8)을 계속하여 세포 밀도에 따라 24개의 웰 플레이트 5-7d 후 전기포기에서 경질 제어를 중지합니다. 경질 효율은 총 세포 수로 정규화된 ORF2 양성 세포의 수를 계산하여 계산됩니다.
6. 세포 내 및 세포 외 HEVcc의 수확
그림 5: 세포 내 및 세포 외 HEVcc를 수확하기위한 회로도 실험 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 세포외 HEVcc(도 5)를수확하기 위해, 슈퍼나탄을 여과하고, 6일 후 10cm 접시로부터 얻은 (단계 5.3.1), 0.45 μm 메쉬를 통해 모든 세포 이물질을 제거한다. 같은 날 감염에 대 한 4°C에서 수확 된 세포 외 HEVcc를 저장, 그렇지 않으면 -80 °C에 저장.
- 세포내 HEVcc(도 5)를수확하려면, 1x PBS로 세포를 세척하고 0.05 % 트립신 -EDTA의 1.5 mL을 추가하여 트립시니화하십시오. 세포가 완전히 분리 될 때까지 37 °C에서 배양하십시오. DMEM 의 10 mL을 추가, 세포를 분리하고 50 mL 튜브로 세포 현탁액을 전송하기 위해 플러시 플레이트. PBS로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 원심 분리기 200 x g에서 5 분 동안.
- 상체를 버리고 전기화당 DMEM의 1.6mL에서 셀 펠릿을 다시 분리한다. 세포 현탁액을 2mL 반응 튜브로 이송합니다.
참고: 바이러스 부하를 크게 줄일 수 있으므로 더 큰 볼륨을 사용하지 마십시오. - 동결 (액체 질소) 및 해동 세포. 이 시퀀스를 3번 반복합니다.
참고: 용해 효율이 손상되기 때문에 3개의 동결 및 해동 사이클에 대해 하나 이상의 전기기공(1.6mL)을 풀지 마십시오. 주기 사이에 세포 현탁액을 소용돌이지 마십시오. 바이러스 부하를 최대화하기 위해 셀 서스펜션(예: 실온 또는 얼음)을 천천히 해동해야 합니다. - 고속 원심분리기는 10,000 x g에서 10분 동안 용액 세포를 분리하여 세포 이물질을 분리합니다. 새로운 튜브에서 상체를 전송합니다. 그렇지 않으면 -80 ° C에 저장, 감염에 대한 상체를 가져 가라.
- 선택적으로, (제조 업체의 프로토콜에 따라) 바이러스 부하를 증가시키기 위해 농축기를 사용하여 여분의 세포 내 HEVcc를 농축.
- 상체를 버리고 전기화당 DMEM의 1.6mL에서 셀 펠릿을 다시 분리한다. 세포 현탁액을 2mL 반응 튜브로 이송합니다.
7. 헤프G2/C3A 세포 내 및 세포 외 HEVcc 감염
그림 6: 내세포 및 세포 외 HEVcc를 가진 HepG2/C3A 세포의 감염을 위한 회로도 실험 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
참고: HepG2/C3A 세포의 감염은 전염되는 입자가 생성되었는지 확인한다. 추가적으로, 수확된 세포내 및 세포외 HEVcc의 적정은 FFU/mL에 있는 바이러스 티터를 계산하기 위하여 이용됩니다. 이것은 나중에 감염 통제 (IC)로 불립니다.
- HEVcc 감염(도 6)에대한 HepG2 / C3A 세포를 준비하려면 ( MEM) 완전 (표 1참조) ~ 37 °C.
- 종자 2 x 104 세포/잘 100 μL에 콜라겐 코팅 96 잘 마이크로티터 플레이트 하루 전에 6 단계 전에. 내부 60 우물 내부의 배지의 증발을 방지하기 위해 1x PBS로 가장 바깥쪽 우물을 채우십시오. 24 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.
- 전날 시드를 받은 HepG2/C3A 세포에 상체의 50 μL(단계 6.1)을 추가하여 세포 외 HEVcc에 감염하십시오. 50 μL을 다음 우물로 전송하여 위아래로 파이프를 넣고 6회 1:3으로 연속적으로 희석합니다. 기술 복제에 대해 중복된 직렬 희석을 수행합니다.
- 전날 시드를 받은 HepG2/C3A 세포에 25 μL 상퍼중(6.2.3단계)를 추가하여 세포내 HEVcc에 감염하십시오. 25 μL을 다음 우물로 전송하여 위아래로 파이프를 넣고 6회 1:5로 연속적으로 희석합니다. 기술 복제를 위해 중복 된 직렬 희석을 수행합니다.
- 37°C에서 7d 후 면역형광 염색 프로토콜(step 8)을 계속하여 감염을 중지한다.
8. 경질 및 감염 제어의 면역 형광 염색
그림 7: 경질 및 감염 제어의 면역 형광 염색을 위한 회로도 실험 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 면역형광염색(도 7)의경우, 1x PBS로 3배 세척하고 350 μL(transfection control [TC]) 또는 50 μL(감염 제어[IC])을 잘 분배하여 세포를 고정한다. RT에서 15분 동안 배양하고 1x PBS로 두 번 조심스럽게 씻습니다.
참고: HepG2/C3A 세포의 감염도 중지될 때까지 프로토콜은 여기서 일시 중지될 수 있습니다. 4 °C에 잘 접시를 보관하십시오. 또한 증발을 방지하기 위해 파라필름으로 밀봉하십시오. - RT에서 5분 동안 350 μL(TC) 또는 50 μL(IC)을 0.2% 트리톤 X-100(1× PBS)에 추가하여 세포를 페메아빌화한다. 그런 다음 1x PBS로 두 번 씻고 궤도 셰이커(30rpm)에서 RT에서 1시간 동안 5%의 말 세럼(1x PBS)의 50 μL(IC)으로 조심스럽게 세척합니다.
참고: 습한 조직을 내부에 배치하고 파라핀 필름 레이어를 위에 배치하여 습한 챔버를 만들어 작은 플라스틱 접시(30mm)를 준비합니다. 그런 다음 파라핀 필름을 향한 TC 커버 슬립을 전송합니다. TC에 대한 다음 단계는 습한 챔버에서 실행됩니다. - 70 μL(TC) 또는 25 μL(IC)의 1차 항체 항체 항ORF2 8282(HEV 특이적 토끼 하이퍼면역 혈청, 5% 말 세럼에 1:5,000)를 넣고 궤도 셰이커(30rpm)에 일정한 동요하에 4°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
- 1x PBS로 두 번 조심스럽게 세척하고 이차 항체 염소 안티 토끼 488 (5 % 말 혈청에서 1:1,000)의 70 μL (TC) 또는 25 μL (IC)을 추가하십시오. 어둠 속에서 궤도 셰이커 (30 rpm)에 일정한 동요에서 1 시간 동안 배양. 다시, 1x PBS로 두 번 조심스럽게 씻으십시오.
- DAPI의 70 μL(TC) 또는 25 μL(IC)을 추가하고(H2O의1:10,000)를 추가하고 1분 동안 배양하십시오.2 습한 챔버에서 커버 슬립을 꺼내고, 장착 시약의 6 μL이 있는 마운트 커버 슬립을 커버 슬라이드(TC용)에 거꾸로 장착하고 어두운 곳에서 RT에서 16시간 동안 시약을 건조하게 하십시오. 화상 진찰이 될 때까지 IC를 물에 보관하고 증발로 인한 건조를 피하기 위해 파라핀 필름으로 접시를 밀봉하십시오.
- 성공적인 트랜스페션 및 감염을 확인하기 위해 이미지를 가져 가라.
참고: 비교 결과 시판된 항 ORF2 1E6 항체57(5% 말 세럼에서 1:200) 및 이차 항체 당나귀 항마우스(5% 말 세럼에서 1:1,000)를 사용하여 얻을 수 있었습니다.
9. FFU 결정
참고: 1개의 FFU는 적어도 3개의 음성 세포에 의해 다른 FFU에서 분리된 하나 이상의 ORF2 양성 세포로 정의됩니다.
- 세포 외 HEVcc의 경우 두 개의 가장 낮은 희석제에서 두 개의 우물의 모든 ORF2 양성 포시를 계산하기 시작합니다. 총 4개의 우물을 계산해야 합니다. 밀리리터당 초점 형성 단위(FFU)는 다음 방정식으로 계산할 수 있습니다.
참고: 예상 티터는 102에서 5 x 104 FFU/mL 사이 다릅니다. - 세포 내 HEVcc의 경우 50~100개의 포시가 관찰되는 우물에서 모든 ORF2 양성 포시를 계산하기 시작합니다. 또한 다음 더 높은 희석에서 두 개의 우물을 계산합니다. 총 4개의 우물을 계산해야 합니다. 밀리리터당 초점 형성 단위(FFU)는 다음 방정식으로 계산할 수 있습니다.
참고: 예상 티터는 105에서 3 x 106 FFU/mL 사이 다릅니다. 요인 20x 및 40x는 50 μL 당 FFU 의 수를 추정하는 데 사용되며 25 μL에서 1mL로 이에 따라 조정할 수 있습니다.
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Representative Results
이 프로토콜에서, 우리는 높은 티터 전염성 HEVcc의 생산을 설명합니다. 첫 번째 단계는 플라스미드 DNA(pBluescript_SK_HEVp654 및 pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, 도 8a)를분리하는 것으로, 그 후 제한 소화에 의해 선형화되고 체외 전사용 정제(도1)이다. 성공적인 선형화는 젤 전기포고를 사용하여 소화되지 않은 플라스미드-DNA와 비소화 플라스미드 DNA를 비교하여 검증될 수 있다. 크기 시프트 외에도 선형 형태를 나타내는 하나의 DNA 밴드만 표시되어야 합니다. 선형화는 각각 닉 원과 초응 형태를 나타내는 선형 형태 위와 아래에 있는 두 개의 다른 밴드가 완전히 감소될 때 완료됩니다(그림8b). 정제된 DNA의 수율은 150 ng/μL을 초과해야 합니다. 이러한 특성이 참을 보유하는 경우에만 선형화된 DNA는 시험관 내 전사에 사용되어야 합니다. 시험관 내 전사 RNA는 겔 전기 전광을 사용하여 잘 검사되어야하며 낮은 RNase 분더시의 경우 흐린 얼룩(도 8c)보다는뚜렷한 밴드를 보여줘야합니다. 부가적으로, 정제된 RNA 수율은 500 ng/μL을 초과해야 시험외 전사RNA(도 2)는결국 바이러스 생산을 위한 HepG2 세포로 전기화된다(도3 및 도 4). 성공적인 전기기화는 경질제어(도 9a)의면역형광 염색에 의해 모니터링된다. 경질 효율은 40%(그림9b)를초과해야 한다. 복제 결핍 돌연변이는 ORF2 염색의 특이성을 보장하기 위해 음의 제어 역할을 하며, ORF2 발현이 예상되지 않는(도 9c). 7일간의 배양 후, 헤브cc는 세포 배양 상류체를 수집하고 여과함으로써 수확된다. 비 봉투 (세포 내) HEVcc는 여러 동결 및 해동 사이클에 의해 세포에서 방출된다. 세포 이물질을 제거하기 위해 세포 리세이트시고 고속으로 원심분리된다(도5). 이어서, 두 HEVcc 종모두 직렬 희석에 의해 HepG2/C3A 세포를 감염시키기 위해 활용된다(도6 및 도 9d). 위의 방정식에 따르면 (단계 9 참조) 바이러스 성 티터는 FFU 계산에 의해 결정된다.
대표 결과는 그림 9에표시됩니다. 상기 경질 조절은 생산되는 바이러스의 효율적인 양을 보장하기 위해 약 50% ORF2 양성 세포를 포함해야한다(도 9a,b). 덜 ORF2 양성 세포는 더 낮은 티터가 될 것입니다. 프로토콜에 언급된 단계를 정확하게 따라비봉투(세포내) HEVcc에 대해105 및 3 x 106 FFU/mL 사이에 다른 티터를 생성합니다. 102 x104 FFU/mL 사이의 봉투(세포외) HEVcc 티터가예상된다(그림 9e). 또한 G1634R 돌연변이에 대해 높은 FFU 수가 관찰되었습니다. 게놈 사본과 전염성 바이러스 입자 사이의 비율을 계산할 때 p6_WT 및 p6_G1634R 모두 생산된 세포내 HEVcc는 세포외 HEVcc에 비해 더 낮은 것으로 나타났으며, 비봉투 HEV종(그림 9f)의더 높은 특이적 감염성을 시사한다.
그림 8: 시험관 내 전사 RNA의 생성.
(a)분리된 플라스미드-DNA의 흡광도 스펙트럼의 예. (B)비소화 및 소화 플라스미드-DNA의 겔 전기전도. (C)체외 전사 RNA의 겔 전기전경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 하이 티터 HEVcc 생산의 대표적인 결과.
(A)전소 된 HepG2 세포의 배설 제어. 감염된 세포는 항 ORF2 항체(녹색, LS-바이오) 및 DAPI(파란색)로 염색하였다. (b)경질 효율은 전체 세포의 수로 정규화된 ORF2 양성 세포의 수에 의해 계산되었다. (C)복제 결핍 돌연변이체는 ORF2 특이성을 보장하기 위해 면역 형광 염색에 대한 부정적인 제어 역할을한다. (D)생산된 바이러스 주식의 FFU 결단 연쇄 희석을 위해 수행하였다. ORF2 양성 세포는 백색으로 묘사됩니다. (E)바이러스 성 티터는 FFU 계수에 의해 계산되었고(F)바이러스 적 하중은 qPCR에 의해 결정되고 FFU / mL로 정규화되었다. 막대는 각각 38 및 10개의 독립적인 실험의 평균 및 표준 편차를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 작업 솔루션 | 농도 | 볼륨 |
| 콜라겐 | 40mL | Pbs |
| 40 μl | 아세트산 | |
| 1 mL | 콜라겐 R 용액 0.4% 멸균 | |
| 사이토믹스 | 120mm | KCl |
| 0.15 mM | CaCl2 | |
| 10mM | K2HPO4 (pH 7.4) | |
| 25 mM | 헤페스 | |
| 2 mM | EGTA | |
| DMEM 완료 | 500 mL | DMEM |
| 5 mL | 펜/스트렙 | |
| 5 mL | MEM NEAA (100X) | |
| 5 mL | L-글루타민 | |
| 50mL | 태아 소 혈청 | |
| MEM 완료 | 500 mL | Mem |
| 5 mL | 피루바트 나트륨 | |
| 5 mL | 겐타마이신 | |
| 5 mL | MEM NEAA (100X) | |
| 5 mL | L-글루타민 | |
| 50mL | 초저IgG |
표 1: 버퍼 컴포지션 테이블입니다.
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Discussion
플라스미드 제제를 시작으로, DNA 수율은 150 ng/μL을 초과하여 동일한 플라스미드 스톡에서 다중 선형화를 수행할 수 있어야 하며, 이는 중요한 게놈 서열의 박테리아 유발 돌연변이 발생 위험을 최소화합니다. 더욱이, 겔 전기포에 의한 완전한 플라스미드 선형화에 대한 제한 다이제스트를 확인하는 것이중요하다(도 8b). 선형화된 플라스미드 DNA의 부족은 생체 외 전사가 덜 효율적이도록 하는 롤링 원 증폭을 유도할 것입니다. 또한, RNA 무결성은 샘플 내의 RNases의 풍부성을 평가하기 위해 확인되어야한다(도 8c). 그런 다음에야 표적 세포의 전기화를 고려해야 합니다. 참고, HepG2 세포의 준비로 시작 하기 전에, 모든 손에 잘 준비 된 긴 대기 기간을 피하기. 특히, 전기화까지 세포와 RNA의 짧은 저장을 보장한다. 전기 기공 하는 동안 세포의 가열을 우회 하는 것은 사전에 얼음에 버퍼를 냉각 하는 것이 필수적이다. 펄스의 지속 시간은 20-25 ms 및 270 V를 초과해서는 안됩니다. 전기기 화 후 세포는 세포 생존가능성을 보장하기 위해 신선한 배지로 빠른 전달이 필요합니다. 표적 세포의 감염 전에 TC는 ORF2 양성 세포의 백분율을 확인해야 합니다. TC가 ORF2 양성 세포를 보여주지 않는 경우 전기기화가 실패했거나 염색이 작동하지 않았을 가능성이 높으며 실험을 반복해야 합니다.
셀룰러 내 HEVcc를 수확 할 때 특별한주의는 동결 및 해동 사이클의 속도로 지불해야한다. 바이러스 성 티터는 -80 °C보다는 액체 질소에서 동결을 실행하여 증가 될 수있다. 반대로, 해동은 세포 현탁액이 완전히 청산될 때까지 얼음에 보관을 제안하는 가장 느린 방법을 마련해야 한다. 그럼에도 불구하고, 실온에서 세포 현탁액을 해동할 수도 있으며, 37°C 인큐베이터 또는 수조에서, 그러나 해동이 더 빨리 실행될수록 더 많은 티터가 감소하게 된다.
다음 실험에 따라 바이러스 성 조의 극적인 손실없이 MEM 완료 또는 1 x PBS에서 동결 및 해동 주기를 할 수도 있지만, 세포 외 HEVcc가 세포 내 HEVcc와 다른 매체에 있다는 것을 명심해야합니다.
프로토콜의 이러한 중요한 단계에 따라 예상 된 티터는 비 봉투 (세포 내) HEVcc에 대한 105 및 3 x 106 FFU / mL 사이다릅니다. 102 x 104 FFU/mL 사이의 봉투(세포외) HEVcc 티터가대기(그림 9e)에대해 기다리고 있다. 지금까지 HEV 세포 배양 시스템을 사용하는 연구는 qPCR에 의해 주로 바이러스 복제 및 전파를 모니터링합니다. RNA 게놈 사본의 평가는 아직 전염성 입자의 조립 및 방출에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다.
이전 연구58 성공적으로 전파 된 환자는 103 TCID50 / mL의 최대 적티터로 세포 배양에서 격리됩니다. 최근에 나타난 바와 같이, 세포 배양에서 HEVcc를 성공적으로 통과시키고 47832c 및 83-2와 같은 다른 균주에 대한 프로토콜을 조정하여 초변영역(56)에삽입할 수 없다. 또한, 환자 유래 서열이 Bluescript 벡터 백본으로 복제될 수 있는지 여부와 여전히 높은 바이러스 성 티터를 산출하는 것은 테스트되지 않았다. 도입된 방법을 통해, 비봉투뿐만 아니라 둘러싸인 바이러스 성 입자를 수확하고 A549, Huh7.5, Jeg-3 및 1 차 인간 및 돼지 간세포와 같은 다양한 순진한 세포주를 접종하는 데 사용될 수 있으며, HEV 트로피즘, 경로 유전자 및 많은 약물 개발, 항성 및 약물 개발, 항성 및 약물 개발, 항성 및 약물 개발과 같은 향후 응용 분야에 대한 이점을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 E형 간염 바이러스 p6 클론에 대한 수잔 에머슨에 감사드립니다. HEV 특이토끼 하이퍼면역 혈청은 독일 프리드리히 로플러 연구소인 라이너 울리히(Rainer Ulrich)가 친절하게 제공했습니다. 또한, 우리는 그들의 지원과 토론에 대한 루르 대학 보훔에서 분자 및 의학 바이러스학과의 모든 구성원에게 감사드립니다. 도 1-7은 BioRender.com 생성되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm mesh | Sarstedt | 83.1826 | Harvest extracellular Virus |
| 4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | Immunofluorescence |
| Acetic acid | CarlRoth | 6755.1 | Collagen working solution |
| Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | Virus harvesting |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | Selection of transformed bacteria |
| ATP | Roche | 11140965001 | in vitro transcription and electroporation |
| BioRender | BioRender | Figure Generation | |
| CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
| Collagen R solution 0.4 % sterile | Serva | 47256.01 | Collagen working solution |
| CTP | Roche | 11140922001 | in vitro transcription |
| Cuvette | Biorad | 165-2088 | Electroporation |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | Immunofluorescence |
| DMEM | gibco | 41965-039 | Cell culture |
| DNAse | Promega | M6101 | in vitro transcription |
| DTT | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
| Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformation |
| Fetal bovine serum | gibco | 10270106 | Cell culture |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Immunofluorescence |
| GenePulser Xcell Electroporation System | BioRad | 1652660 | Electroporation |
| Gentamycin | gibco | 15710049 | Cell culture |
| GTP | Roche | 11140957001 | in vitro transcription |
| H2O | Braun | 184238001 | Immunofluorescence |
| Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
| Horse serum | gibco | 16050122 | Immunofluorescence |
| K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
| KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
| L-Glutamin | gibco | 25030081 | Cell culture |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
| MEM | gibco | 31095-029 | Cell culture |
| MEM NEAA (100×) | gibco | 11140-035 | Cell culture |
| MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
| Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA concentration |
| MluI enzyme | NEB | R0198L | Linearization |
| NEB buffer | NEB | included in R0198L | Linearization |
| NucleoSpin Plasmid kit | Macherey & Nagel | 740588.250 | Plasmid preparation |
| NucleoSpin RNA Clean-up Kit | Macherey & Nagel | 740948.250 | RNA purification |
| PBS | gibco | 70011051 | Cell culture |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Cell culture |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) | Todt et.al | Virus production | |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) | Shukla et al. | GenBank accession no. JQ679013 | Virus production |
| Primary antibody 1E6 | LS-Bio | C67675 | Immunofluorescence |
| Primary antibody 8282 | Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | DNA extraction |
| Ribo m7G Cap Analog | Promega | P1711 | in vitro transcription |
| RNase away | CarlRoth | A998.3 | RNA purification |
| RNasin (RNase inhibitor) | Promega | N2515 | in vitro transcription |
| Secondary antibody donkey anti-mouse 488 | Thermo Fisher | A-21202 | Immunofluorescence |
| Secondary antibody goat anti-rabbit 488 | Thermo Fisher | A-11008 | Immunofluorescence |
| Sodium Pyruvat | gibco | 11360070 | Cell culture |
| T7 RNA polymerase | Promega | P2077 | in vitro transcription |
| Transcription Buffer | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| Triton X-100 | CarlRoth | 3051.3 | Immunofluorescence |
| Trypsin-EDTA (0.5 %) | gibco | 15400054 | Cell culture |
| ultra-low IgG | gibco | 1921005PJ | Cell culture |
| UTP | Roche | 11140949001 | in vitro transcription |
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