Summary
Beskrevet her er en effektiv metode for hvordan å produsere høy viral titer bestander av hepatitt E virus (HEV) å effektivt infisere hepatoma celler. Med den presenterte metoden kan både ikke-innkapslede, samt innhyllede viruspartikler høstes og brukes til å inokulere ulike cellelinjer.
Abstract
Hepatitt E-virus er den viktigste årsaken til levercirrhose og leversvikt med økende prevalens over hele verden. Enkelttrådet RNA-virus overføres hovedsakelig av blodoverføringer, utilstrekkelige sanitære forhold og forurensede matvarer. Til dags dato er off-label stoffet ribavirin (RBV) behandling av valget for mange pasienter. Likevel gjenstår en spesifikk HEV-behandling å bli identifisert. Så langt har kunnskapen om HEV livssyklus og patogenese blitt sterkt hemmet på grunn av mangel på et effektivt HEV cellekultursystem. Et robust cellekultursystem er avgjørende for studiet av den virale livssyklusen som også inkluderer viral patogenese. Med metoden beskrevet her kan man produsere virale titers på opptil 3 x 106 fokusformingsenhet / ml (FFU / ml) av ikke-innkapslede HEV og opptil 5 x 104 FFU / ml innhyllet HEV. Ved hjelp av disse partiklene er det mulig å infisere en rekke celler av forskjellig opprinnelse, inkludert primærceller og menneskelige, samt dyrecellelinjer. Produksjonen av smittsomme HEV-partikler fra plasmider utgjør en uendelig kilde, noe som gjør denne protokollen svært effektiv.
Introduction
Hepatitt E er en ganske undervurdert sykdom med økende prevalens over hele verden. Om lag 20 millioner infeksjoner resulterer i mer enn 70.000 dødsfall per år1. Det underliggende middelet, Hepatitt E-viruset (HEV), ble nylig omplassert og er nå klassifisert i familien Hepeviridae, inkludert slektene Orthohepevirus og Piscihepevirus. HEV av forskjellig opprinnelse er klassifisert i arten Orthohepevirus A-D inkludert isolater fra mennesker, svin, kaniner, rotter, fugler og andre pattedyr2. I dag har åtte forskjellige genotyper (GT) av det positivorienterte, entrådete RNA-viruset blitt identifisert2. Selv om de varierer i sin sekvensidentitet, overføringsveier og geografisk fordeling, er deres genomiske struktur svært bevart. Mer spesifikt er 7,2 kbp HEV-genomet delt inn i 3 store åpne leserammer (ORF1-3). Mens ORF1 koder alle enzymer som trengs for en vellykket replikering i vertscellen, koder ORF2 capsid-proteinet, og ORF3-proteinet fungerer som en funksjonell iionkanal som kreves for montering og frigjøring av smittsomme partikler3. Når slippes ut i basal eller apical lumen HEV finnes i begge, quasienveloped og ikke-innhyllet / nakne arter avhengig av om viruset stammer fra blod eller avføring, henholdsvis4,5.
Mens GT1 og GT2 hovedsakelig finnes i utviklingsland utelukkende infisere mennesker6 via fekal-muntlig rute, GT3, GT4 og GT7 hovedsakelig forekommer i utviklede land1,,7 med en rekke arter som fungerer som reservoarer, F.eks. svin 8 , rotte9, kylling10,11, hjort12, mongoose13, bat14, kanin15,16, villsvin17 og mange flere7,18,19, gir bevis på zoonosis7,20,21,22.8 I tillegg til utilstrekkelige sanitære forhold23 og forurensede matvarer12,24,25,26, overføring via blodoverføring og organtransplantasjoner er også mulig27,28. HEV er en vanlig årsak til levercirrhose og leversvikt29 spesielt hos pasienter med eksisterende leversykdom, immunkompromitterte individer (genotype 3, 4 og 7) og gravide kvinner (genotype 1). Det er også ekstrahepatiske manifestasjoner som hematopoietisk sykdom30,31,32, nevrologiske lidelser33 og nyreskade34.
Til dags dato er det off-label stoffet ribavirin (RBV) behandling av valget for mange smittede pasienter35,36. Det er imidlertid rapportert tilfeller av behandlingssvikt og dårlige kliniske langsiktige resultater. Behandlingssvikt har vært knyttet til viral mutagenese og økt viral heterogenitet hos kronisk infiserte pasienter37,,38,,39. Tvert imot, en nylig europeisk retrospektiv multisenter studie var ikke i stand til å korrelere polymerase mutasjoner til RBV behandlingssvikt40. I kliniske observasjoner og in vitro eksperimenter, interferon41,42,43, sofosbuvir44,45, sink salter46 og silvestrol47,48 har også vist antivirale effekter. Likevel gjenstår en bestemt HEV-behandling å bli funnet, hemmet av mangel på kunnskap om HEV livssyklusen og dens patogenese. Derfor er et robust cellekultursystem for virologiske studier og utvikling av nye antivirale legemidler raskt nødvendig49.
Dessverre, som andre hepatittvirus, er HEV vanskelig å forplante seg i konvensjonelle cellelinjer og utvikler seg vanligvis veldig sakte fører til lave virusbelastninger. Likevel, noen grupper var i stand til å øke virusbelastninger ved generering av celle linje subclones50 eller justering av media kosttilskudd51. Nylig generering av cDNA kloner52 og tilpasning av primære pasient isolater ved passering53,54 ytterligere forbedret HEV forplantning i cellekultur55. I denne protokollen brukte vi genomet til en cellekultur tilpasset Kernow-C1-stamme (referert til som p6_WT)54 og en mutant stamme som huser en replikeringsfremmende mutasjon (referert til som p6_G1634R)37. Kernow-C1 er den mest brukte belastningen i HEV cellekultur og er i stand til å produsere høy viral belastning. Ved å vurdere virale RNA-kopinumre kan HEV-replikering overvåkes in vitro. Likevel tillater disse teknikkene ikke vurdering av antall smittsomme partikler som produseres. Derfor har vi etablert en immunofluorescensfarging for å bestemme Focus Forming Units (FFU/ml).
Her beskrevne metode56 kan brukes til å produsere smittsomme viruspartikler i full lengde som er i stand til å infisere en rekke celletyper fra ulike opprinnelser, inkludert primærceller og pattedyrcellelinjer. Dette er en grunnleggende forutsetning for å tyde viktige aspekter ved HEV-infeksjon og tropisme. Det er ikke behov for inokulasjon med vanligvis begrensede pasientisolater. Produksjonen av smittsomme HEV-partikler fra plasmider utgjør en uendelig kilde, noe som gjør denne protokollen sammenlignbar effektiv. I tillegg kan dette systemet brukes til omvendt genetikk slik at studiet av in vivo identifisert genom endring og deres innvirkning på HEV replikering og fitness. Denne teknikken overvinner mange begrensninger, og kan bane vei for narkotikautvikling, mutagenese studier og evaluering av virus-vert interaksjoner som begrensning eller oppføring faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle eksperimenter utføres under BSL-2 tilstand. Alle materialer som kommer i kontakt med hepatitt E virus RNA eller smittsomme virus må skylle riktig med 4% Kohrsolin FF fra en avfallsbeholder inne i panseret før avhending.
1. Plasmid forberedelse
- Inokulere 200 ml LB medium som inneholder 100 μg/ml ampicillin med forvandlet Escherichia coli JM109 som inneholder en plasmidkoding for hev gt3 Kernow-C1p6-sekvensen i full lengde (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54 eller pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37). Inkuber i 16 timer ved 37 °C under permanent agitasjon (170 o/min).
MERK: Plasmid isolasjon ble utført ved hjelp av et plasmid ekstraksjonssett (se Tabell over materialer). - Etter produksjonsprotokollen, spinn ned 200 ml over natten kultur på 6000 x g og 4 ° C for 10 min og kast supernatant. Bakteriepellet kan fryses og lagres ved -20 °C.
- Resuspend bakteriell pellet i 4 ml Resuspension buffer ved pipettering opp og ned med en 10 ml serologisk pipette og en pipette mann. I tillegg vortex grundig.
- Tilsett 4 ml forvarmt Lysis-buffer (30-40 °C). Vend forsiktig i flere ganger og inkuber ved romtemperatur (RT) i 5 min.
- Legg til 4,8 ml nøytraliseringsbuffer, vend forsiktig og kontroller at lysatet er kvantitativt nøytralisert (se produsentens beskrivelse). Deretter sentrifuger ved 11.000 x g og 4 °C i 20 min.
- Plasser en 2 cm x 2 cm mull stykke inne i en 1 ml ikke-filterspiss, last resuspended, lysed og nøytralisert supernatant i 10 ml serologisk pipette, tilsett 1 ml tupp med mull for å tippe den serologiske pipetten og filtrer supernatanten i et nytt 50 ml rør.
MERK: Supernatant kan oppbevares ved 4 °C i opptil 30 minutter om nødvendig. - I flere trinn gjelder 750 μL av den filtrerte supernatanten på totalt 4 filterkolonner (angitt i settet) og sentrifuge på 11 000 x g i 30 s. Kast gjennomstrømningen og gjenta denne sekvensen til alle supernatant brukes på filterkolonnene.
- Vask hver filterkolonne to ganger med 500 μL forvart (50 °C) vaskebuffer AW ved 11 000 x g i 30 s og kast gjennomstrømningen etterpå.
- Vask hver filterkolonne med 600 μL vaskebuffer A4 ved sentrifugering ved 11 000 x g i 30 s. Kast gjennomstrømningen og tørk filterkolonnene ved sentrifugering ved 11 000 x g i 2 min.
- Elute plasmid DNA fra hver filterkolonne ved å overføre 60 μL elution buffer til midten av filterkolonnene. Inkuber i 1 min ved RT og sentrifuge ved 11.000 x g i 1 min.
- Kombiner eluater og mål konsentrasjonen av det ekstraherte plasmid-DNA ved hjelp av et spektrofotometer.
2. Linearisering og DNA rensing
Figur 1: Skjematisk eksperimentelt oppsett for plasmid linearisering og DNA-rensing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
MERK: Lineariseringen øker RNA-utbyttet under in vitro-transkripsjon (trinn 3)
- To linearize the plasmid DNA (Figure 1) mix 10 μg of the template DNA (extracted in step 1), 10 μL of the buffer, 2 μL of MluI and adjust to a volume of 100 μL with H2O.
- Inkuber i 1 time ved 37 °C og bekreft linearisering av plasmid ved agarose gelelektroforese (f.eks. last ikke-fordøyd og fordøyd plasmid DNA [1 μL DNA hver] på en 1% agarose gel og kjøre elektroforese ved 120 V konstant strøm).
- Etter produsentens protokoll for DNA-ekstraksjon (se tabell over materialer, figur 1), bland 500 μL bindingsbuffer, angitt i settet, med 100 μL linearisert DNA. Bruk prøven på en filterkolonne, og sentrifuger ved 17 800 x g i 30 s. Kast gjennomstrømningen og plasser filterkolonnene tilbake i samme rør.
- Vask filterkolonnen ved å legge til 650 μL vaskebuffer og sentrifugering ved 17 800 x g i 30 s. Kast gjennomstrømningen og plasser filterkolonnen tilbake i samme rør. For å fjerne restvaskbufferen, må du tørke sentrifuge ved 17 800 x g i 60 s og plasser hver filterkolonne i et rent mikrosybisk mikrosybningsrør på 1,5 ml etterpå.
- Elute DNA ved å overføre 60 μL prewarmed H2O (PCR klasse, 70 °C) til midten av filteret. Inkuber i 1 min ved 70 °C og sentrifuger ved 18 000 x g i 1 min. Mål konsentrasjonen av renset DNA ved hjelp av et spektrofotometer.
MERK: Oppbevar DNA ved -20 °C til in vitro-transkripsjon.
3. In-vitro transkripsjon av full lengde HEV genotype 3 p6 DNA og RNA rensing
Figur 2: Skjematisk eksperimentell oppsett for in vitro transkripsjon og RNA rensing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
MERK: In vitro transkripsjon er nødvendig for å produsere viral genomisk RNA fra plasmid DNA.
- For in vitro transkripsjonsblanding 20 μL av 5x T7 transkripsjonsbuffer, 10 mM DTT, 100 E ribonucleasehemmer, 25 mM ATP, CTP og UTP, 12,5 mM GTP, 5 mM Ribo m7G Cap Analog, 2 μg linearisert DNA-mal og 80 U av T7 RNAMER. Fyll opptil 100 μL med nukleasefri H2O, bland godt og inkuber i 2 timer ved 37 °C.
MERK: Korttidslagring ved -20 °C er mulig etter trinn 3.1 til 3.1.2.- Tilsett 2 μL T7 RNA polymerase, bland godt og inkuber i ytterligere 2 timer ved 37 °C.
- For å fordøye den første DNA-malen, tilsett 7,5 μL DNase (RNase-fri, 1 U/μL), bland godt og inkuber ved 30 min ved 37 °C.
MERK: Rengjør alle overflater og pipetter med overflatedekontaminant for RNase når du arbeider med RNA for å unngå forringelse. Sørg også for at alle reaksjonsrør er RNase-frie og sterile. Bruk kun tips med filtre og fortynn utelukkende med RNase-fritt og sterilt vann.
- Etter produksjonens protokoll for RNA-ekstraksjon (se Tabell over materialer, figur 2), utarbeide en premiks av Lysis buffer og 100% etanol ved å blande 330 μL lysis buffer og 330 μL av 100% etanol for hver in-vitro transkripsjonreaksjon. Tilsett 660 μL lysis buffer-etanol premix til 110 μL RNA og vortex. Legg prøven på en filterkolonne og sentrifuge på 8000 x g i 30 s. Kast gjennomstrømningen og plasser filterkolonnen tilbake i samme rør.
- Tilsett 600 μL vaskebuffer og sentrifuger ved 8000 x g i 30 s. Kast gjennomstrømnings- og plasser filterkolonnen tilbake i samme rør. Tilsett 350 μL vaskebuffer og sentrifuge ved 8000 x g i 2 min for å fjerne restvaskbufferen. Plasser hver filterkolonne i et rent 1,5 ml mikroscerenderifugerør. Åpne lokket på filterkolonnen og la kolonnen tørke i 3 min.
- Elute RNA ved å plassere 50 μL RNase gratis H2O i midten av filterkolonnen. Inkuber i 1 min ved RT og deretter sentrifuger ved 8000 x g i 1 min. Kontroller RNA-integriteten ved å laste 1 μL RNA på en agarosegel og måle konsentrasjonen av ekstrahert RNA ved hjelp av et spektrofotometer.
MERK: Oppbevar RNA ved -80 °C til elektroporasjon og tin RNA utelukkende på is for å unngå forringelse.
4. Utarbeidelse av HepG2-celler for cellekultur avledet HEV (HEVcc) produksjon
Figur 3: Skjematisk eksperimentelt oppsett for utarbeidelse av HepG2-celler for cellekultur avledet HEV (HEVcc) produksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
MERK: For å unngå kontaminering ble fremstilling av celler, elektroporasjon, infeksjon, høsting og cellefiksering utført under sterile forhold i et biosikkerhetsnivå 2-anlegg. Inkubasjonstrinn ved 37 °C som involverer celler ble2 utført i en 5 % CO 2-inkubator.
- For å forberede HepG2-celler for HEVcc-produksjon (figur 3), frøceller i komplett Dulbeccos Modifiserte Eagle Medium (DMEM) (se tabell 1) på en 15 cm kollagen (se tabell 1, sterilt filter PBS- eddiksyre blandes gjennom 0,2 μm mesh før du legger til kollagen) belagt kulturrett. Inkuber ved 37 °C til cellene er 90 % sammenføyning.
MERK: Hver 15 cm fatning som inneholder 90% sammenføyningsceller vil generere nok celler til opptil 4 elektroporasjon. - Fjern forsiktig mediet fra platen og vask cellene én gang med 10 ml 1x PBS. Trypsinisere celler ved å legge til 3 ml 0,05% trypsin-EDTA på cellene og inkubere ved 37 °C til cellene løsner helt. Resuspendceller i 10 ml DMEM komplett medium og overføre cellefjæringen til et 50 ml rør. Bestem totalt antall celler.
- Siden hver elektroporasjon krever 5 x 106 celler, overføre riktig volum i et nytt 50 ml rør og fyll opp til minst 35 ml med 1x PBS. Sentrifugeceller ved 200 x g i 5 min og kast forsiktig supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
- Vask cellene igjen med 35 ml 1x PBS ved 200 x g i 5 min. Plasser celler på is og ikke fjern 1x PBS ennå, for å holde cellene i suspensjon.
5. Elektroporasjon av HepG2-celler
Figur 4: Skjematisk eksperimentelt oppsett for elektroporasjon av HepG2-celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- For elektroporasjon av HepG2-celler (figur 4) forberede 400 μL cytomix komplett per elektroporering ved å supplere 384 μL cytomix (se tabell 1) med 2 mM ATP og 5 mM glutation. Forbered deg frisk rett før bruk og plasser direkte på isen.
MERK: En riktig, men rask utførelse av følgende trinn er avgjørende. Derfor må du sørge for at alt er forberedt riktig. - Fjern forsiktig 1x PBS uten å forstyrre cellepelleten fra trinn 4.4. Resuspend 5 x 106 celler i 400 μL cytomix fullført og tilsett 5 μg RNA fra trinn 3.2.2. Overfør oppløsningen til en 4 mm cuvette og puls én gang med 975 μF, 270 V for 20 ms med et elektroporasjonssystem.
- Etter elektroporasjon overføre celler så raskt som mulig med en Pasteur pipette i 11 ml DMEM komplett per elektroporering.
MERK: For å sikre at RNA er transfected til HepG2-celler, vil en transfeksjonskontroll (TC) bli utført. Forventede transfeksjonsrater varierer mellom 40-60 % av ORF2-positive celler.
- Etter elektroporasjon overføre celler så raskt som mulig med en Pasteur pipette i 11 ml DMEM komplett per elektroporering.
- Overfør 10 ml elektroporerte celler til en 10 cm kulturrett belagt med kollagen. Tilsett 1,3 x 105 elektroprorated celler (300 μL) i en brønn av en kollagen-belagt 24-mikrotitre plate bærer en deksel slip (senere brukt som en transfection kontroll). Fordel celler jevnt og inkuber ved 37 °C.
- Etter 24 timer, bytt mellommediet på 10 cm fatet og erstatt med 10 ml frisk DMEM fullført. Ikke endre mediet for transfeksjonskontrollen. Inkuber i ytterligere 6 dager ved 37 °C.
- Stopp transfeksjonskontrollen i 24 brønnplate 5-7 d etter elektroporasjon avhengig av celletettheten ved å fortsette med immunfluorescensfargingsprotokollen (trinn 8). Transfection effektivitet beregnes ved å telle antall ORF2 positive celler normalisert til totalt antall celler.
6. Høsting av intra- og ekstracellulær HEVcc
Figur 5: Skjematisk eksperimentelt oppsett for høsting intra- og ekstracellulær HEVcc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- For å høste ekstracellulær HEVcc (Figur 5), filtrer supernatanten, hentet fra 10 cm parabolen etter 6 dager (trinn 5.3.1), gjennom et 0,45 μm nett for å fjerne eventuelle celleavfall. Oppbevares ekstracellulær HEVcc ved 4 °C for samme dags infeksjon, ellers oppbevares ved -80 °C.
- For å høste intracellulær HEVcc (Figur 5), vask cellene med 1x PBS og trypsinize ved å legge til 1,5 ml 0,05% trypsin-EDTA. Inkuber ved 37 °C til cellene løsner helt. Tilsett 10 ml DMEM komplett, spyleplate for å løsne celler og overføre celler suspensjon i 50 ml rør. Vask cellene to ganger med PBS. Sentrifuge ved 200 x g i 5 min.
- Kast den supernatant og resuspend cellepellet i 1,6 ml DMEM komplett per elektroporering. Overfør cellefjæringen til et 2 ml reaksjonsrør.
MERK: Ikke bruk større volumer, da det vil redusere virusbelastningen dramatisk. - Frys (i flytende nitrogen) og tine celler. Gjenta denne sekvensen 3 ganger.
MERK: Ikke samle mer enn én elektroporasjon (1,6 ml) for de 3 fryse- og tinesyklusene, da lysiseffektiviteten ville bli svekket. Ikke virvle cellesuspensjonen mellom syklusene. Sørg for å tine cellesuspensjon sakte (f.eks. romtemperatur eller is) for å maksimere virusbelastningen. - Høyhastighets sentrifuger de lysede cellene i 10 min ved 10.000 x g for å skille celleavfall. Overfør supernatanten i et nytt rør. Ta supernatanten mot infeksjon, ellers oppbevarer du ved -80 °C.
- Du kan eventuelt konsentrere den ekstra- og intracellulære HEVcc ved hjelp av en konsentrator for å øke virusbelastningen (i henhold til produsentens protokoll).
- Kast den supernatant og resuspend cellepellet i 1,6 ml DMEM komplett per elektroporering. Overfør cellefjæringen til et 2 ml reaksjonsrør.
7. Infeksjon av HepG2/C3A-celler med intra- og ekstracellulær HEVcc
Figur 6: Skjematisk eksperimentelt oppsett for infeksjon av HepG2/C3A-celler med intra- og ekstracellulær HEVcc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
MERK: Infeksjonen av HepG2/C3A-celler skal sikre at smittsomme partikler ble produsert. I tillegg brukes titrering av høstet intracellulær og ekstracellulær HEVcc til å beregne virustuppene i FFU/ml. Dette vil senere bli referert til som infeksjonskontroll (IC).
- For å klargjøre HepG2/C3A-celler for HEVcc-infeksjon (figur 6), er prewarm Minimal Essential Medium (MEM) fullført (se tabell 1) til 37 °C.
- Frø 2 x 104 celler/ brønn i 100 μL på kollagen belagt 96 godt mikrotiter plate en dag før trinn 6. Sørg for å fylle de ytterste brønnene med 1x PBS for å forhindre fordampning av mediet inne i de indre 60 brønnene. Inkuber ved 37 °C i 24 timer.
- Infisere med ekstracellulær HEVcc ved å legge til 50 μL av supernatanten (fra trinn 6.1) til HepG2/C3A-cellene sådd dagen før. Bland godt ved å pipe opp og ned og serialt fortynne seks ganger 1:3 ved å overføre 50 μL til neste brønn. Utfør duplikater av seriell fortynning for tekniske replikasjoner.
- Infisere med intracellulær HEVcc ved å legge til 25 μL supernatant (fra trinn 6.2.3) til HepG2/C3A-cellene sådd dagen før. Bland godt ved å pipe opp og ned og serialt fortynne seks ganger 1:5 ved å overføre 25 μL til neste brønn. Utfør duplikater seriell fortynning for teknisk replikering.
- Etter 7 d ved 37 °C, stopp infeksjonen ved å fortsette med immunfluorescensfargingsprotokollen (trinn 8).
8. Immunofluorescensfarging av transfeksjon- og infeksjonskontroll
Figur 7: Skjematisk eksperimentelt oppsett for immunofluorescensfarging av transfeksjon og infeksjonskontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- For immunofluorescensfarging (figur 7)vask 3x med 1x PBS og fest celler ved å dispensere 350 μL (transfeksjonskontroll [TC]) eller 50 μL (infeksjonskontroll [IC]) på 4% fikseringsløsning per brønn. Inkuber i 15 min ved RT og vask forsiktig to ganger med 1x PBS etterpå.
MERK: Protokollen kan settes på pause her for transfeksjonskontroll til infeksjonen av HepG2/C3A-celler også stoppes. Oppbevar godt understk ved 4 °C. Forsegle også med parafilm for å hindre fordampning. - Permeabilize celler ved å legge til 350 μL (TC) eller 50 μL (IC) på 0,2% Triton X-100 (i 1 × PBS) for 5 min ved RT. Vask deretter forsiktig to ganger med 1x PBS og blokk med 350 μL (TC) eller 50 μL (IC) på 5% Hesteserum (i 1x PBS) i 1 timer ved RT under konstant agitasjon på en orbital shaker (30 rpm).
MERK: Forbered liten plastrett (30 mm) ved å plassere et fuktig vev inni og et parafinfilmlag på toppen, noe som skaper et fuktig kammer. Overfør deretter TC-dekselet slip vendt opp på parafinfilmen. Følgende trinn for TC vil bli utført i det fuktige kammeret. - Tilsett 70 μL (TC) eller 25 μL (IC) av primær antistoffantistoffet MOT ORF2 8282 (HEV-spesifikk kaninhyperimmun serum,1:5,000 i 5% Horse Serum) per brønn og inkuber over natten ved 4 °C under konstant agitasjon på en orbital shaker (30 rpm).
- Vask forsiktig to ganger med 1x PBS og tilsett 70 μL (TC) eller 25 μL (IC) av sekundært antistoff geit antikanin 488 (1:1000 i 5 % Hesteserum). Inkuber i 1 timer under konstant agitasjon på en orbital shaker (30 rpm) i mørket. Igjen, vask forsiktig to ganger med 1x PBS
- Tilsett 70 μL (TC) eller 25 μL (IC) av DAPI (1:10,000 i H2O) og inkuber i 1 min. Vask forsiktig to ganger med H2O. Ta ut dekkslipsen fra det fuktige kammeret, monter dekselet med 6 μL av monteringsreagensen opp ned på et dekselsklie (kun for TC) og la monteringsreansen tørke i 16 timer ved RT i mørket. Oppbevar IC i vann til avbildning og forsegle platen med parafinfilm for å unngå tørking på grunn av fordampning.
- Ta bilder for å bekrefte vellykket transfeksjon og infeksjon.
MERK: Sammenlignbare resultater ble oppnådd ved hjelp av det kommersielt tilgjengelige anti-ORF2 1E6 antistoff57 (1:200 i 5 % Hesteserum) og et sekundært antistoffeteselantimus (1:1000 i 5 % hesteserum)
9. FFU besluttsomhet
MERK: En FFU er definert som en eller flere ORF2-positive celler atskilt fra en annen FFU med minst tre negative celler.
- For ekstracellulær HEVcc begynner å telle alle ORF2-positive foci av de to brønnene i de to laveste fortynningene. Totalt skal det telles fire brønner. Fokusformingsenheter (FFU) per milliliter kan beregnes med følgende ligning:
MERK: Forventede titers varierer mellom 102 og 5 x 104 FFU/ml. - For intracellulær HEVcc begynner å telle alle ORF2-positive foci i brønner der mellom 50 og 100 foci observeres. I tillegg teller du de to brønnene i neste høyere fortynning. Totalt skal det telles fire brønner. Fokusformingsenheter (FFU) per milliliter kan beregnes med følgende ligning:
MERK: Forventede titers varierer mellom 105 og 3 x 106 FFU/ml. Faktorene 20x og 40x brukes til å ekstrapolere antall FFU per 50 μL og 25 μL til 1 ml og kan tilpasses tilsvarende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen beskriver vi produksjonen av høy titer smittsom HEVcc. Det første trinnet er å isolere plasmid DNA (pBluescript_SK_HEVp654 og pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figur 8a), som deretter er linearisert ved begrensning fordøyelse og renset for in vitro transkripsjon (Figur 1). En vellykket linearisering kan verifiseres ved å sammenligne ikke-fordøyd plasmid-DNA med fordøyd plasmid-DNA ved hjelp av gelelektroforese. I tillegg til et størrelsesskift, bør bare ett DNA-bånd være synlig som representerer den lineære formen. Lineariseringen er fullført når de to andre båndene over og under den lineære formen, som representerer den hakkede sirkelen og den overkoddede formen, er helt redusert (Figur 8b). Utbyttet av renset DNA bør overstige 150 ng / μL. Bare hvis disse egenskapene holder sant, bør det lineære DNA-et brukes til in vitro-transkripsjon. In vitro transkribert RNA bør like godt kontrolleres ved hjelp av gelelektroforese, og i tilfelle lav RNase abundancy skal vise distinkte bånd i stedet for en uskarpt smør (Figur 8c). I tillegg bør den rensede RNA-utbyttet overstige 500 ng/μL In vitro transkribert RNA (Figur 2) til slutt er elektroporert til HepG2-celler for virusproduksjon (figur 3 og figur 4). Vellykket elektroporasjon overvåkes av immunfluorescensfargingen av transfeksjonskontrollen (figur 9a). Transfeksjonseffektiviteten bør overstige 40 % (figur 9b). En replikering mangelfull mutant fungerer som en negativ kontroll, for å sikre spesifisitet av ORF2 farging, som ingen ORF2 uttrykk forventes (Figur 9c). Etter 7 dager med inkubasjon høstes den innhyllede (ekstracellulære) HEVcc ved å samle og filtrere cellekulturen supernatant. Ikke-innhyllet (intracellulær) HEVcc frigjøres fra cellene med flere fryse- og tinesykluser. For å fjerne eventuelle cellerester er cellelysatet sentrifugert ved høy hastighet (figur 5). Deretter benyttes begge HEVcc-artene for å infisere HepG2/C3A-celler ved seriell fortynning (figur 6 og figur 9d). Ifølge ligningene ovenfor (se trinn 9) viral titers bestemmes av FFU beregning.
Representative resultater er avbildet i figur 9. Transfeksjonskontrollen skal bestå av rundt 50 % ORF2-positive celler for å garantere en effektiv mengde virus som produseres (figur 9a,b). Jo mindre ORF2-positive celler jo lavere titer vil være. Nøyaktig etter trinnene som er nevnt i protokollen, vil generere titere som varierer mellom 105 og 3 x 106 FFU/ml for ikke-innhyllet (intracellulær) HEVcc. For de innhyllede (ekstracellulære) HEVcc titers mellom 102 og 5 x 104 FFU/ml forventes (Figur 9e). I tillegg ble forhøyede FFU-tellinger observert for G1634R-mutert. Ved beregning av forholdet mellom genomkopier og smittsomme viruspartikler ble det produserte intracellulære HEVcc for både p6_WT og p6_G1634R funnet å være lavere sammenlignet med den ekstracellulære HEVcc, noe som tyder på en høyere spesifikk infektivitet av de ikke-innkapslede HEV-artene (Figur 9f).
Figur 8: Generasjon av in vitro transkribert RNA.
(A) Eksempel på et absorbansspektrum av isolert Plasmid-DNA. (B) Gelelektroforese av ikke-fordøyd og fordøyd Plasmid-DNA. (C)Gelelektroforese av in vitro transkribert RNA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Representative resultater av høy titer HEVcc produksjon.
(A)Transfection kontroll av elektroporerte HepG2 celler. Transfiserte celler ble farget med anti-ORF2 antistoff (grønn, LS-Bio) og DAPI (blå). (B) Transfectioneffektiviteten ble beregnet med antall ORF2-positive celler normalisert til antall totale celler. (C) En replikering-mangelfull mutant fungerer som en negativ kontroll for immunofluorescens farging, for å sikre ORF2 spesifisitet. (D) For FFU besluttsomhet ble seriefortynninger av de produserte virusbestandene utført. ORF2 positive celler er avbildet i hvitt. (E) Virale titere ble beregnet ved FFU-telling og (F) virusbelastninger ble bestemt av qPCR og normalisert til FFU/ml. Barer viser gjennomsnittlig og standardavvik av henholdsvis 38 og 10 uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Arbeidsløsning | Konsentrasjon | Volum |
| Kollagen | 40 ml | Pbs |
| 40 μl | Eddiksyre | |
| 1 ml | Kollagen R løsning 0,4% steril | |
| Cytomix (andre) | 120 mM (andre) | KCl (andre) |
| 0,15 mM (andre) | CaCl2 (andre) | |
| 10 mM (andre) | K2HPO4 (pH 7.4) | |
| 25 mM (andre) | HEPES (ANDRE) | |
| 2 mM (andre) | Egta (andre) | |
| DMEM fullført | 500 ml | Dmem (andre) |
| 5 ml | Penn/strep | |
| 5 ml | MEM NEAA (100X) | |
| 5 ml | L-Glutamin (andre) | |
| 50 ml | Fetal storfe serum | |
| MEM fullført | 500 ml | Mem |
| 5 ml | Natrium Pyruvat | |
| 5 ml | Gentamycin (andre) | |
| 5 ml | MEM NEAA (100X) | |
| 5 ml | L-glutamin | |
| 50 ml | ultra-lav IgG |
Tabell 1: Tabell over buffersammensetning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fra og med plasmidpreparatet bør DNA-utbytter overstige 150 ng/μL for å kunne utføre flere linearisering fra samme plasmidlager, noe som minimerer risikoen for bakterier-indusert mutagenese av avgjørende genomsekvenser. Videre er det viktig å sjekke begrensningen fordøye for fullstendig plasmid linearisering av gelelektroforese (Figur 8b). Mangel på linearisert plasmid DNA ville indusere rullende sirkel forsterkning forårsaker in vitro transkripsjon å være mindre effektiv. I tillegg bør RNA integritet bekreftes for å evaluere overflod av RNases i prøven (Figur 8c). Først da bør en elektroporasjon av målceller vurderes. Merk, før du starter med utarbeidelsen av HepG2-celler, sørg for at alt er for hånden og godt forberedt unngå lange ventetider. Spesielt forsikre korttidslagring av cellene og RNA i Cytomix til elektroporasjon. For å omgå oppvarming av cellene under elektroporasjon er det viktig å kjøle bufferen på is på forhånd. Varigheten av pulsen bør ikke overstige 20-25 ms og 270 V. Etter elektroporasjon krever cellene en rask overføring til friskt medium for å sikre celle levedyktighet. Før infeksjon av målceller, bør TC kontrolleres for prosentandelen av ORF2-positive celler. Hvis TC viser ingen ORF2-positive celler er det mest sannsynlig at elektroporasjonen har mislyktes eller flekker ikke fungerte, og eksperimentet bør gjentas.
Ved høsting intracellulær HEVcc spesiell oppmerksomhet bør betales til hastigheten på fryse og tine sykluser. Virale titere kan økes ved å utføre frysing i flytende nitrogen i stedet for ved -80 °C. Tvert imot bør tiningen skje den tregeste måten som tyder på lagring på is til cellesuspensjonen er fullstendig likvidert. Likevel er det også mulig å tine cellesuspensjonen ved romtemperatur, i en 37 °C inkubator eller vannbad, men jo raskere tiningen vil bli utført jo mer titers vil reduseres.
Avhengig av følgende eksperimenter er det også mulig å gjøre fryse- og tinesykluser i MEM komplett eller 1x PBS uten dramatisk tap av virale titere, men man bør huske på at dette fører til at den ekstracellulære HEVcc er i et annet medium enn den intracellulære HEVcc.
Etter disse avgjørende trinnene i protokollen varierer forventede titers mellom 105 og 3 x 106 FFU/ml for ikke-innhyllet (intracellulær) HEVcc. For de innhyllede (ekstracellulære) HEVcc titers mellom 102 og 5 x 104 FFU/ ml er ventet (Figur 9e). Så langt overvåker studier som bruker HEV cellekultursystemer viral replikering og forplantning hovedsakelig av qPCR. Vurderingen av RNA-genomkopier gir ennå ingen innsikt i montering og frigjøring av smittsomme partikler.
En tidligere studie58 med hell forplantet pasient isolater i cellekultur med maksimalt titers på 103 TCID50/ml. Som vist nylig, er det også mulig å med hell passere HEVcc i cellekultur og tilpasse vår protokoll til andre stammer, for eksempel 47832c og 83-2 som ikke har en innsetting i den hypervariable regionen56. Også, om pasient avledede sekvenser kan klones inn i Bluescript vektor ryggraden og fortsatt gi høye virale titers ble ikke testet. Med den introduserte metoden kan ikke-innkapslede så vel som innkapslede viruspartikler høstes og brukes til å inokulere en rekke naive cellelinjer som A549, Huh7.5, Jeg-3 og primære menneskelige og svinehepatocytter, noe som gir en fordel for fremtidige applikasjoner som undersøkelse av HEV-tropisme, patogenese, narkotikautvikling, virale og vertsinteraksjoner, inaktive studier, nøytraliserende antistoffer og mange flere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Suzanne Emerson for hepatitt E virus p6 klone. HEV-spesifikk kanin hyperimmun serum ble vennlig levert av Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Tyskland. Videre takker vi alle medlemmer av Institutt for molekylær og medisinsk virologi ved Ruhr University Bochum for deres støtte og diskusjon. Tall 1-7 ble generert med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm mesh | Sarstedt | 83.1826 | Harvest extracellular Virus |
| 4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | Immunofluorescence |
| Acetic acid | CarlRoth | 6755.1 | Collagen working solution |
| Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | Virus harvesting |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | Selection of transformed bacteria |
| ATP | Roche | 11140965001 | in vitro transcription and electroporation |
| BioRender | BioRender | Figure Generation | |
| CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
| Collagen R solution 0.4 % sterile | Serva | 47256.01 | Collagen working solution |
| CTP | Roche | 11140922001 | in vitro transcription |
| Cuvette | Biorad | 165-2088 | Electroporation |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | Immunofluorescence |
| DMEM | gibco | 41965-039 | Cell culture |
| DNAse | Promega | M6101 | in vitro transcription |
| DTT | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
| Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformation |
| Fetal bovine serum | gibco | 10270106 | Cell culture |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Immunofluorescence |
| GenePulser Xcell Electroporation System | BioRad | 1652660 | Electroporation |
| Gentamycin | gibco | 15710049 | Cell culture |
| GTP | Roche | 11140957001 | in vitro transcription |
| H2O | Braun | 184238001 | Immunofluorescence |
| Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
| Horse serum | gibco | 16050122 | Immunofluorescence |
| K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
| KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
| L-Glutamin | gibco | 25030081 | Cell culture |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
| MEM | gibco | 31095-029 | Cell culture |
| MEM NEAA (100×) | gibco | 11140-035 | Cell culture |
| MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
| Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA concentration |
| MluI enzyme | NEB | R0198L | Linearization |
| NEB buffer | NEB | included in R0198L | Linearization |
| NucleoSpin Plasmid kit | Macherey & Nagel | 740588.250 | Plasmid preparation |
| NucleoSpin RNA Clean-up Kit | Macherey & Nagel | 740948.250 | RNA purification |
| PBS | gibco | 70011051 | Cell culture |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Cell culture |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) | Todt et.al | Virus production | |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) | Shukla et al. | GenBank accession no. JQ679013 | Virus production |
| Primary antibody 1E6 | LS-Bio | C67675 | Immunofluorescence |
| Primary antibody 8282 | Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | DNA extraction |
| Ribo m7G Cap Analog | Promega | P1711 | in vitro transcription |
| RNase away | CarlRoth | A998.3 | RNA purification |
| RNasin (RNase inhibitor) | Promega | N2515 | in vitro transcription |
| Secondary antibody donkey anti-mouse 488 | Thermo Fisher | A-21202 | Immunofluorescence |
| Secondary antibody goat anti-rabbit 488 | Thermo Fisher | A-11008 | Immunofluorescence |
| Sodium Pyruvat | gibco | 11360070 | Cell culture |
| T7 RNA polymerase | Promega | P2077 | in vitro transcription |
| Transcription Buffer | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| Triton X-100 | CarlRoth | 3051.3 | Immunofluorescence |
| Trypsin-EDTA (0.5 %) | gibco | 15400054 | Cell culture |
| ultra-low IgG | gibco | 1921005PJ | Cell culture |
| UTP | Roche | 11140949001 | in vitro transcription |
References
- Wedemeyer, H., Pischke, S., Manns, M. P. Pathogenesis and treatment of hepatitis e virus infection. Gastroenterology. 142 (6), 1388-1397 (2012).
- Smith, D. B., et al. Proposed reference sequences for hepatitis E virus subtypes. The Journal of General Virology. 97 (3), 537-542 (2016).
- Ding, Q., et al. Hepatitis E virus ORF3 is a functional ion channel required for release of infectious particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (5), 1147-1152 (2017).
- Chapuy-Regaud, S., et al. Characterization of the lipid envelope of exosome encapsulated HEV particles protected from the immune response. Biochimie. 141, 70-79 (2017).
- Yin, X., Ambardekar, C., Lu, Y., Feng, Z. Distinct Entry Mechanisms for Nonenveloped and Quasi-Enveloped Hepatitis E Viruses. Journal of Virology. 90 (8), 4232-4242 (2016).
- Khuroo, M. S., Khuroo, M. S., Khuroo, N. S. Hepatitis E: Discovery, global impact, control and cure. World Journal of Gastroenterology. 22 (31), 7030-7045 (2016).
- Rasche, A., et al. Hepatitis E Virus Infection in Dromedaries, North and East Africa, United Arab Emirates, and Pakistan, 1983-2015. Emerging Infectious Diseases. 22 (7), 1249-1252 (2016).
- Hsieh, S. Y., et al. Identity of a novel swine hepatitis E virus in Taiwan forming a monophyletic group with Taiwan isolates of human hepatitis E virus. Journal of Clinical Microbiology. 37 (12), 3828-3834 (1999).
- Johne, R., et al. Detection of a novel hepatitis E-like virus in faeces of wild rats using a nested broad-spectrum RT-PCR. The Journal of General Virology. 91, Pt 3 750-758 (2010).
- Payne, C. J., Ellis, T. M., Plant, S. L., Gregory, A. R., Wilcox, G. E. Sequence data suggests big liver and spleen disease virus (BLSV) is genetically related to hepatitis E virus. Veterinary Microbiology. 68 (1-2), 119-125 (1999).
- Haqshenas, G., Shivaprasad, H. L., Woolcock, P. R., Read, D. H., Meng, X. -J. Genetic identification and characterization of a novel virus related to human hepatitis E virus from chickens with hepatitis–splenomegaly syndrome in the United States. Journal of General Virology. 82, 2449-2462 (2001).
- Tei, S., Kitajima, N., Takahashi, K., Mishiro, S. Zoonotic transmission of hepatitis E virus from deer to human beings. The Lancet. 362 (9381), 371-373 (2003).
- Nakamura, M., et al. Hepatitis E virus infection in wild mongooses of Okinawa, Japan: Demonstration of anti-HEV antibodies and a full-genome nucleotide sequence. Hepatology Research: the Official Journal of the Japan Society of Hepatology. 34 (3), 137-140 (2006).
- Drexler, J. F., et al. Bats worldwide carry hepatitis E virus-related viruses that form a putative novel genus within the family Hepeviridae. Journal of Virology. 86 (17), 9134-9147 (2012).
- Zhao, C., et al. A novel genotype of hepatitis E virus prevalent among farmed rabbits in China. Journal of Medical Virology. 81 (8), 1371-1379 (2009).
- Lhomme, S., et al. Risk of zoonotic transmission of HEV from rabbits. Journal of Clinical Virology: the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 58 (2), 357-362 (2013).
- Kaci, S., Nöckler, K., Johne, R. Detection of hepatitis E virus in archived German wild boar serum samples. Veterinary Microbiology. 128 (3-4), 380-385 (2008).
- Liu, B., et al. Avian hepatitis E virus infection of duck, goose, and rabbit in northwest China. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 76 (2018).
- Raj, V. S., et al. Novel hepatitis E virus in ferrets, the Netherlands. Emerging Infectious Diseases. 18 (8), 1369-1370 (2012).
- Dong, C., et al. Restricted enzooticity of hepatitis E virus genotypes 1 to 4 in the United States. Journal of Clinical Microbiology. 49 (12), 4164-4172 (2011).
- Goens, S. D., Perdue, M. L. Hepatitis E viruses in humans and animals. Animal Health Research Reviews. 5 (2), 145-156 (2004).
- Geng, Y., Wang, Y. Transmission of Hepatitis E Virus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 948, 89-112 (2016).
- Naik, S. R., Aggarwal, R., Salunke, P. N., Mehrotra, N. N. A large waterborne viral hepatitis E epidemic in Kanpur, India. Bulletin of the World Health Organization. 70 (5), 597-604 (1992).
- Feagins, A. R., Opriessnig, T., Guenette, D. K., Halbur, P. G., Meng, X. -J. Detection and characterization of infectious Hepatitis E virus from commercial pig livers sold in local grocery stores in the USA. The Journal of General Virology. 88, Pt 3 912-917 (2007).
- Colson, P., et al. Pig liver sausage as a source of hepatitis E virus transmission to humans. The Journal of Infectious Diseases. 202 (6), 825-834 (2010).
- Wenzel, J. J., et al. Detection of hepatitis E virus (HEV) from porcine livers in Southeastern Germany and high sequence homology to human HEV isolates. Journal of Clinical Virology: the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 52 (1), 50-54 (2011).
- Colson, P., et al. Transfusion-associated Hepatitis E, France. Emerging Infectious Diseases. 13 (4), 648-649 (2007).
- Kamp, C., et al. Impact of hepatitis E virus testing on the safety of blood components in Germany - results of a simulation study. Vox Sanguinis. , (2018).
- Kamar, N., Dalton, H. R., Abravanel, F., Izopet, J. Hepatitis E virus infection. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 116-138 (2014).
- Pischke, S., Behrendt, P., Manns, M. P., Wedemeyer, H. HEV-associated cryoglobulinaemia and extrahepatic manifestations of hepatitis E. The Lancet Infectious Diseases. 14 (8), 678-679 (2014).
- Colson, P., et al. Severe thrombocytopenia associated with acute hepatitis E virus infection. Journal of Clinical Microbiology. 46 (7), 2450-2452 (2008).
- Mishra, P., Mahapatra, M., Kumar, R., Pati, H. P. Autoimmune hemolytic anemia and erythroid hypoplasia associated with hepatitis E. Indian Journal of Gastroenterology: Official Journal of the Indian Society of Gastroenterology. 26 (4), 195-196 (2007).
- Sood, A., Midha, V., Sood, N. Guillain-Barré syndrome with acute hepatitis E. The American Journal of Gastroenterology. 95 (12), 3667-3668 (2000).
- Fousekis, F. S., Mitselos, I. V., Christodoulou, D. K. Extrahepatic manifestations of hepatitis E virus: An overview. Clinical and Molecular Hepatology. 26 (1), 16-23 (2020).
- Pischke, S., et al. Ribavirin treatment of acute and chronic hepatitis E: A single-centre experience. Liver International: Official Journal of the International Association for the Study of the Liver. 33 (5), 722 (2013).
- Kamar, N., et al. Ribavirin for Chronic Hepatitis E Virus Infection in Transplant Recipients. The New England Journal of Medicine. 370, 1111-1120 (2014).
- Todt, D., et al. In vivo evidence for ribavirin-induced mutagenesis of the hepatitis E virus genome. Gut. 65, 1733-1743 (2016).
- Todt, D., Walter, S., Brown, R. J. P., Steinmann, E. Mutagenic Effects of Ribavirin on Hepatitis E Virus-Viral Extinction versus Selection of Fitness-Enhancing Mutations. Viruses. 8 (10), 8100283 (2016).
- Todt, D., Meister, T. L., Steinmann, E. Hepatitis E virus treatment and ribavirin therapy: Viral mechanisms of nonresponse. Current Opinion in Virology. 32, 80-87 (2018).
- Kamar, N., et al. Ribavirin for Hepatitis E Virus Infection After Organ Transplantation: A Large European Retrospective Multicenter Study. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. , (2019).
- Kamar, N., et al. Influence of immunosuppressive therapy on the natural history of genotype 3 hepatitis-E virus infection after organ transplantation. Transplantation. 89 (3), 353-360 (2010).
- Kamar, N., et al. Pegylated interferon-alpha for treating chronic hepatitis E virus infection after liver transplantation. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 50 (5), 30-33 (2010).
- Todt, D., et al. Antiviral Activities of Different Interferon Types and Subtypes against Hepatitis E Virus Replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (4), 2132-2139 (2016).
- Dao Thi, V. L., et al. Sofosbuvir Inhibits Hepatitis E Virus Replication In Vitro and Results in an Additive Effect When Combined with Ribavirin. Gastroenterology. 150 (1), 82-85 (2016).
- van der Valk, M., Zaaijer, H. L., Kater, A. P., Schinkel, J. Sofosbuvir shows antiviral activity in a patient with chronic hepatitis E virus infection. Journal of Hepatology. 66 (1), 242-243 (2017).
- Kaushik, N., et al. Zinc Salts Block Hepatitis E Virus Replication by Inhibiting the Activity of Viral RNA-Dependent RNA Polymerase. Journal of Virology. 91 (21), (2017).
- Todt, D., et al. The natural compound silvestrol inhibits hepatitis E virus (HEV) replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 157, 151-158 (2018).
- Glitscher, M., et al. Inhibition of Hepatitis E Virus Spread by the Natural Compound Silvestrol. Viruses. 10 (6), 301 (2018).
- Kinast, V., Burkard, T. L., Todt, D., Steinmann, E. Hepatitis E Virus Drug Development. Viruses. 11 (6), 485 (2019).
- Schemmerer, M., et al. Enhanced Replication of Hepatitis E Virus Strain 47832c in an A549-Derived Subclonal Cell Line. Viruses. 8 (10), 267 (2016).
- Huang, R., et al. Cell Culture of Sporadic Hepatitis E Virus in China. Clinical and Vaccine Immunology. 6 (5), 729-733 (1999).
- Emerson, S. U., et al. Recombinant hepatitis E virus genomes infectious for primates: Importance of capping and discovery of a cis-reactive element. PNAS. 98 (26), 15270-15275 (2001).
- Shukla, P., et al. Cross-species infections of cultured cells by hepatitis E virus and discovery of an infectious virus-host recombinant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2438-2443 (2011).
- Shukla, P., et al. Adaptation of a genotype 3 hepatitis E virus to efficient growth in cell culture depends on an inserted human gene segment acquired by recombination. Journal of Virology. 86 (10), 5697-5707 (2012).
- Meister, T. L., Bruening, J., Todt, D., Steinmann, E. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Research. 163, 34-49 (2019).
- Todt, D., et al. Robust hepatitis E virus infection and transcriptional response in human hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2020).
- Ankavay, M., et al. New insights into the ORF2 capsid protein, a key player of the hepatitis E virus lifecycle. Scientific Reports. 9 (1), 6243 (2019).
- Schemmerer, M., Johne, R., Erl, M., Jilg, W., Wenzel, J. J. Isolation of Subtype 3c, 3e and 3f-Like Hepatitis E Virus Strains Stably Replicating to High Viral Loads in an Optimized Cell Culture System. Viruses. 11 (6), 483 (2019).
