Summary
Burada açıklanan hepatit E virüsü (HEV) yüksek viral titresi üretmek için nasıl etkili bir yöntemdir verimli hepatoma hücreleri enfekte etmektir. Sunulan yöntemle, hem zarfsız, hem de zarflı viral parçacıklar hasat edilebilir ve çeşitli hücre hatları aşılamak için kullanılabilir.
Abstract
Hepatit E virüsü karaciğer sirozu ve karaciğer yetmezliğinin önde gelen nedenidir ve dünya çapında yaygınlığı artmaktadır. Tek iplikçikli RNA virüsü ağırlıklı olarak kan transfüzyonu, yetersiz sıhhi koşullar ve kontamine gıda ürünleri ile bulaşır. Bugüne kadar off-label ilaç ribavirin (RBV) birçok hasta için tercih edilen tedavi yöntemidir. Bununla birlikte, belirli bir HEV tedavisi tespit edilmeyi sürdürebilir. Şimdiye kadar, HEV yaşam döngüsü ve patogenez hakkında bilgi ciddi verimli bir HEV hücre kültür sisteminin eksikliği nedeniyle engel olmuştur. Güçlü bir hücre kültür sistemi de viral patogenez içeren viral yaşam döngüsünün çalışma için gereklidir. Burada açıklanan yöntemle 3 x 106 odak şekillendirme ünitesi/mL(FFU/mL) zarfsız HEV ve 5 x 104 FFU/mL'ye kadar zarflı HEV viral titreler üretilebilir. Bu parçacıkları kullanarak, birincil hücreler ve insan da dahil olmak üzere çeşitli kökenlerden gelen hücrelerin çeşitli enfekte etmek mümkündür, yanı sıra hayvan hücre hatları. Plazmidlerden enfeksiyöz HEV partiküllerinin üretimi sonsuz bir kaynak oluşturur ve bu da protokolü son derece verimli hale getirir.
Introduction
Hepatit E, dünya çapında yaygınlığı artan oldukça hafife alınmış bir hastalıktır. Yaklaşık 20 milyon enfeksiyon yılda 70.000'den fazla ölümle sonuçlanır1. Altta yatan ajan, Hepatit E virüsü (HEV), yakın zamanda yeniden atandı ve şimdi cins Orthohepevirus ve Piscihepevirus dahil olmak üzere aile Hepeviridae içinde sınıflandırılır. Çeşitli kökenlerden HEV insanlar, domuz, tavşan, sıçan, kuş ve diğer memeliler 2 izole de dahil olmak üzere orthohepevirus A-D türleri içindesınıflanır. Şu anda, sekiz farklı genotip (GT) pozitif odaklı, tek iplikçikli RNA virüsü tespit edilmiştir2. Dizikimlikleri, iletim yolları ve coğrafi dağılımları farklılık belirtse ler de genomik yapıları son derece korunmuştur. Daha spesifik olan 7.2 kbp HEV genomu 3 ana açık okuma çerçevesine (ORF1-3) ayrılmıştır. ORF1 konak hücre içinde başarılı bir çoğaltma için gerekli tüm enzimleri kodlarken, ORF2 capsid proteinini kodlar ve ORF3 proteini enfeksiyöz partiküllerin toplanması ve serbest bırakılması için gerekli olan işlevsel bir iyon kanalı olarak çalışır3. Bir kez bazal veya apikal lümen HEV içine yayımlanan her iki, yarı ve zarflı olmayan / çıplak türler virüs kan veya dışkı, sırasıyla4,5kaynaklı olup olmadığına bağlı olarak var .
GT1 ve GT2 daha çok gelişmekte olan ülkelerde bulunurken, sadece dışkı-oral yol ileinsanlara 6 bulaştıran, GT3, GT4 ve GT7 ağırlıklı olarak gelişmiş ülkelerde meydana1,7 rezervuarlar olarak hizmet veren türlerin çeşitliile,örneğin, domuz8, sıçan9, tavuk10,11, geyik12, firavun faresi13, yarasa14, tavşan15,16, yaban domuzu17 ve daha birçok7,18,19, zoonoz kanıt sağlayan7,20,21,22. Yetersiz sıhhi koşullara ek olarak23 ve kontamine gıda ürünleri12,24,25,26, kan transfüzyonu ve organ nakli ile iletim demümkündür 27,28. HEV karaciğer sirozu ve karaciğer yetmezliği nin sık görülen bir nedenidir29 özellikle önceden var olan karaciğer hastalığı olan hastalarda, bağışıklık sistemi zayıf bireylerde (genotip 3, 4 ve 7) ve gebe kadınlarda (genotip 1). Not, hematopoetik hastalık30gibi ekstrahepatik belirtileri de vardır30 ,31,32, nörolojik bozukluklar33 ve böbrek hasarı34.
Bugüne kadar, off-label ilaç ribavirin (RBV) birçok enfekte hastalar için tercih edilen tedavi35,36. Ancak, tedavi başarısızlığı ve kötü klinik uzun vadeli sonuçlar vakaları bildirilmiştir. Tedavi yetmezliği viral mutagenez ve kronik enfekte hastalarda artmış viral heterojenite ile bağlantılı olmuştur37,38,39. Aksine, yakın zamanda yapılan bir Avrupa retrospektif çok merkezli çalışma da polimeraz mutasyonlarını RBV tedavi yetmezliği40ile ilişkilendiremedi. Klinik gözlemler ve in vitro deneylerde, interferon41,42,43, sofosbuvir44,45, çinko tuzları 46 ve silvestrol47 47,48 de antiviral etkileri göstermiştir. Bununla birlikte, hev yaşam döngüsü ve patogenezi hakkında bilgi eksikliği engel, belirli bir HEV tedavisi bulunabilir kalır. Bu nedenle, virolojik çalışmalar ve yeni antiviral ilaçların geliştirilmesi için sağlam bir hücre kültür sistemi acilen ihtiyaç vardır49.
Ne yazık ki, diğer hepatit virüsleri gibi, HEV konvansiyonel hücre hatlarında yaymak zordur ve genellikle çok yavaş düşük viral yüklere yol ileir. Yine de, bazı gruplar hücre hattı subklonlar üretimi tarafından viral yükleri artırmak başardık50 veya medya takviyeleri ayarı51. Son zamanlarda cDNA klonlar üretimi52 ve primer hastanın adaptasyon geçerek izole53,54 hücre kültüründe daha iyi HEV yayılımı55. Bu protokolde, kernow-C1 suş adapte bir hücre kültürünün genomu kullanılan (p6_WT olarak anılacaktır)54 ve bir mutant suş bir çoğaltma arttırıcı mutasyon barındıran (p6_G1634R olarak anılacaktır)37. Kernow-C1 HEV hücre kültüründe en sık kullanılan suşudur ve yüksek viral yükler üretebilme yeteneğine sahiptir. Viral RNA kopya sayıları değerlendirilerek, HEV replikasyonu in vitro olarak izlenebilir. Bununla birlikte, bu teknikler üretilen enfeksiyöz partikül sayısının değerlendirilmesini izin vermez. Bu nedenle Odak Şekillendirme Birimlerini (FFU/mL) belirlemek için immünoresans boyama sistemi kurduk.
Burada açıklanan yöntem56 birincil hücreler ve memeli hücre hatları da dahil olmak üzere çeşitli kökenlerden hücre türleri çeşitli enfekte yeteneğine sahip tam uzunlukta bulaşıcı viral parçacıklar üretmek için kullanılabilir. Bu HEV enfeksiyonu ve tropizm önemli yönlerini deşifre etmek için temel bir ön koşuldur. Genellikle sınırlı hasta izole ile aşılama için gerek yoktur. Plazmidlerden enfeksiyöz HEV partiküllerinin üretimi sonsuz bir kaynak oluşturur ve bu da protokolü nispeten verimli kılar. Buna ek olarak, bu sistem in vivo tanımlanan genom değişimi ve HEV replikasyon ve fitness üzerindeki etkileri çalışma sağlayan ters genetik için kullanılabilir. Bu teknik birçok sınırlamanın üstesinden gelmekte ve ilaç gelişimi, mutagenez çalışmaları ve kısıtlama veya giriş faktörleri gibi virüs-konak etkileşimlerinin değerlendirilmesi için yol olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm deneyler BSL-2 koşulu altında gerçekleştirilir. Hepatit E virüsü RNA veya enfeksiyöz virüs ile temas eden tüm malzemeler, imha edilmeden önce kaputun içindeki bir atık kabından %4 Kohrsolin FF ile düzgün bir şekilde durulanmalıdır.
1. Plazmid hazırlığı
- Dönüştürülmüş Escherichia coli JM109 ile 100 μg/mL ampisilin içeren 200 mL LB orta tam uzunlukta HEV gt3 Kernow-C1p6 dizisi için plazmid kodlama içeren (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54 veya pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37). 37 °C'de 16 saat boyunca kalıcı ajitasyon altında (170 rpm) kuluçka.
NOT: Plazmid izolasyonu plazmid ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu). - Üretim protokolünü takiben, 10 dk için 6.000 x g ve 4 °C'de 200 mL gece kültürü aşağı çevirin ve supernatant atın. Bakteriyel pelet dondurulabilir ve -20 °C'de saklanabilir.
- 10 mL serolojik pipet ve bir pipet adam ile yukarı ve aşağı pipetleme tarafından Resuspension tampon 4 mL bakteriyel pelet resuspend. Ayrıca, girdap titizlikle.
- Önceden ısıtılmış Lysis tampon (30-40 °C) 4 mL ekleyin. Birkaç kez hafifçe ters çevirin ve oda sıcaklığında kuluçka (RT) için 5 dakika.
- Nötralizasyon arabelleği 4,8 mL ekleyin, nazikçe ters çevirin ve lysate'nin niceliksel olarak nötralize olduğundan emin olun (üreticinin açıklamasına bakın). Sonra 11.000 x g ve 4 °C'de 20 dk santrifüj.
- 1 mL filtre olmayan ucuiçine 2 cm x 2 cm mull parça yerleştirin, yük yeniden askıya alınmış, lysed ve nötralize supernatant içinde 10 mL serolojik pipet, serolojik pipet ucuna mull ile 1 mL ucu ekleyin ve yeni bir 50 mL tüp içinde supernatant filtre.
NOT: Supernatant gerekirse 4 °C'de 30 dk'ya kadar saklanabilir. - Birkaç adımda filtrelenmiş süpernatantın 750 μL'sini toplam 4 filtre sütununa (kitte sağlanan) ve 30 s için 11.000 x g'de santrifüj uygulayın.
- Her filtre sütununa 500 μL önceden ısıtılmış (50 °C) ile iki kez yıkayın tampon AW'yi 11.000 x g'de 30 s'de yıkayın ve daha sonra akıştan geçen leri atın.
- Her filtre sütununu 600 μL yıkama tamponu A4 ile 30 s için 11.000 x g'de santrifüj ederek yıkayın. x g
- Her filtre sütunundaki plazmid DNA'sını, filtre sütunlarının ortasına 60 μL'lik elüsyon tamponu aktararak eute. 1 dk RT ve santrifüj 1 dk için 1 11.000 x g inkübat.
- Eluatları birleştirin ve spektrofotometre kullanarak çıkarılan plazmid DNA konsantrasyonu ölçün.
2. Doğrusallaştırma ve DNA arınması
Şekil 1: Plazmid lineerizasyonu ve DNA arınması için şematik deneysel kurulum. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
NOT: Doğrusallaştırma in vitro transkripsiyon sırasında RNA verimini artırır (adım 3)
- Plazmid DNA'sını doğrusallaştırmak için(Şekil 1) şablon DNA'sının 10 μg'ını (adım 1'de çıkarılan), tamponun 10 μL'sini, 2 μL'lik MluI'yi karıştırın ve H2O ile 100°L'lik bir hacme ayarlayın.
- 37 °C'de 1 saat kuluçka ve plazmidin agarose jel elektroforezi ile doğrusallaştırılmasını onaylayın (örneğin, sindirilmemiş ve sindirilmiş plazmid DNA'sını [her biri 1 μL] %1 agarose jel üzerinde ve 120 V sabit akımda elektroforez çalıştırın).
- Üreticilerin DNA çıkarma protokolüne (bkz. Malzeme Tablosu, Şekil 1), kitte sağlanan 500 μL Bağlayıcı tamponu 100 μL doğrusaldna ile karıştırın. Örneği bir filtre sütununa uygulayın ve 30 s için 17.800 x g'de santrifüj uygulayın.
- Filtre sütununu 17.800 x g'de 650 μL Yıkama tamponu ve santrifüj ekleyerek yıkayın. Artık Yıkama tamponu kaldırmak için, 60 s için 17.800 x g kuru santrifüj ve temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüp daha sonra her filtre sütunu yerleştirin.
- Önceden ısıtılmış 60 μL H2O (PCR sınıfı, 70 °C) filtrenin merkezine aktarılarak DNA'yı eleyin. 70 °C'de 1 dk, 1 dk.18.000 x g'da santrifüj için kuluçka.
NOT: DNA'yı in vitro transkripsiyona kadar -20 °C'de saklayın.
3. Tam uzunlukta HEV genotip 3 p6 DNA ve RNA saflaştırmainin in-vitro transkripsiyonu
Şekil 2: In vitro transkripsiyon ve RNA arınması için şematik deneysel kurulum. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
NOT: Plazmid DNA'sından viral genomik RNA üretmek için in vitro transkripsiyon gereklidir.
- In vitro transkripsiyon karışımı için 20 μL 5x T7 transkripsiyon tampon, 10 mM DTT, 100 U ribonükleaz inhibitörü, 25 mM ATP, CTP ve UTP, 12.5 mM GTP, 5 mM Ribo m7G Cap Analog, 2 μg doğrusaldna şablonu ve 80 U T7 RNA polimeraz. 100 μL'ye kadar nükleaz içermeyen H2O ile doldurun, iyice karıştırın ve 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: -20 °C'de kısa süreli depolama 3.1 ila 3.1.2 adımdan sonra mümkündür.- 2 μL T7 RNA polimeraz ekleyin, iyice karıştırın ve 37 °C'de 2 saat daha kuluçkaya yatırın.
- İlk DNA şablonu sindirmek için 7,5 μL DNase (RNase ücretsiz, 1 U/μL) ekleyin, iyi karıştırın ve 30 dakika 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Bozulmayı önlemek için RNA ile çalışırken tüm yüzeyleri ve pipetleri RNa için yüzey dekontaminantı ile temizleyin. Ayrıca, tüm reaksiyon tüpleri RNase içermeyen ve steril olduğundan emin olun. Sadece filtrelerle ipuçları kullanın ve sadece RNase içermeyen ve steril su ile seyreltin.
- RNA ekstraksiyonu için üretim protokolüne (Bkz. Malzeme Tablosu, Şekil 2), her in-vitro transkripsiyon reaksiyonu için 330 μL Lysis tamponu ve 330 μL'lik 100 etanol karıştırılarak Lysis tamponunun ve %100 etanolün premiksini hazırlayın. 110 μL RNA ve girdap için 660 μL Lysis tampon-etanol premixini ekleyin. Numuneyi bir filtre sütununa yükleyin ve 30 s için 8000 x g'de santrifüj yükleyin.
- 30 s için 8000 x g'de 600 μL Yıkama tamponu ve santrifüj ekleyin. Kalan yıkama tamponu kaldırmak için 2 dakika için 8000 x g de Yıkama tampon ve santrifüj 350 μL ekleyin. Her filtre sütununu temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe yerleştirin. Filtre sütununun kapağını açın ve sütunun 3 dakika kurumasına izin verin.
- Filtre sütununun ortasına 50 μL RNase serbest H2O yerleştirerek Elute RNA. 1 dakika RT'de 1 dakika kuluçka ve ardından 1 dk. 8.000 x g'da inkübatör 1 000 x g. Bir agarose jelin üzerine 1 μL RNA yükleyerek RNA bütünlüğünü kontrol edin ve bir spektrofotometre kullanarak çıkarılan RNA konsantrasyonu ölçün.
NOT: RNA'yı -80 °C'de elektroporasyona kadar saklayın ve bozulmayı önlemek için rna'yı buz üzerinde özel olarak eritin.
4. HeV (HEVcc) üretimi elde edilen hücre kültürü için HepG2 hücrelerinin hazırlanması
Şekil 3: HeV (HEVcc) üretimi elde edilen hücre kültürü için HepG2 hücrelerinin hazırlanması için şematik deneysel kurulum. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
NOT: Kontaminasyonu önlemek için, hücre hazırlanması, elektroporasyon, enfeksiyon, hasat ve hücre fiksasyonu steril koşullarda biyogüvenlik seviyesi 2 tesisinde gerçekleştirilmiştir. Hücreleri içeren 37 °C'de %5 CO2 kuluçka makinesinde kuluçka basamakları gerçekleştirildi.
- HeVcc üretimi için HepG2 hücreleri hazırlamak için(Şekil 3),tam Dulbecco's Modifiye Kartal Orta (DMEM) tohum hücreleri (Tablo 1bakınız) üzerine 15 cm kollajen üzerine (Tablo 1, steril filtre PBS- asetik asit karışımı ile 0.2 μm mesh kollajen eklemeden önce) kaplı kültür çanak. Hücreler %90 konfluent olana kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: %90 konfluent hücre içeren her 15 cm'lik çanak, 4 elektroporasyon için yeterli hücre üretecektir. - Orta yı yavaşça plakadan çıkarın ve 10 mL 1x PBS ile hücreleri bir kez yıkayın. Hücreleri 3 mL %0.05 tripsin-EDTA ekleyerek ve hücreler tamamen ayrılana kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırArak hücreleri trypsize. 10 mL DMEM'deki hücreleri yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonu 50 mL'lik bir tüpe aktarır. Toplam hücre sayısını belirleyin.
- Her elektroporasyon 5 x 106 hücre gerektirdiğinden, uygun hacmi yeni bir 50 mL tüpe aktarın ve 1x PBS ile en az 35 mL doldurun. 5 dk için 200 x g centrifuge hücreleri ve dikkatle hücre pelet rahatsız etmeden supernatant atın.
- Hücreleri bir kez daha 35 mL 1x PBS ile 200 x g.'de 5 dk. Hücreleri buzüzerine yerleştirin ve hücreleri süspansiyonda tutmak için henüz 1x PBS'yi çıkarmayın.
5. HepG2 hücrelerinin elektroporasyonu
Şekil 4: HepG2 hücrelerinin elektroporasyonu için şematik deneysel kurulum. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- HepG2 hücrelerinin elektroporasyonu için(Şekil 4)384 μL Cytomix (bkz. Tablo 1)2 mM ATP ve 5 mM Glutatyon ile tamamlayarak elektroporasyon başına 400 μL Cytomix hazırlayın. Kullanmadan hemen önce taze hazırlayın ve doğrudan buzun üzerine yerleştirin.
NOT: Aşağıdaki adımların doğru ama hızlı bir şekilde yürütülmesi çok önemlidir. Bu nedenle, her şeyin düzgün hazırlanmış olduğundan emin olun. - 4.4 adımdan hücre peletini rahatsız etmeden 1x PBS'yi dikkatlice çıkarın. Sitomixin 400 μL'lik 5 x 106 hücresini yeniden askıya alın ve adım 3.2.2'den 5 g RNA ekleyin. Bir elektroporasyon sistemi ile 975 μF, 270 V 20 ms ile bir kez 4 mm cuvette ve nabız içine çözelti aktarın.
- Elektroporasyon dan sonra bir Pasteur pipet ile mümkün olduğunca çabuk 11 mL DMEM içine elektroporasyon başına tam hücreleri transfer.
NOT: RNA'nın HepG2 hücrelerine başarılı bir şekilde aktarıldığından emin olmak için transfeksiyon kontrolü (TC) yapılacaktır. Beklenen transfeksiyon oranları ORF2-pozitif hücrelerin %40-60'ı arasında değişmektedir.
- Elektroporasyon dan sonra bir Pasteur pipet ile mümkün olduğunca çabuk 11 mL DMEM içine elektroporasyon başına tam hücreleri transfer.
- 10 mL elektroporated hücreleri kollajen kaplı 10 cm kültür çanağı içine aktarın. Bir kapak fişi taşıyan kollajen kaplı 24 mikrotitre plakanın bir kuyuya 1,3 x 105 elektroprorated hücreleri (300°L) ekleyin (daha sonra transfeksiyon kontrolü olarak kullanılır). Hücreleri eşit olarak dağıtın ve 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- 24 saat sonra, 10 cm'lik kabın ortasını değiştirin ve 10 mL taze DMEM tam ile değiştirin. Transfeksiyon kontrolünün ortamını değiştirmeyin. 37 °C'de 6 gün daha kuluçkaya yatırın.
- İmmünfloresan boyama protokolü ile devam ederek hücre yoğunluğuna bağlı olarak 24 kuyu plaka 5-7 d sonrası elektroporasyon transfeksiyon kontrolü durdurun (adım 8). Transfeksiyon verimliliği, toplam hücre sayısına normalleştirilmiş ORF2 pozitif hücre sayısı sayılarak hesaplanır.
6. Hücre içi ve hücre dışı HEVcc hasadı
Şekil 5: Hücre içi ve hücre dışı HEVcc hasat için şematik deneysel kurulum. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Ekstrasellüler HEVcc hasat için(Şekil 5),herhangi bir hücre enkaz kaldırmak için 0,45 μm örgü ile 6 gün (adım 5.3.1) sonra 10 cm çanak elde supernatant filtre. Aynı gün enfeksiyon için 4 °C'de hasat edilen ekstrasellüler HEVcc'yi saklayın, aksi takdirde -80 °C'de saklayın.
- Hücre içi HEVcc hasat etmek için(Şekil 5),hücreleri 1x PBS ile yıkayın ve %0,05 tripsin-EDTA'nın 1,5 mL'sini ekleyerek trypsine. Hücreler tamamen ayrılana kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırın. 10 mL DMEM komple ekleyin, hücreleri ayırmak için plakayı temizle ve hücreleri 50 mL tüpe aktarın. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Santrifüj 200 x g 5 dk.
- Supernatant atın ve elektroporasyon başına DMEM tam 1.6 mL hücre pelet resuspend. Hücre süspansiyonuna 2 mL reaksiyon tüpüne aktarın.
NOT: Viral yükleri önemli ölçüde azaltacağı için daha büyük hacimler kullanmayın. - Dondurun (sıvı nitrojen) ve çözülme hücreleri. Bu sırayı 3 kez tekrarlayın.
NOT: Lizis verimi bozulacağı için 3 donma ve çözülme döngüsü için birden fazla elektroporasyon (1,6 mL) havuzu yapmayın. Döngüler arasında hücre süspansiyon girdap etmeyin. Viral yükleri en üst düzeye çıkarmak için hücre süspansiyonunun yavaşça (örn. oda sıcaklığında veya buz üzerinde) çözülttünden emin olun. - Yüksek hızlı santrifüj hücre enkaz ayırmak için 10 dk 10.000 x g lysed hücreleri. Supernatant'ı yeni bir tüpe aktarın. Enfeksiyon için supernatant alın, aksi takdirde -80 °C'de saklayın.
- İsteğe bağlı olarak, viral yükleri artırmak için bir konsantratör kullanarak ekstra ve hücre içi HEVcc konsantre (üreticinin protokolüne göre).
- Supernatant atın ve elektroporasyon başına DMEM tam 1.6 mL hücre pelet resuspend. Hücre süspansiyonuna 2 mL reaksiyon tüpüne aktarın.
7. HepG2/C3A hücrelerinin hücre içi ve hücre dışı HEVcc ile enfeksiyonu
Şekil 6: HepG2/C3A hücrelerinin hücre içi ve hücre dışı HEVcc ile enfeksiyonu için şematik deneysel kurulum. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
NOT: HepG2/C3A hücrelerinin enfeksiyonu enfeksiyöz partiküllerin üretilmesini sağlayacaktır. Ayrıca, ffu/mL'deki virüs titrelerini hesaplamak için hasat edilen hücre içi ve hücre dışı HEVcc'nin titrasyonu kullanılır. Bu daha sonra enfeksiyon kontrolü (IC) olarak anılacaktır.
- HepG2/C3A hücrelerini HEVcc enfeksiyonuna hazırlamak için(Şekil 6),prewarm Minimal Essential Medium (MEM) tam (Bkz. Tablo 1) ila 37 °C.
- Tohum 2 x 104 hücreleri / iyi 100 μL üzerine kollajen kaplı 96 iyi mikrotiter plaka bir gün önce adım 6. İç 60 kuyuiçinde ortamın buharlaşmasını önlemek için en dıştaki kuyuları 1x PBS ile doldurduğunuzdan emin olun. 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
- Bir gün önce tohumlanan HepG2/C3A hücrelerine 50 μL (adım 6.1)ekleyerek hücre dışı HEVcc ile enfekte olun. Yukarı ve aşağı borular ile iyice karıştırın ve bir sonraki kuyuya 50°L aktararak 1:3'ün altı katı seri seyreltin. Teknik çoğaltmalar için seri seyreltme yinelemeleri gerçekleştirin.
- Bir gün önce tohumlanan HepG2/C3A hücrelerine 25 μL supernatant (adım 6.2.3)'den ekleyerek hücre içi HEVcc ile enfekte olun. Yukarı ve aşağı borular karıştırarak ve seri bir sonraki kuyuya 25 μL aktararak 1:5 altı kez seyreltin. Teknik çoğaltma için yinelenen seri seyreltme gerçekleştirin.
- 37 °C'de 7 d'den sonra immünoresans boyama protokolüne devam ederek enfeksiyonu durdurun (adım 8).
8. Transfeksiyon ve enfeksiyon kontrolünün immünororeskence boyama
Şekil 7: Transfeksiyon ve enfeksiyon kontrolünün immünororesans boyaması için şematik deneysel kurulum. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- İmmünofloresan boyama için(Şekil 7),3x 1x PBS ile yıkayın ve hücreleri kuyu başına %4 fiksasyon çözeltisi 350 μL (transfeksiyon kontrolü [TC]) veya 50 μL (enfeksiyon kontrolü [IC]) dağıtarak düzeltin. RT'de 15 dakika kuluçkaya yatın ve sonrasında 1x PBS ile iki kez dikkatlice yıkayın.
NOT: Protokol, HepG2/C3A hücrelerinin enfeksiyonu da durdurulana kadar transfeksiyon kontrolü için burada duraklatılabilir. 4 °C'de iyi tabak saklayın. Ayrıca buharlaşmayı önlemek için parafilm ile mühür. - HÜCRELERI RT'de 5 dk için %0,2 Triton X-100 (1× PBS olarak) 350 μL (TC) veya 50 μL (IC) ekleyerek geçirin. Daha sonra 1x PBS ile iki kez dikkatlice yıkayın ve %5 At Serumu (1x PBS içinde) ile 1 saat boyunca 1 saat boyunca orbital shaker (30 rpm) üzerinde sürekli ajitasyon altında 1 saat boyunca 350 μL (TC) veya 50 μL (IC) ile yıkayın.
NOT: Küçük plastik çanak (30 mm) içine nemli bir doku ve üstüne bir parafin film tabakası yerleştirerek hazırlayın, nemli bir oda oluşturarak. Sonra parafin filmine bakan TC kapak slip'ini aktarın. TC için aşağıdaki adımlar nemli odada yürütülecektir. - Her kuyubaşına 70 μL (TC) veya 25 μL (IC) primer antikor anti-ORF2 8282 (HEV-spesifik tavşan hiperimmün serumu,%5 At Serumunda 1:5.000) ekleyin ve bir orbital shaker (30 rpm) üzerinde sürekli ajitasyon altında gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatın.
- 1x PBS ile iki kez dikkatlice yıkayın ve 70 μL (TC) veya 25 μL (IC) sekonder antikor anti-tavşan 488 (1:1,000% 5 At serumu) ekleyin. Karanlıkta bir orbital shaker (30 rpm) üzerinde sürekli ajitasyon altında 1 saat için kuluçka. Yine, 1x PBS ile iki kez dikkatlice yıkayın
- DAPI'den 70 μL (TC) veya 25 μL (IC) ekleyin (H2O'da 1:10.000) ve 1 dk. H2O ile iki kez dikkatlice yıkayın. Kapak kapağını nemli hazneden çıkar, 6 μL'lik montaj reaktifini bir kapak kaydırağında ters çevirin (sadece TC için) kapatın ve montaj reaktifinin karanlıkta RT'de 16 saat kurumasını bekleyin. Ic'i görüntülemeye kadar suda saklayın ve buharlaşma nedeniyle kurumasını önlemek için plakayı parafin filmle kapatın.
- Başarılı transfeksiyon ve enfeksiyonu doğrulamak için fotoğraf alın.
NOT: Karşılaştırılabilir sonuçlar, ticari olarak mevcut olan anti-ORF2 1E6 antikor57 (%5 At serumunda 1:200) ve ikincil bir antikor eşek anti-faresi (% 5 At serumunda 1:1.000) kullanılarak elde edilebildi.
9. FFU tayini
NOT: Bir FFU, bir veya daha fazla ORF2 pozitif hücre olarak tanımlanır ve başka bir FFU'dan en az üç negatif hücre ayrılır.
- Ekstrasellüler HEVcc için iki en düşük seyreltme iki kuyunun tüm ORF2-pozitif odak ları saymaya başlar. Toplam dört kuyu sayılmalıdır. Mililitre başına odak şekillendirme birimleri (FFU) aşağıdaki denklemle hesaplanabilir:
NOT: Beklenen titreler 102 ile 5 x 104 FFU/mL arasında değişir. - Hücre içi HEVcc için 50 ila 100 foci gözlenen kuyularda tüm ORF2-pozitif foci saymaya başlar. Ayrıca, sonraki yüksek seyreltme iki kuyu saymak. Toplam dört kuyu sayılmalıdır. Mililitre başına odak şekillendirme birimleri (FFU) aşağıdaki denklemle hesaplanabilir:
NOT: Beklenen titreler 105 ile 3 x 106 FFU/mL arasında değişir. 20x ve 40x faktörleri 50 μL başına FFU ve 25 μL ile 1 mL arasında tahmin etmek için kullanılır ve buna göre uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde, yüksek titreen enfeksiyöz HEVcc üretimini açıklıyoruz. İlk adım plazmid DNA izole etmektir (pBluescript_SK_HEVp654 ve pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Şekil 8a), daha sonra kısıtlama sindirim tarafından doğrusallaştırılmış ve in vitro transkripsiyon için saflaştırılmış (Şekil 1). Başarılı bir doğrusallaştırma jel elektroforez kullanılarak sindirilmiş olmayan plazmid-DNA ile sindirilmiş plazmid-DNA karşılaştırılarak doğrulanabilir. Boyut değişimine ek olarak, doğrusal formu temsil eden tek bir DNA bandı görünür olmalıdır. Doğrusallaştırma, doğrusal formun üstündeki ve altındaki diğer iki bant, sırasıyla çentikli daireyi ve süper kıvrılmış formu temsil ettiğinde tamamen azalır(Şekil 8b). Saflaştırılmış DNA'nın verimi 150 ng/μL'yi aşmalıdır. Sadece bu özellikler doğrusal tutarsa doğrusallaştırılmış DNA in vitro transkripsiyon için kullanılmalıdır. In vitro transkripsiyonu RNA jel elektroforez kullanılarak kontrol edilmeli ve düşük RNase bolluğu durumunda bulanık yayma yerine farklı bantlar gösterilmelidir(Şekil 8c). Ayrıca, saflaştırılmış RNA verimi 500 ng/μL'yi aşmalıdır In vitro transkripsiyonu RNA(Şekil 2) sonunda virüs üretimi için HepG2 hücrelerine elektroporated(Şekil 3 ve Şekil 4). Başarılı elektroporasyon transfeksiyon kontrolünün immünororesans boyama sı tarafından izlenir (Şekil 9a). Transfeksiyon verimi %40'ı aşmalıdır(Şekil 9b). Bir çoğaltma eksik mutant negatif bir kontrol olarak hizmet vermektedir, ORF2 boyama özgüllüğünü sağlamak için, hiçbir ORF2 ifade beklendiği gibi(Şekil 9c). Kuluçka 7 gün sonra zarflı (hücre dışı) HEVcc toplanıp hücre kültürü supernatant filtrelenerek hasat edilir. Zarfsız (hücre içi) HEVcc birkaç donma ve çözülme döngüleri ile hücrelerden serbest bırakılır. Herhangi bir hücre enkazkaldırmak için hücre lysate yüksek hızda santrifüj edilir (Şekil 5). Daha sonra, her iki HEVcc türü de HepG2/C3A hücrelerini seri seyreltme ile enfekte etmek için kullanılır (Şekil 6 ve Şekil 9d). Yukarıdaki denklemlere göre (bkz. adım 9) viral titreler FFU hesaplaması ile belirlenir.
Temsili sonuçlar Şekil 9'dagösterilmiştir. Transfeksiyon kontrolü, etkili miktarda virüs üretildiğini garanti etmek için yaklaşık %50 ORF2 pozitif hücrelerden oluşmalıdır(Şekil 9a,b). Orf2 pozitif hücreler ne kadar az olursa titre o kadar düşük olur. Protokolde belirtilen adımları tam olarak takip etmek, zarfsız (hücre içi) HEVcc için 105 ile 3 x 106 FFU/mL arasında değişen titreler oluşturur. Zarflı (hücre dışı) HEVcc titreleri için 102 ile 5 x104 FFU/mL arasında beklenir(Şekil 9e). Ayrıca G1634R mutantı için yüksek FFU sayıları gözlendi. Genom kopyaları ile enfeksiyöz viral partiküller arasındaki oran hesaplanırken hem p6_WT hem de p6_G1634R için üretilen hücre içi HEVcc'nin hücre dışı HEVcc'ye göre daha düşük olduğu saptandı ve bu da zarfsız HEV türlerinin daha yüksek spesifik bir enfekteolduğunu düşündürmektedir(Şekil 9f).
Şekil 8: In vitro transkripsiyonu RNA üretimi.
(A) İzole Plazmid-DNA emici spektrum örneği. (B) Sindirilmemiş ve sindirilmiş Plazmid-DNA'nın jel elektroforezi. (C) In vitro transkripsiyonu RNA jel elektroforezi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Yüksek titre HEVcc üretiminin temsili sonuçları.
(A) Elektroporated HepG2 hücrelerinin transfeksiyon kontrolü. Transfected hücreler anti-ORF2 antikor (yeşil, LS-Bio) ve DAPI (mavi) ile boyandı. (B) Transfeksiyon verimi, normalleştirilen ORF2 pozitif hücre sayısına göre hesaplanmıştır. (C) Bir çoğaltma eksikliği mutant immünororesans boyama için negatif bir kontrol olarak hizmet vermektedir, ORF2 özgüllüğünü sağlamak için. (D) FFU tayini için üretilen virüs stoklarının seri seyreltmeleri yapıldı. ORF2 pozitif hücreler beyaz olarak gösterilmiştir. (E) Viral titreler FFU sayımı ile hesaplandı ve (F) viral yükler qPCR ile belirlendi ve FFU/mL olarak normalleştirildi. Çubuklar, sırasıyla 38 ve 10 bağımsız deneyin ortalama ve standart sapması gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Çalışma çözümü | Konsantrasyon | Birim |
| Kollajen | 40 mL | Pbs |
| 40 μl | Asetik asit | |
| 1 mL | Kollajen R çözeltisi %0.4 steril | |
| Sitomix | 120mm | Kartal |
| 0,15 mM | CaCl2 | |
| 10 mM | K2HPO4 (pH 7.4) | |
| 25mm | HEPES | |
| 2 mM | EGTA | |
| DMEM tamamlandı | 500 mL | DMEM |
| 5 mL | Kalem/Strep | |
| 5 mL | MEM NEAA (100X) | |
| 5 mL | L-Glutamin | |
| 50 mL | Fetal sığır serumu | |
| MEM tamamlandı | 500 mL | Mem |
| 5 mL | Sodyum Piruvat | |
| 5 mL | Gentamisin | |
| 5 mL | MEM NEAA (100X) | |
| 5 mL | L-Glutamin | |
| 50 mL | ultra düşük IgG |
Tablo 1: Arabellek Kompozisyon tablosu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plazmid hazırlığından başlayarak, aynı plazmid stoğundan birden fazla doğrusallaştırma yapabilmek için DNA verimleri 150 ng/μL'yi aşmalıdır, bu da önemli genom dizilerinin bakteri kaynaklı mutagenezi riskini en aza indirir. Ayrıca jel elektroforezi ile komple plazmid linelizasyonu için restriksiyon sindiriminin kontrol etmek önemlidir (Şekil 8b). Lineerleştirilmiş plazmid DNA eksikliği in vitro transkripsiyon daha az verimli neden haddeleme daire amplifikasyon neden olur. Buna ek olarak, RNA bütünlüğü örnek içinde RNas bolluğunu değerlendirmek için teyit edilmelidir (Şekil 8c). Ancak o zaman hedef hücrelerin bir elektroporasyon düşünülmelidir. Not, HepG2 hücrelerinin hazırlanması ile başlamadan önce, her şeyin elinizin altında olduğundan ve uzun bekleme sürelerinden kaçınarak iyi hazırlanmış olduğundan emin olun. Özellikle, elektroporasyon kadar Cytomix hücrelerin ve RNA kısa süreli depolama sağlamak. Elektroporasyon sırasında hücrelerin ısınmasını atlatmak için önceden buz üzerinde tampon soğutmak için esastır. Nabız süresi 20-25 ms ve 270 V'yi geçmemelidir. Elektroporasyondan sonra hücreler hücre canlılığını sağlamak için taze ortama hızlı bir şekilde aktarılmasını gerektirir. Hedef hücrelerin enfeksiyon önce, TC ORF2-pozitif hücrelerin yüzdesi için kontrol edilmelidir. TC'nin ORF2 pozitif hücre göstermesi durumunda elektroporasyonun başarısız olması veya boyamanın işe yaramaması muhtemeldir ve deney tekrarlanmalıdır.
Hücre içi HEVcc hasat ederken donma ve çözülme döngülerinin hızına özel dikkat edilmelidir. Viral titreler -80 °C yerine sıvı nitrojende donma işlemi gerçekleştirilerek artırılabilir. Tam tersine, erime, hücre süspansiyonu tamamen tasfiye edilene kadar buz üzerinde depolanmasını öneren mümkün olan en yavaş şekilde gerçekleşmelidir. Bununla birlikte, 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde veya su banyosunda hücre süspansiyonunun oda sıcaklığında çözülmesi de mümkündür, ancak erime ne kadar hızlı olursa titreler o kadar azalır.
Aşağıdaki deneylere bağlı olarak, mem tam veya 1x PBS'de, viral titrelerin dramatik kaybı olmadan donma ve çözülme döngülerinin yapılması da mümkündür, ancak bunun hücre dışı HEVcc'nin hücre içi HEVcc'den farklı bir ortamda olmasına neden olduğu unutulmamalıdır.
Protokolün bu önemli adımlarını takiben, zarfsız (hücre içi) HEVcc için beklenen titreler 105 ile 3 x 106 FFU/mL arasında değişir. Zarflı (hücre dışı) HEVcc titreleri için 102 ve 5 x 104 FFU/mL arası heVcc titreleri beklenilir (Şekil 9e). Şimdiye kadar HEV hücre kültür sistemlerinin istihdamı ile ilgili çalışmalar ağırlıklı olarak qPCR tarafından viral replikasyon ve yayılmayı izlemektedir. RNA genom kopyalarının değerlendirilmesi henüz enfeksiyöz parçacıkların toplanması ve salınımı hakkında hiçbir fikir sağlamaz.
Bir önceki çalışmada58 başarıyla yayılan hasta hücre kültüründe maksimum titreleri ile izole 103 TCID50/mL. Son zamanlarda gösterildiği gibi, hücre kültüründe HEVcc'yi başarıyla geçiş yapmak ve protokolümüzü hiperdeğişken bölgede bir ekleme barındırmayan 47832c ve 83-2 gibi diğer suşlara uyarlamak da mümkündür56. Ayrıca, hasta türetilmiş dizileri Bluescript vektör omurga içine klonlanmış olabilir ve hala yüksek viral titre verim test edilmedi. Tanıtılan yöntemle, zarflı ve zarflı viral parçacıklar hasat edilebilir ve A549, Huh7.5, Jeg-3 ve birincil insan ve domuz hepatositleri gibi çeşitli naif hücre hatları aşılamak için kullanılabilir, HEV tropizm, patogenez, ilaç geliştirme, viral ve konak etkileşimleri, inaktivasyon çalışmaları, nötralize ve daha birçok gibi gelecekteki uygulamalar için bir fayda sağlayan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz hepatit E virüs p6 klon için Suzanne Emerson için müteşekkiriz. HEV'ye özgü tavşan hiperimmün serumu Almanya Friedrich Loeffler Enstitüsü'nde Rainer Ulrich tarafından sağlandı. Ayrıca Ruhr Üniversitesi Bochum Moleküler ve Tıbbi Viroloji Bölümü'nün tüm üyelerine destek ve tartışmaları için teşekkür ederiz. Şekil 1-7 BioRender.com ile oluşturuldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm mesh | Sarstedt | 83.1826 | Harvest extracellular Virus |
| 4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | Immunofluorescence |
| Acetic acid | CarlRoth | 6755.1 | Collagen working solution |
| Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | Virus harvesting |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | Selection of transformed bacteria |
| ATP | Roche | 11140965001 | in vitro transcription and electroporation |
| BioRender | BioRender | Figure Generation | |
| CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
| Collagen R solution 0.4 % sterile | Serva | 47256.01 | Collagen working solution |
| CTP | Roche | 11140922001 | in vitro transcription |
| Cuvette | Biorad | 165-2088 | Electroporation |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | Immunofluorescence |
| DMEM | gibco | 41965-039 | Cell culture |
| DNAse | Promega | M6101 | in vitro transcription |
| DTT | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
| Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformation |
| Fetal bovine serum | gibco | 10270106 | Cell culture |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Immunofluorescence |
| GenePulser Xcell Electroporation System | BioRad | 1652660 | Electroporation |
| Gentamycin | gibco | 15710049 | Cell culture |
| GTP | Roche | 11140957001 | in vitro transcription |
| H2O | Braun | 184238001 | Immunofluorescence |
| Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
| Horse serum | gibco | 16050122 | Immunofluorescence |
| K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
| KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
| L-Glutamin | gibco | 25030081 | Cell culture |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
| MEM | gibco | 31095-029 | Cell culture |
| MEM NEAA (100×) | gibco | 11140-035 | Cell culture |
| MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
| Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA concentration |
| MluI enzyme | NEB | R0198L | Linearization |
| NEB buffer | NEB | included in R0198L | Linearization |
| NucleoSpin Plasmid kit | Macherey & Nagel | 740588.250 | Plasmid preparation |
| NucleoSpin RNA Clean-up Kit | Macherey & Nagel | 740948.250 | RNA purification |
| PBS | gibco | 70011051 | Cell culture |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Cell culture |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) | Todt et.al | Virus production | |
| Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) | Shukla et al. | GenBank accession no. JQ679013 | Virus production |
| Primary antibody 1E6 | LS-Bio | C67675 | Immunofluorescence |
| Primary antibody 8282 | Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | DNA extraction |
| Ribo m7G Cap Analog | Promega | P1711 | in vitro transcription |
| RNase away | CarlRoth | A998.3 | RNA purification |
| RNasin (RNase inhibitor) | Promega | N2515 | in vitro transcription |
| Secondary antibody donkey anti-mouse 488 | Thermo Fisher | A-21202 | Immunofluorescence |
| Secondary antibody goat anti-rabbit 488 | Thermo Fisher | A-11008 | Immunofluorescence |
| Sodium Pyruvat | gibco | 11360070 | Cell culture |
| T7 RNA polymerase | Promega | P2077 | in vitro transcription |
| Transcription Buffer | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
| Triton X-100 | CarlRoth | 3051.3 | Immunofluorescence |
| Trypsin-EDTA (0.5 %) | gibco | 15400054 | Cell culture |
| ultra-low IgG | gibco | 1921005PJ | Cell culture |
| UTP | Roche | 11140949001 | in vitro transcription |
References
- Wedemeyer, H., Pischke, S., Manns, M. P. Pathogenesis and treatment of hepatitis e virus infection. Gastroenterology. 142 (6), 1388-1397 (2012).
- Smith, D. B., et al. Proposed reference sequences for hepatitis E virus subtypes. The Journal of General Virology. 97 (3), 537-542 (2016).
- Ding, Q., et al. Hepatitis E virus ORF3 is a functional ion channel required for release of infectious particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (5), 1147-1152 (2017).
- Chapuy-Regaud, S., et al. Characterization of the lipid envelope of exosome encapsulated HEV particles protected from the immune response. Biochimie. 141, 70-79 (2017).
- Yin, X., Ambardekar, C., Lu, Y., Feng, Z. Distinct Entry Mechanisms for Nonenveloped and Quasi-Enveloped Hepatitis E Viruses. Journal of Virology. 90 (8), 4232-4242 (2016).
- Khuroo, M. S., Khuroo, M. S., Khuroo, N. S. Hepatitis E: Discovery, global impact, control and cure. World Journal of Gastroenterology. 22 (31), 7030-7045 (2016).
- Rasche, A., et al. Hepatitis E Virus Infection in Dromedaries, North and East Africa, United Arab Emirates, and Pakistan, 1983-2015. Emerging Infectious Diseases. 22 (7), 1249-1252 (2016).
- Hsieh, S. Y., et al. Identity of a novel swine hepatitis E virus in Taiwan forming a monophyletic group with Taiwan isolates of human hepatitis E virus. Journal of Clinical Microbiology. 37 (12), 3828-3834 (1999).
- Johne, R., et al. Detection of a novel hepatitis E-like virus in faeces of wild rats using a nested broad-spectrum RT-PCR. The Journal of General Virology. 91, Pt 3 750-758 (2010).
- Payne, C. J., Ellis, T. M., Plant, S. L., Gregory, A. R., Wilcox, G. E. Sequence data suggests big liver and spleen disease virus (BLSV) is genetically related to hepatitis E virus. Veterinary Microbiology. 68 (1-2), 119-125 (1999).
- Haqshenas, G., Shivaprasad, H. L., Woolcock, P. R., Read, D. H., Meng, X. -J. Genetic identification and characterization of a novel virus related to human hepatitis E virus from chickens with hepatitis–splenomegaly syndrome in the United States. Journal of General Virology. 82, 2449-2462 (2001).
- Tei, S., Kitajima, N., Takahashi, K., Mishiro, S. Zoonotic transmission of hepatitis E virus from deer to human beings. The Lancet. 362 (9381), 371-373 (2003).
- Nakamura, M., et al. Hepatitis E virus infection in wild mongooses of Okinawa, Japan: Demonstration of anti-HEV antibodies and a full-genome nucleotide sequence. Hepatology Research: the Official Journal of the Japan Society of Hepatology. 34 (3), 137-140 (2006).
- Drexler, J. F., et al. Bats worldwide carry hepatitis E virus-related viruses that form a putative novel genus within the family Hepeviridae. Journal of Virology. 86 (17), 9134-9147 (2012).
- Zhao, C., et al. A novel genotype of hepatitis E virus prevalent among farmed rabbits in China. Journal of Medical Virology. 81 (8), 1371-1379 (2009).
- Lhomme, S., et al. Risk of zoonotic transmission of HEV from rabbits. Journal of Clinical Virology: the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 58 (2), 357-362 (2013).
- Kaci, S., Nöckler, K., Johne, R. Detection of hepatitis E virus in archived German wild boar serum samples. Veterinary Microbiology. 128 (3-4), 380-385 (2008).
- Liu, B., et al. Avian hepatitis E virus infection of duck, goose, and rabbit in northwest China. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 76 (2018).
- Raj, V. S., et al. Novel hepatitis E virus in ferrets, the Netherlands. Emerging Infectious Diseases. 18 (8), 1369-1370 (2012).
- Dong, C., et al. Restricted enzooticity of hepatitis E virus genotypes 1 to 4 in the United States. Journal of Clinical Microbiology. 49 (12), 4164-4172 (2011).
- Goens, S. D., Perdue, M. L. Hepatitis E viruses in humans and animals. Animal Health Research Reviews. 5 (2), 145-156 (2004).
- Geng, Y., Wang, Y. Transmission of Hepatitis E Virus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 948, 89-112 (2016).
- Naik, S. R., Aggarwal, R., Salunke, P. N., Mehrotra, N. N. A large waterborne viral hepatitis E epidemic in Kanpur, India. Bulletin of the World Health Organization. 70 (5), 597-604 (1992).
- Feagins, A. R., Opriessnig, T., Guenette, D. K., Halbur, P. G., Meng, X. -J. Detection and characterization of infectious Hepatitis E virus from commercial pig livers sold in local grocery stores in the USA. The Journal of General Virology. 88, Pt 3 912-917 (2007).
- Colson, P., et al. Pig liver sausage as a source of hepatitis E virus transmission to humans. The Journal of Infectious Diseases. 202 (6), 825-834 (2010).
- Wenzel, J. J., et al. Detection of hepatitis E virus (HEV) from porcine livers in Southeastern Germany and high sequence homology to human HEV isolates. Journal of Clinical Virology: the Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 52 (1), 50-54 (2011).
- Colson, P., et al. Transfusion-associated Hepatitis E, France. Emerging Infectious Diseases. 13 (4), 648-649 (2007).
- Kamp, C., et al. Impact of hepatitis E virus testing on the safety of blood components in Germany - results of a simulation study. Vox Sanguinis. , (2018).
- Kamar, N., Dalton, H. R., Abravanel, F., Izopet, J. Hepatitis E virus infection. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 116-138 (2014).
- Pischke, S., Behrendt, P., Manns, M. P., Wedemeyer, H. HEV-associated cryoglobulinaemia and extrahepatic manifestations of hepatitis E. The Lancet Infectious Diseases. 14 (8), 678-679 (2014).
- Colson, P., et al. Severe thrombocytopenia associated with acute hepatitis E virus infection. Journal of Clinical Microbiology. 46 (7), 2450-2452 (2008).
- Mishra, P., Mahapatra, M., Kumar, R., Pati, H. P. Autoimmune hemolytic anemia and erythroid hypoplasia associated with hepatitis E. Indian Journal of Gastroenterology: Official Journal of the Indian Society of Gastroenterology. 26 (4), 195-196 (2007).
- Sood, A., Midha, V., Sood, N. Guillain-Barré syndrome with acute hepatitis E. The American Journal of Gastroenterology. 95 (12), 3667-3668 (2000).
- Fousekis, F. S., Mitselos, I. V., Christodoulou, D. K. Extrahepatic manifestations of hepatitis E virus: An overview. Clinical and Molecular Hepatology. 26 (1), 16-23 (2020).
- Pischke, S., et al. Ribavirin treatment of acute and chronic hepatitis E: A single-centre experience. Liver International: Official Journal of the International Association for the Study of the Liver. 33 (5), 722 (2013).
- Kamar, N., et al. Ribavirin for Chronic Hepatitis E Virus Infection in Transplant Recipients. The New England Journal of Medicine. 370, 1111-1120 (2014).
- Todt, D., et al. In vivo evidence for ribavirin-induced mutagenesis of the hepatitis E virus genome. Gut. 65, 1733-1743 (2016).
- Todt, D., Walter, S., Brown, R. J. P., Steinmann, E. Mutagenic Effects of Ribavirin on Hepatitis E Virus-Viral Extinction versus Selection of Fitness-Enhancing Mutations. Viruses. 8 (10), 8100283 (2016).
- Todt, D., Meister, T. L., Steinmann, E. Hepatitis E virus treatment and ribavirin therapy: Viral mechanisms of nonresponse. Current Opinion in Virology. 32, 80-87 (2018).
- Kamar, N., et al. Ribavirin for Hepatitis E Virus Infection After Organ Transplantation: A Large European Retrospective Multicenter Study. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. , (2019).
- Kamar, N., et al. Influence of immunosuppressive therapy on the natural history of genotype 3 hepatitis-E virus infection after organ transplantation. Transplantation. 89 (3), 353-360 (2010).
- Kamar, N., et al. Pegylated interferon-alpha for treating chronic hepatitis E virus infection after liver transplantation. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 50 (5), 30-33 (2010).
- Todt, D., et al. Antiviral Activities of Different Interferon Types and Subtypes against Hepatitis E Virus Replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (4), 2132-2139 (2016).
- Dao Thi, V. L., et al. Sofosbuvir Inhibits Hepatitis E Virus Replication In Vitro and Results in an Additive Effect When Combined with Ribavirin. Gastroenterology. 150 (1), 82-85 (2016).
- van der Valk, M., Zaaijer, H. L., Kater, A. P., Schinkel, J. Sofosbuvir shows antiviral activity in a patient with chronic hepatitis E virus infection. Journal of Hepatology. 66 (1), 242-243 (2017).
- Kaushik, N., et al. Zinc Salts Block Hepatitis E Virus Replication by Inhibiting the Activity of Viral RNA-Dependent RNA Polymerase. Journal of Virology. 91 (21), (2017).
- Todt, D., et al. The natural compound silvestrol inhibits hepatitis E virus (HEV) replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 157, 151-158 (2018).
- Glitscher, M., et al. Inhibition of Hepatitis E Virus Spread by the Natural Compound Silvestrol. Viruses. 10 (6), 301 (2018).
- Kinast, V., Burkard, T. L., Todt, D., Steinmann, E. Hepatitis E Virus Drug Development. Viruses. 11 (6), 485 (2019).
- Schemmerer, M., et al. Enhanced Replication of Hepatitis E Virus Strain 47832c in an A549-Derived Subclonal Cell Line. Viruses. 8 (10), 267 (2016).
- Huang, R., et al. Cell Culture of Sporadic Hepatitis E Virus in China. Clinical and Vaccine Immunology. 6 (5), 729-733 (1999).
- Emerson, S. U., et al. Recombinant hepatitis E virus genomes infectious for primates: Importance of capping and discovery of a cis-reactive element. PNAS. 98 (26), 15270-15275 (2001).
- Shukla, P., et al. Cross-species infections of cultured cells by hepatitis E virus and discovery of an infectious virus-host recombinant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2438-2443 (2011).
- Shukla, P., et al. Adaptation of a genotype 3 hepatitis E virus to efficient growth in cell culture depends on an inserted human gene segment acquired by recombination. Journal of Virology. 86 (10), 5697-5707 (2012).
- Meister, T. L., Bruening, J., Todt, D., Steinmann, E. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Research. 163, 34-49 (2019).
- Todt, D., et al. Robust hepatitis E virus infection and transcriptional response in human hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2020).
- Ankavay, M., et al. New insights into the ORF2 capsid protein, a key player of the hepatitis E virus lifecycle. Scientific Reports. 9 (1), 6243 (2019).
- Schemmerer, M., Johne, R., Erl, M., Jilg, W., Wenzel, J. J. Isolation of Subtype 3c, 3e and 3f-Like Hepatitis E Virus Strains Stably Replicating to High Viral Loads in an Optimized Cell Culture System. Viruses. 11 (6), 483 (2019).
