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Neuroscience

वयस्क और उम्र बढ़ने चूहों से हिप्पोकैम्पस स्लाइस में हाइपोक्सिया को कम करना

Published: July 2, 2020 doi: 10.3791/61377
Automatic Translation
1
1Department of Biology, Neurobiology, and Bio-X, Stanford University

Summary

यह वयस्क और उम्र बढ़ने माउस हिप्पोकैम्पी से तीव्र टुकड़ा तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल है जो ऊतक को हाइपोक्सिक क्षति को कम करने के लिए बर्फ-ठंडे एनएमडीजी-एसीएसएफ के साथ ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन और स्लाइस कटिंग का लाभ उठाता है। जिसके परिणामस्वरूप स्लाइस कई घंटों में स्वस्थ रहते हैं, और दीर्घकालिक पैच-क्लैंप और फील्ड-रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त हैं।

Abstract

तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस ने न्यूरोसाइंटिस्टों की पीढ़ियों को विस्तार से और उच्च निष्ठा के साथ सिनैप्टिक, न्यूरोनल और सर्किट गुणों का पता लगाने में सक्षम बनाया है। एलटीपी और लिमिटेड तंत्र, एकल न्यूरॉन डेंड्रिटिक गणना, और सर्किटरी में अनुभव पर निर्भर परिवर्तन की खोज, इस शास्त्रीय तैयारी के बिना संभव नहीं होता। हालांकि, कुछ अपवादों के साथ, तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस का उपयोग करके सबसे बुनियादी शोध अपेक्षाकृत युवा उम्र, ~ P20-P40 के कृंतक से स्लाइस का उपयोग करके किया गया है, भले ही सिनैप्टिक और आंतरिक उत्तेजना तंत्र में एक लंबी विकासात्मक पूंछ होती है जो पिछले P60 तक पहुंचती है। युवा हिप्पोकैम्पस स्लाइस का उपयोग करने की मुख्य अपील हाइपोक्सिक क्षति के लिए उच्च सहिष्णुता द्वारा सहायता प्राप्त न्यूरोनल स्वास्थ्य का संरक्षण है। हालांकि, विकास के अधिक परिपक्व चरणों में न्यूरोनल फ़ंक्शन को समझने की आवश्यकता है, न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के विभिन्न पशु मॉडलों के विकास से आगे बढ़ना है जिसके लिए एक उम्र बढ़ने वाले मस्तिष्क की तैयारी की आवश्यकता होती है। यहां हम एक तीव्र हिप्पोकैम्पल स्लाइस तैयारी में एक संशोधन का वर्णन करते हैं जो मज़बूती से वयस्क और उम्र बढ़ने वाले माउस हिप्पोकैम्पी से स्वस्थ स्लाइस बचाता है। प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन और बर्फ-ठंडे सोडियम-मुक्त एनएमडीजी-एएससीएफ के साथ काटने हैं । साथ में, ये कदम एटीपी में हाइपोक्सिया-प्रेरित ड्रॉप को डेपुटेशन पर क्षीण करते हैं, साथ ही निष्क्रिय सोडियम फ्लक्स के कारण साइटोटॉक्सिक एडेमा भी। हम एक कंपन माइक्रोटॉम का उपयोग करके हिप्पोकैम्पस प्लस कॉर्टेक्स के ट्रांसवर्सल स्लाइस को कैसे काटते हैं, यह प्रदर्शित करते हैं। इस तरह से प्राप्त तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस रिकॉर्डिंग के कई घंटों में मज़बूती से स्वस्थ हैं, और फ्लोरोसेंटली लेबल न्यूरॉन्स को लक्षित करने सहित क्षेत्र-रिकॉर्डिंग और लक्षित पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग दोनों के लिए उपयुक्त हैं।

Introduction

स्तनधारी तीव्र मस्तिष्क के टुकड़े की तैयारी के आगमन ने सेलुलर और सिनैप्टिक स्तर पर प्रयोगों को सुगम बनाया जो पहले केवल एपलिसिया1जैसी अकशेरुकी तैयारी में ही संभव थे । तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस का विकास विशेष महत्व का था, क्योंकि यह काम करने वाली स्मृति और संदर्भ गठन के लिए जिम्मेदार संरचना है, और इसमें एक विशेष त्रि-सिनैप्टिक सर्किटरी है जो आसान शारीरिक हेरफेर के लिए उत्तरदायी है। हालांकि, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस का विशाल बहुमत अभी भी अपेक्षाकृत युवा चूहों और चूहों से तैयार किया जाता है, क्योंकि स्वस्थ न्यूरॉन्स और सर्किट को संरक्षित करना आसान होता,है, और स्लाइस2,3,,4के लंबे समय तक व्यवहार्य रहते हैं। यहां, हम मानक स्लाइसिंग प्रोटोकॉल में संशोधन पेश करते हैं जिसके परिणामस्वरूप वयस्क और उम्र बढ़ने वाले चूहों से तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस की व्यवहार्यता में वृद्धि होती है।

स्तनधारी मस्तिष्क परेन्चिमा के दीर्घकालिक पूर्व वीवो व्यवहार्यता के लिए प्रमुख बाधा प्रारंभिक हाइपोक्सिक क्षति है जो तेजी से होती है एक बार मस्तिष्क में रक्त प्रवाह डेपुटेशन के बाद बंद हो जाता है। ऑक्सीजन की हानि के परिणामस्वरूप मस्तिष्क में प्रमुख ऊर्जा संसाधनों की तेजी से मेटाबोलिक खपत होती है, जिसमें फॉस्फो-क्रिएटिन (पी-क्रिएटिन) का नुकसान सबसे तेजी से होता है, इसके बाद ग्लूकोज, एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी), और ग्लाइकोजन4। मस्तिष्क स्लाइस के दीर्घकालिक स्वास्थ्य के लिए एटीपी का संरक्षण विशेष महत्व रखता है, क्योंकि ना-के एटीपी के माध्यम से झिल्ली की क्षमता को बनाए रखने के लिए एटीपी की आवश्यकता होती है, और परिणामस्वरूप तंत्रिका गतिविधि5,,6। वयस्क कृंतक मस्तिष्क में एटीपी स्तर ~ 2.5 mM है, और यह लगभग 1 मिनट के बाद डेपुटेशन4,,7,8 पर बेसल स्थिर स्थिति (~ 0.5 m M) तक पहुंचने के लिए 20 एस डेपुटेशन के भीतर तेज़ी सेगिरताहै।, युवा जानवरों में, एटीपी (~ 2 मिनट) में एक ही बूंद का निरीक्षण करने में अधिक समय लगता है; फेनोबार्बिटल एनेस्थीसिया के साथ यह आगे 4 मिनट4को धीमा है . इन बातों से पता चलता है कि एटीपी और अन्य ऊर्जा संसाधनों के नुकसान को रोकने के लिए मस्तिष्क को हाइपोक्सिक क्षति को रोकने के लिए एक आवश्यक रणनीति है और बदले में समय की लंबी अवधि में मस्तिष्क स्लाइस के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए, विशेष रूप से वयस्क जानवरों में ।

कम तापमान मेटाबॉलिज्म को धीमा कर देता है। नतीजतन, यह प्रदर्शित किया गया है कि मामूली हाइपोथर्मिया मस्तिष्क ऊर्जा भंडार की रक्षा करता है: युवा जानवरों में, शरीर के तापमान को छह डिग्री से कम करना, 37 डिग्री सेल्सियस से 31 डिग्री सेल्सियस तक, एटीपी स्तर को नियंत्रित हाइपोक्सिया 9 के 4 घंटे से अधिक सामान्य स्तर के लगभग 80% तक बरकराररखताहै। पी-क्रिएटिन का स्तर इसी तरह संरक्षित है, साथ ही समग्र फॉस्फोरिलेशन संभावित9। इससे पता चलता है कि डेपुटेशन से पहले शरीर के तापमान को कम करना न्यूरोप्रोटेक्टिव हो सकता है, क्योंकि एटीपी के लगभग सामान्य स्तर को स्लाइस कटिंग और स्लाइस रिकवरी पीरियड के माध्यम से बनाए रखा जा सकता है।

इस डिग्री के लिए कि एटीपी ड्रॉप को पूरी तरह से डेपुटेशन पर रोका नहीं जा सकता है, ना-के ATPase के आंशिक रूप से बिगड़ा हुआ कार्य की उम्मीद है, जिसके बाद निष्क्रिय सोडियम प्रवाह के माध्यम से depolarization होता है। चूंकि निष्क्रिय सोडियम प्रवाह कोशिकाओं में पानी के प्रवेश के बाद होता है, यह साइटोटॉक्सिक एडेमा और अंततः पाइक्नोसिस का कारण बनता है। वयस्क चूहों में, स्लाइस-कटिंग समाधानों में सुक्रोज के साथ ना + आयनों की जगह साइटोटॉक्सिक एडेमा10, 11,11के बोझ को कम करने के लिए एक सफल रणनीति रही है। हाल ही में, सोडियम चैनल पारगम्यता12 को कम करने वाले मिथाइलेटेड कार्बनिक cations ने सुक्रोज की तुलना में अधिक प्रभावी सुरक्षा प्रदान करने के लिए दिखाया है, विशेष रूप से वयस्क चूहों से स्लाइस में, एन-मिथाइल-डी-ग्लूकामाइन (एनएमडीजी) के साथ विभिन्न उम्र और मस्तिष्क क्षेत्रों में सबसे व्यापक रूप से लागू किया जा रहा है13,,14,15,,16।,

कई मस्तिष्क-टुकड़ा करने की क्रिया प्रोटोकॉल में केवल स्लाइस-कटिंग चरण के दौरान ठंडे तापमान का उपयोग करना शामिल है, कभी-कभी ना+ आयन प्रतिस्थापन रणनीति16,,17के संयोजन में। युवा जानवरों में, ये प्रोटोकॉल पर्याप्त न्यूरोप्रोटेक्शन प्रदान करते हैं क्योंकि दिमाग को डेपुटेशन के बाद जल्दी निकाला जा सकता है क्योंकि खोपड़ी अभी भी पतली है और3को हटाने में आसान है। हालांकि, यह रणनीति वयस्क जानवरों से स्वस्थ स्लाइस का उत्पादन नहीं करती है। समय के साथ, वयस्क कृंतक का अध्ययन करने वाली कई प्रयोगशालाओं ने जानवर के शरीर के तापमान को कम करने के लिए बर्फ-ठंडे समाधान के साथ ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन शुरू किया है, और इसलिए काटना से पहले मस्तिष्क को हाइपोक्सिक क्षति। इस प्रक्रिया को सफलतापूर्वक सेरिबेलर स्लाइस 18,, मिडब्रेन स्लाइस19, नियोकॉर्टिकल स्लाइस11, 20,पेरिहिनल कॉर्टेक्स21,रैटिकैंपस10,22,,2023,घ्राण बल्ब 24 , वेंट्रल स्ट्रीटम25, विज़ुअल कॉर्टेक्स26का उत्पादन करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था ।2226

चूहों में चूहे और कुछ मस्तिष्क क्षेत्रों में चूहों से स्लाइस तैयार करने में ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन और ना+ आयन प्रतिस्थापन द्वारा पेश किए गए फायदों के बावजूद, माउस हिप्पोकैम्पस हाइपोक्सिया13,,20से बचाने के लिए सबसे चुनौतीपूर्ण क्षेत्रों में से एक बना हुआ है। आज तक, उम्र बढ़ने वाले चूहों और न्यूरोडिजेनरेशन के माउस मॉडल से हिप्पोकैम्पस को टुकड़ा करने के लिए सबसे आम दृष्टिकोणों में से एक अलग हिप्पोकैम्पी27का शास्त्रीय तेजी से टुकड़ा करना शामिल है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में, हम वयस्क मस्तिष्क में हाइपोथर्मिया शुरू करके हाइपोथर्मिया के नुकसान को कम करते हैं, जो बर्फ-ठंडे ना+के साथ जानवर को पार करके- मुफ्त एनएमडीजी-आधारित कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ (एनएमडीजी-एसीसीएफ) के साथ। स्लाइस तो बर्फ ठंड ना+मुक्त NMDG-aCSF में काट रहे हैं । इस उन्नत प्रोटोकॉल के साथ हम वयस्क और उम्र बढ़ने वाले चूहों से तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस प्राप्त करते हैं जो टुकड़ा करने के बाद 10 घंटे तक स्वस्थ होते हैं और दीर्घकालिक क्षेत्र-रिकॉर्डिंग और पैच-क्लैंप अध्ययनों के लिए उपयुक्त होते हैं।

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Protocol

प्रोटोकॉल देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार किया जाता है और स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित । विधियां न्यूरोसाइंस रिसर्च में जानवरों और मनुष्यों के उपयोग पर न्यूरोसाइंस के लिए सोसायटी की नीतियों के अनुसार भी हैं।

नोट: सभी चूहों को रोगजनक मुक्त वातावरण में बनाए रखा गया था। मिश्रित C57Bl/6 x SV/129J आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर जंगली प्रकार के चूहों का उपयोग यहां किया गया था, जब तक कि अन्यथा नोट नहीं किया गया ।

1. सेटअप

  1. 1x aCSF के 1 एल तैयार (mM में): 125 NaCl, 26 NaHCO3,2.3 KCl, 1.26 KH2पीओ4,1.3 मिलीग्राम2एसओ4·7H 2O, 2.5 CaCl2,25 ग्लूकोज(तालिका 1)। वसूली कक्ष और बाद में रिकॉर्डिंग के लिए इस समाधान का उपयोग करें।
    नोट: एक 10x स्टॉक समाधान के रूप में एसीएसएफ स्टोर करें जिसमें एनएसीएल, एनएएचसीओ3,केसीएल और केएच2पीओ4शामिल हैं। स्टोर एमजी2एसओ4·7एच2ओ और सीएसीएल2 1 एम स्टॉक सॉल्यूशंस के रूप में। उपरोक्त स्टॉक समाधानों से प्रयोग के दिन कार्य समाधान तैयार करें, और 18 एमΩ पानी के साथ अंतिम मात्रा को समायोजित करने से पहले ग्लूकोज जोड़ें।
    नोट: मस्तिष्क क्षेत्र या माउस तनाव के आधार पर, ठंडा aCSF भी,सफलता11, 15,26के साथ ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।,15
  2. एनएमडीजी-एसीएसएफ (एमएमएम में) की 300 मिलीएल तैयार करें: 135 एनएमडीजी, 1 केसीएल, 1.2 केएच2पीओ4,1.5 एमजीसीएल2,0.5 सीएसीएल2,20 कोलीन बाइकार्बोनेट, 10 ग्लूकोज(टेबल 1)। एनएमडीजी-एसीएसएफ की यह मात्रा ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन और कटिंग स्टेप्स दोनों के लिए पर्याप्त है।
    नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर 3x स्टॉक समाधान के रूप में एनएमडीजी-एसीएसएफ स्टोर करें। प्रयोग के दिन काम समाधान तैयार करें; 18 MΩ पानी के साथ अंतिम मात्रा को समायोजित करने से पहले कोलीन बाइकार्बोनेट और ग्लूकोज जोड़ें। बुलबुला 95% O2 /5%सीओ2 के साथ समाधान बुलबुला यह बफर करने के लिए, और ऑक्सीजन के साथ तर।
    नोट: एनएमडीजी स्टॉक अत्यधिक क्षारीय के रूप में शुरू होता है, और पीएच को ~ 7.4 में समायोजित करने के लिए केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) की आवश्यकता होती है। पीएच 8 के नीचे हाइड्रोक्लोरिक एसिड को एक बार धीमा होना चाहिए, क्योंकि अतिरिक्त एचसीएल के साथ ~ पीएच 3 के समाधान को अम्लीय करना आसान है। यह समायोजन डिवेलेंट cations जोड़ने से पहले किया जाना चाहिए। यह एनएमडीजी-एसीएसएफ नुस्खा सोडियम-मुक्त है। पहले प्रकाशित एनएमडीजी व्यंजनों बफरिंग के लिए 30 mM NaHCO3 का उपयोग करें, जिसके परिणामस्वरूप एनएमडीजी-एक्ससीएफ13,,20में 30 mM सोडियम मौजूद है।
  3. कंपन माइक्रोटॉम काटने ट्रे और बढ़ते डिस्क -20 डिग्री सेल्सियस करने के लिए सेट करें।
  4. रिकवरी चैंबर तैयार करें।
    1. वसूली कक्ष को स्लाइस-होल्डिंग जाल के ठीक ऊपर भरें, इसे कमरे के तापमान पर बेंच पर रखें, और बुलबुला।
      नोट: यहां इस्तेमाल किया टुकड़ा वसूली कक्ष बहुत शास्त्रीय एडवर्ड्स और Konnerth3द्वारा पहले वर्णित कक्षों के समान है । aCSF को एक ग्लास बीकर (400 एमएल) में रखा जाता है जो नीचे से चिपके काले नायलॉन जाल के साथ एक गोल ऐक्रेलिक फ्रेम रखता है। एक्रेलिक फ्रेम बीकर के किनारे पर आराम कर रहे एक्रेलिक हुक के माध्यम से बीकर के बीच में निलंबित कर दिया जाता है। कांच के बबलर को नीचे तक सभी तरह से डाला जाता है। डिजाइन स्लाइस के दोनों पक्षों के ऑक्सीजन के लिए अनुमति देता है। बुदबुदाते भी वसूली कक्ष में aCSF के निरंतर मिश्रण प्रदान करता है। काले जाल ऑफ-व्हाइट स्लाइस के खिलाफ एक उच्च विपरीत प्रदान करता है, जिसे देखना आसान होता है।
  5. ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन और कटिंग सॉल्यूशन तैयार करें।
    1. एक फ्रीजर में NMDG-aCSF के पूरे ३०० mL ठंडा, जब तक बर्फ क्रिस्टल सतह और बोतल की दीवारों पर फार्म शुरू करते हैं । अधिक फ्रीज मत करो!
    2. बर्फ और बुलबुले पर ठंडा NMDG-aCSF के साथ बोतल रखें। समाधान 0\u20122 डिग्री सेल्सियस के बीच होना चाहिए।
      नोट: कीचड़ एनएमडीजी-aCSF तरल के रूप में समाधान के सबसे होने का तात्पर्य है, जबकि कीचड़ बर्फ वर्तमान का एक छोटा सा अंश परफ्यूजन और काटने के दौरान 0 डिग्री सेल्सियस के पास समाधान रखना होगा । काटने के दौरान मस्तिष्क से बर्फ क्रिस्टल दूर रखने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।
  6. टिश्यू-माउंटिंग डिस्क तैयार करें।
    1. डिस्क को फ्रीजर से बाहर निकालें, जरूरत पड़ने पर उसे सूखा पोंछ लें।
    2. पहले से तैयार एगर प्लेट से 5% एगर के ब्लॉक को काट लें, और इसे साइनोएक्रिलेट गोंद की पतली परत का उपयोग करके डिस्क के केंद्र में गोंद करें। आगर टुकड़ा माउस मस्तिष्क के आकार के बारे में होना चाहिए। बर्फ पर चिपके एगर के साथ डिस्क रखें, और कागज तौलिए के साथ कवर जब तक यह उपयोग करने के लिए तैयार है ।
      1. 5% एगर प्लेट के लिए, 18 MΩ पानी के 100 मिलील में 5 ग्राम एगर को माइक्रोवेव करके घोलें, और एक साफ पेट्री डिश में डालें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  7. फ्रीजर से बाहर काटने ट्रे ले लो, यह microtome में जगह है, यह बर्फ के साथ चारों ओर, और ब्लेड लोड ।

2. ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन और मस्तिष्क निष्कर्षण

  1. एनेस्थेटिक कॉकटेल के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से चूहों की ओवरडोज। दर्द पलटा (अंगुली चुटकी) की जांच करके संज्ञाहरण गहराई के लिए जांच करें; एक माउस को गहरे संज्ञाहरण तक पहुंचने के बाद पलटा प्रदर्शित नहीं करना चाहिए।
    नोट: कृंतक संज्ञाहरण कॉकटेल नुस्खा: केटामाइन एचसीएल (६६ मिलीग्राम/एमएल), जाइलाज़ीन एचसीएल (६.६ मिलीग्राम/एमएल), एसेप्रोमेजिन मालेट (०.१ मिलीग्राम/एमएल), 18 एमΩ पानी अंतिम मात्रा में । खुराक: क्रमशः 0.4 मिलीग्राम/ग्राम शरीर का वजन, 0.04 मिलीग्राम/जी शरीर का वजन, 6 x10 -4 मिलीग्राम/ग्राम शरीर का वजन केटामाइन, जाइलाज़ीन और एसेप्रोमजिन के लिए क्रमशः।
  2. ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन के लिए पेरिस्टाल्टिक पंप को सेट-अप करें। आइस्ड एनएमडीजी-एसीएसएफ के साथ बोतल में पंप ट्यूबिंग के एक तरफ डालें। 27 जी सुई है कि बाएं वेंट्रिकल में डाला जाएगा के साथ टयूबिंग के दूसरे पक्ष फिट।
  3. पंप की गति लगभग 3.5 एमएल/न्यूनतम निर्धारित करें। इस रफ्तार से एनएमडीजी-एसीएसएफ का बहिर्गमन तेज ड्रिप है, लगातार प्रवाह नहीं।
    नोट: गुरुत्वाकर्षण द्वारा परफ्यूजन पेरिस्टाल्टिक पंप परफ्यूजन का एक अच्छा विकल्प है, जब तक कि एक ही अनुमानित प्रवाह-दर प्राप्त की जा सकती है। उच्च प्रवाह दर पर एक परफ्यूजन मस्तिष्क में फट रक्त वाहिकाओं में परिणाम होगा । रक्त वाहिकाओं में एक पीढ़ी तेजी से परफ्यूजन और बढ़े हुए दबाव का एक गप्पी संकेत जानवर की नाक से बाहर आने वाला समाधान है।
  4. छिड़काव
    1. एक डायपर पर अपनी पीठ पर ठीक से एनेस्थेटाइज्ड माउस रखें। पेपर टेप का उपयोग करके, इसके सामने और पिछले पैरों को टेप करें ताकि छाती और पेट सामने आ जाए।
    2. छाती के ऊपर त्वचा का एक बड़ा पैच काटें, जो स्टर्नम के नीचे से गले तक जा रहा है; यह एक बड़ा कार्य क्षेत्र प्रदान करना चाहिए। संदंश के साथ उरोस्थि पकड़ो, धीरे लिफ्ट, और छाती गुहा उजागर होने तक दोनों पक्षों पर रिब पिंजरे के माध्यम से काटना शुरू करें।
    3. छाती गुहा को बेनकाब करने के लिए डायाफ्राम के माध्यम से काटें। रिब पिंजरे का पल्ला मांसपेशियों के एक पतले टुकड़े के माध्यम से संलग्न छोड़ दिया जाना चाहिए। यह उजागर छाती गुहा पर वापस गिर बिना यह एक तरफ सेट करने के लिए संभव होना चाहिए । जांच करें कि दिल अभी भी धड़क रहा है। सुनिश्चित करें कि अधिकांश जिगर दिखाई दे रहा है।
    4. बाएं वेंट्रिकल में 27 जी सुई डालें; माउस का बायां वेंट्रिकल दाईं ओर से रंग में हल्का दिखता है। गहरे लाल रंग के दाहिने एट्रियम का पता लगाएं। छोटी कैंची के साथ सही एट्रियम के माध्यम से काटें; खून बाहर बहने शुरू कर देना चाहिए।
    5. सही प्रवाह की गति के लिए पूर्व निर्धारित किया गया है कि पंप शुरू करो। यदि सब कुछ सही ढंग से किया गया था, तो यकृत को पर्फ्यूजन की शुरुआत के तुरंत बाद लाल से भूरे रंग में रंग बदलना शुरू कर देना चाहिए। परफ्यूजन की लंबाई निर्धारित करने के लिए यकृत रंग की निगरानी करें; जिगर पीला भूरा हो जाना चाहिए।
    6. कुछ और मिनट के लिए पंप चलाएं। यदि गुदा थर्मामीटर का उपयोग कर रहे हैं, तो शरीर का तापमान 28\u201229 डिग्री सेल्सियस तक गिर जाना चाहिए, और जानवर की नाक को छूने के लिए ठंडा होना चाहिए।
  5. मस्तिष्क निकालने।
    नोट: इस चरण के लिए, निम्नलिखित विच्छेदन उपकरण तैयार करें: डेपुटेशन कैंची, सीधे या कोण वाले ब्लेड के साथ छोटी कैंची, स्केलपेल और #10 ब्लेड, एकल किनारे ब्लेड, #3 संदंश, एक तरफ के साथ स्पैटुला 90 डिग्री तक झुके हुए, एक स्पैटुला, एक "60 डिग्री" उपकरण(चित्रा 1ए, बी),और एक छोटा नरम ब्रश।
    1. माउस को बड़े डेपुटेशन कैंची से काटना। #10 ब्लेड के साथ एक स्केलपेल का उपयोग करना, खोपड़ी के शीर्ष पर त्वचा को खोलें। छोटे कोण वाली कैंची के साथ, मिडलाइन पर खोपड़ी काटें। इसके बाद, #3 संदंश का उपयोग करके, खोपड़ी के दाएं और बाएं हिस्सों को दूर करें, ड्यूरा को इसके साथ दूर ले जाने के लिए सावधान रहें। अब दिमाग बेनकाब होना चाहिए।
      नोट: यदि डुरा खोपड़ी से अलग हो जाता है, तो यह मस्तिष्क के ऊपर रहेगा और इसे अलग से हटाना होगा। शेष ड्यूरा के किनारों को कस सकते हैं और मस्तिष्क के माध्यम से गहरी टुकड़ा, संभावित ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र को नुकसान पहुंचा।
    2. मस्तिष्क को एक छोटे से स्पैटुला के साथ बाहर निकालें। बर्फ पर एक अलग छोटे बीकर में रखा NMDG-aCSF समाधान में मस्तिष्क ड्रॉप । इसे एक मिनट तक के लिए छोड़ दें।
      नोट: हाइपोथर्मिया के अलावा, मस्तिष्क, जो भी काटने के लिए आवश्यक है ऊपर बर्फ ठंडा खारा फर्मों के लिए जोखिम । डेपुटेशन से लेकर मस्तिष्क निकालने तक की पूरी प्रक्रिया 30 एस के तहत होनी चाहिए।

3. स्लाइसिंग

  1. मस्तिष्क को एनएमडीजी-एसीएसएफ से बाहर निकालकर फिल्टर पेपर के टुकड़े पर रखें।
  2. मिडलाइन पर केंद्रित "60 डिग्री" उपकरण का उपयोग करके अग्रेब्राण के रोस्ट्रल छोर से 60 डिग्री कील काटें और हटा दें। कट सतहों के रूप में नीचे चर्चा की ट्रांसवर्सल हिप्पोकैम्पल स्लाइस के लिए उचित कोण को प्राप्त करने के लिए बढ़ते के लिए इस्तेमाल किया जाएगा(चित्रा 1A, B)।
    नोट: घर में बने धारक के माध्यम से एक साथ आयोजित दो एकल-धार वाले ब्लेड 60 डिग्री कट(चित्रा 1A)बनाने के लिए एक आसान उपयोग उपकरण बनाते हैं।
  3. स्केलपेल के साथ मिडलाइन के नीचे अलग गोलार्द्ध।
  4. इस प्रकार बढ़ते डिस्क पर गोलार्द्धों को गोंद करें। अब तक बर्फ पर किया गया है कि बढ़ते डिस्क ले लो। जरूरत पड़ने पर इसे फिर से सूखा कर पोंछ लें। आगर ब्लॉक के सामने प्रत्येक गोलार्द्ध गोंद, नीचे की ओर कट ।
  5. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक गोलार्द्ध का वेंट्रल पक्ष आगर ब्लॉक को छू रहा है। आगर ब्लॉक काटने के दौरान अतिरिक्त सहायता प्रदान करता है और यहां तक कि स्लाइस के लिए आवश्यक है। प्रत्येक गोलार्द्ध के पृष्ठीय पक्षों को ब्लेड का सामना करना पड़ना चाहिए। जब कट साइड पर चिपका होता है, तो प्रत्येक गोलार्द्ध ब्लेड के सापेक्ष एक तरह से उन्मुख होता है जिसके परिणामस्वरूप सीटू(चित्रा 1B)में पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के ट्रांसवर्स स्लाइस होते हैं।
  6. बर्फ-ठंडे कार्बोजेनेटेड एनएमडीजी-aCSF युक्त एक काटने वाले कक्ष में गोलार्द्धों के साथ डिस्क को जलमग्न करें।
  7. 400 माइक्रोन सेक्शन काटें। कटिंग 10 मिनट से भी कम समय में की जानी चाहिए। इस बार हासिल करने के लिए अलग-अलग माइक्रोटॉम्स की अलग-अलग सेटिंग्स की जरूरत होगी। पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस क्षेत्र से कुल 8\u201210 स्लाइस प्राप्त किए जाएंगे।

4. वसूली

  1. कट-ऑफ टिप्स(चित्रा 1C)के साथ डिस्पोजेबल ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके कमरे के तापमान पर कार्बोजोनेटेड एसीएसएफ युक्त रिकवरी कक्ष में स्लाइस स्थानांतरित करें।
    नोट: 5 एमएम एनए-एस्कॉर्बेट और 3 एमएम एनए-पाइरुवेट के साथ रिकवरी चैंबर-एएससीएफ को मजबूत करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। पाइरुवेट स्लाइस28में एटीपी के उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया एक ऊर्जा सब्सट्रेट है, जबकि ना-एस्कॉर्बेट एक मुक्त-कट्टरपंथी क्वेंचर29है।
  2. रिकॉर्डिंग (4 घंटे तक) से पहले लगभग 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान (22\u201224 डिग्री सेल्सियस) पर इनक्यूबेट।
    नोट: कमरे के तापमान पर एक लंबी इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप लंबे समय तक स्वस्थ स्लाइस होते हैं, मानक इनक्यूबेशन के सापेक्ष 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर और उसके बाद कमरे का तापमान इनक्यूबेशन। 37 डिग्री सेल्सियस पर रीवार्मिंग साइटोटॉक्सिक एडिमा13पेश कर सकता है।

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Representative Results

हमने कैमकिया-क्रे + से हिप्पोकैम्पस स्लाइस उत्पन्न करने के लिए उपरोक्त प्रोटोकॉल लागू किया; एक मिश्रित आनुवंशिक पृष्ठभूमि C57Bl/6 x SV/129J पर WT चूहों, पी और जीटी; १२० पर । CA1 क्षेत्र में पिरामिड कोशिकाओं की बड़ी संख्या(चित्रा 2A)और उपिकुलम(चित्रा 2B)कम विपरीत में दिखाई देते हैं जब अवरक्त अंतर विपरीत माइक्रोस्कोपी (आईआर-डीआईसी), एक टुकड़ा तैयारी में स्वस्थ कोशिकाओं की एक बानगी के तहत मनाया । इस तैयारी के साथ, गीगा-ओम जवानों की एक उच्च दर (>90%) सतह के नीचे लगभग 20\u201250 माइक्रोन स्वास्थ्यप्रद कोशिकाओं को लक्षित करते समय नियमित रूप से प्राप्त किया जाता है। इस सफलता दर के लिए, इस गहराई(चित्रा 2ए, बी)पर पिरामिड कोशिकाओं के पर्याप्त दृश्य को प्राप्त करने के लिए आईआर-डीआईसी के लिए एक उच्च एनए उद्देश्य का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, जैसे कि 60x पानी-विसर्जन उद्देश्य।

एकल न्यूरॉन्स से पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग आसानी से छह महीने से अधिक उम्र के चूहों में भी इस हिप्पोकैम्पल स्लाइस तैयारी का उपयोग करके प्राप्त की जा सकती है। चित्रा 2C CA1 न्यूरॉन्स से लघु उत्तेजक पोस्टसिनैप्टिक धाराओं (mEPSCs) रिकॉर्डिंग का उपयोग करके एक उदाहरण प्रयोग दिखाता है। 3 मिनट के लिए 20 μM एनएमडीए के स्नान आवेदन के साथ रासायनिक एनएमडीए-लिमिटेड का शामिल करना सीए1 कोशिकाओं में mEPSC आवृत्ति को कम करता है जब 60 मिनट के बाद एनएमडीए उपचार का आकलन किया जाता है। इस निष्कर्ष से पता चलता है कि एनएमडीए-लिमिटेड पुराने चूहों में CA1 में सिनेप्स की गतिविधि-निर्भर छंटाई का कारण बनता है (परिणाम Djurisic एट अल15से अनुकूलित) । एमईपीएससी आयाम में परिवर्तन का पता नहीं चला । mEPSC रिकॉर्डिंग के दौरान, CA1 कोशिकाओं को भी बायोसाइटिन से भर रहे थे । चित्रा 2 डी बायोसाइटिन से भरे CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स के एक अक्षुण्ण डेंड्रिटिक आर्बर और स्वस्थ सेल आदतों का पता चलता है। पूरे सेल में फ्लोरोसेंट डाई का एक मजबूत वितरण विभिन्न प्रायोगिक परिस्थितियों में डेंड्रिटिक स्पाइन गुणों के नियमित मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।

वयस्क चूहों से स्लाइस में CA3-CA1 synapses के ~ 170% के क्षेत्र-रिकॉर्डिंग, दीर्घकालिक शक्तिशाली (एलटीपी) का उपयोग आसानी से देखा गया था, जिसमें एलटीपी(चित्रा 2ई, एफ)के लिए आवश्यक सिग्नलिंग कैस्केड के रखरखाव का सुझाव दिया गया था। एक मजबूत क्षेत्र उत्तेजक पोस्टसिनैप्टिक क्षमता (fEPSP) सिग्नल के लिए आवश्यक नेटवर्क कनेक्टिविटी भी संरक्षित है(चित्रा 2E)। वयस्क या उम्र बढ़ने वाले चूहों से हिप्पोकैम्पस स्लाइस में सिनेप्टिक प्लास्टिसिटी का आकलन करने की क्षमता न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के माउस मॉडल के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है क्योंकि उनकी पहचान सिनेप्टिक रोग जीवन में बाद में विकसित होता है।

साथ में, हमारे परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि वयस्क और उम्र बढ़ने वाले चूहों से एक तीव्र हिप्पोकैम्पस तैयारी नियमित रूप से दोनों एकल कोशिकाओं और कोशिकाओं की आबादी के स्तर पर सिनेप्टिक फ़ंक्शन के आकलन की अनुमति देती है, जब तक कि ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन और बर्फ-ठंडे एनएमडीजी-आधारित समाधानों का उपयोग हाइपोक्सिक क्षति को कम करने के लिए किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: काटने विधि और वयस्क और उम्र बढ़ने चूहों से ट्रांसवर्सल हिप्पोकैम्पस स्लाइस की वसूली। (A)मस्तिष्क के रोस्ट्रल छोर से 60 डिग्री कील को हटाने के लिए उपयोग किया जाने वाला "60 डिग्री" उपकरण, मिडलाइन पर केंद्रित है। (ख)ट्रांसवर्सल स्लाइस काटने के लिए गोलार्द्धों की स्थिति । 60 डिग्री कट का एक उदाहरण बाईं और ऊपरी दाएं पैनलों पर दिखाया गया है; निचले दाएं पैनल में दिखाए गए तरीके से गोंद के साथ सतह पर दो गोलार्द्धों की स्थिति ब्लेड के सापेक्ष पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस का लंबवत अभिविन्यास सुनिश्चित करती है। इस अभिविन्यास के परिणामस्वरूप हिप्पोकैम्पस के ट्रांसवर्सल स्लाइस होते हैं। पीले संरचनाओं कृंतक मस्तिष्क (ग्रे) के भीतर हिप्पोकैम्पी का एक 3 डी प्रतिपादन कर रहे हैं। यह दृष्टांत SynapseWeb30से अनुकूलित है। सभी विचार मस्तिष्क के पृष्ठीय पक्ष के होते हैं। (ग)ट्रांसवर्सल हिप्पोकैम्पल स्लाइस एक वसूली कक्ष में एक 4 महीने पुराने माउस से काट दिया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: P120\u2012180 में चूहों से हिप्पोकैम्पस स्लाइस में पैच-क्लैंप और सिनेप्टिक प्लास्टिसिटी माप। }ACA1 क्षेत्र का एक उदाहरण आईआर-डीआईसी माइक्रोग्राफ। (ख)उदाहरण आईआर-डीआईसी सबीकुलम के माइक्रोग्राफ। ए और बी दोनों में, छवियों को 60x पानी-विसर्जन उद्देश्य के साथ काटने के बाद 3 घंटे लिया जाता है। अंशांकन बार 10 माइक्रोन है।(C)P120\u2012180 चूहों से CA1 न्यूरॉन्स में mEPSCs पर रासायनिक एनएमडीए-लिमिटेड का प्रभाव । ऊपरी पैनल बेसलाइन पर और एनएमडीए-लिमिटेड पल्स के बाद दर्ज mEPSCs के उदाहरण निशान हैं। लोअर लेफ्ट पैनल: एनएमडीए-लिमिटेड के परिणामस्वरूप एमईपीएससी आवृत्ति कम हुई। लोअर राइट पैनल: एनएमडीए-लिमिटेड का पता नहीं चलने के बाद mEPSC आयाम परिवर्तन। N = बेसलाइन पर 17 कोशिकाएं और एन = एनएमडीए-लिमिटेड, 6 चूहों के लिए 15 कोशिकाएं। पी = 0.004, टी-टेस्ट। इस आंकड़े को Djurisic एट अलसेसंशोधित किया गया है । (घ)बायोसाइटिन से भरे CA1 पिरामिड सेल का उदाहरण। (ई)Schaffer जमानत उत्तेजना के बाद CA1 स्ट्रैटम रेडिएटम से fEPSP संकेत का उदाहरण । बेसलाइन रिकॉर्डिंग के दौरान ग्रे ट्रेस प्राप्त किया जाता है, और टेटानिक उत्तेजना के बाद ब्लैक ट्रेस 20 मिनट मनाया जाता है। प्रत्येक ट्रेस लगातार 30 निशान का एक औसत है। (F)100 हर्ट्ज इंडक्शन की 4 ट्रेनों के बाद CA3-CA1 synapses के दीर्घकालिक शक्तिशाली के संचयी औसत; n = लगभग P90 पर 8 डब्ल्यूटी चूहों से 23 स्लाइस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (एसीएसएफ)
सामग्री मेगावाट अंतिम conc. (mM) g/2 लीटर (10X) g/लीटर (1X)
Nacl 58.44 125 146.1 -
नाहको3 84.01 26 43.68 -
केसीएल 74.55 2.3 3.43 -
KH2PO4 136.1 1.26 3.44 -
Mg2SO4 * 7H2O 203.3 1.3 - 1.3 मिलीलीटर 1M स्टॉक
CaCl2 * 2H2O 147.02 2.5 - 2.5 मिलीलीटर 1M स्टॉक
ग्लूकोज * H2O 180.2 25 - 4.5 ग्राम
क) 1M शेयरों से Mg2SO4 * 7H2O और CaCl2 * 2H2O जोड़ें
ख) aCSF 10X @RT रखें
ग) 24h के लिए aCSF 1X @4 डिग्री सेल्सियस
एनएमडीजी-एसीएसएफ
सामग्री मेगावाट अंतिम conc. (mM) g/2 लीटर (3X) g/300 मिलीलीटर (1X)
एनएमडीजी 195.22 135 158.13 -
एचसीएल के साथ पीएच=7.4
केसीएल 74.55 1 0.4473 -
KH2PO4 136.1 1.2 0.9799 -
MgCl2 * 6H2O 203.3 1.5 1.8297 -
CaCl2 * 2H2O 147.02 0.5 0.4411 -
कोलीन बाइकार्बोनेट 80% 20 - 1238 माइक्रोन
ग्लूकोज * H2O 180.2 10 - 0.54
क) 4 डिग्री सेल्सियस पर 3X स्टॉक समाधान को फ़िल्टर और स्टोर करें

तालिका 1: मीडिया फॉर्मूलेशन।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल दर्शाता है कि वयस्क और उम्र बढ़ने वाले चूहों से प्राप्त हिप्पोकैम्पस स्लाइस काटने के बाद कई घंटों तक स्वस्थ और व्यवहार्य रह सकते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार स्लाइस पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के साथ-साथ CA1 क्षेत्रों में लंबे समय तक चलने वाले क्षेत्र-रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त हैं।

इस प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण कदम हैं । पहला कदम बर्फ-ठंडे समाधान के साथ ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन कदम है। रक्त की तेजी से निकासी जिगर के रंग के तेजी से परिवर्तन से संकेत है। निकाले गए मस्तिष्क का रंग ऑफ-व्हाइट होना चाहिए। यदि मस्तिष्क गुलाबी रहता है, तो इसका मतलब है कि प्रणालीगत रक्त को ठंडे एनएमडीजी-एसीएसएफ के साथ नहीं बदला गया था, और शरीर के तापमान में गिरावट हासिल नहीं की गई थी। यह दिल में सुई के अनुचित प्लेसमेंट के कारण हो सकता है, या क्योंकि दिल के माध्यम से पंचर था । खराब perfused चूहों से दिमाग टुकड़ा करने की क्रिया के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। दूसरा महत्वपूर्ण कदम एक सोडियम आयन विकल्प के रूप में एनएमडीजी का उपयोग है। प्रोटोकॉल का एक प्रसिद्ध पहले भिन्नता जो चूहे के दिमाग में एनए+ के विकल्प के रूप में सुक्रोज का सफलतापूर्वक उपयोग करती है10,,31 चूहों में पर्याप्त रूप से स्वस्थ हिप्पोकैम्पल स्लाइस का उत्पादन नहीं करती है (टिंग एट अल13भी देखें)। सोडियम आयन विकल्प के रूप में एनएमडीजी का उपयोग माउस हिप्पोकैम्पल स्लाइस के लिए महत्वपूर्ण है।

जबकि स्वस्थ हिप्पोकैम्पस स्लाइस मज़बूती से वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं, वयस्क और उम्र बढ़ने वाले जानवरों से हिप्पोकैम्पस की तैयारी चुनौतीपूर्ण बनी हुई है। इसकी कठिनाई विभिन्न माउस लाइनों और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ भी बदलती है। विचार करने के लिए संभावित संशोधन एनएमडीजी-एसीएसएफ और रिकवरी-एसीएसएफ समाधान जैसे टॉरिन, डी-सेरीन, या एन-एसिटिलसिस्टीन (एनएसी) के लिए योजक हैं, जो न्यूरोनल और सिनेप्टिक फंक्शन13,,29को बढ़ा सकते हैं, ऑक्सीजन29में वृद्धि कर सकते हैं।  परफ्यूजन और कटिंग32के दौरान सीएल आयनों के प्रतिस्थापन पर भी विचार किया जाना चाहिए। इंटरफ़ेस रिकवरी चैंबर का उपयोग बढ़ी हुई ऑक्सीजन को बनाए रखने का एक और तरीका है, जो दीर्घकालिक प्लास्टिसिटी फील्ड-रिकॉर्डिंग के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है। वर्णित रिकवरी चैंबर(चित्रा 1C)उस उद्देश्य के लिए संशोधित है (उदाहरण के लिए, एक संस्कृति डालें पकवान जो नीचे से aSCF द्वारा गीला किया जाता है, जलमग्न जाल को प्रतिस्थापित कर सकता है)। नीलम या सिरेमिक ब्लेड के साथ स्टील ब्लेड की जगह हिप्पोकैम्पस के आसपास सफेद पदार्थ के भारी myelination द्वारा बढ़ा ऊतक संपीड़न कम हो सकता है; यह बदले में स्लाइस सतह के पास न्यूरॉन्स की गुणवत्ता में और सुधार कर सकता है। ऊर्ध्वाधर कंपन (उदाहरण के लिए, लीका VT1200S में शून्य-जेड) को कम करने के लिए डिज़ाइन किए गए माइक्रोटॉम का उपयोग करना, एक और संशोधित कदम है।

अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों को यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके कटा जा सकता है, जिसमें कोणों को काटने में उचित संशोधन किए जा सकते हैं। इसके अलावा, स्लाइस तैयारी की स्ट्रिंग को समायोजित किया जा सकता है, क्योंकि विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्र हाइपोक्सिया के प्रति विभिन्न डिग्री के प्रति संवेदनशील होते हैं। वयस्क माउस नियोकॉर्टेक्स और स्ट्रेटम स्लाइस तैयारी13,20के लिए एनएमडीजी-एएससीएफ का उपयोग करने वाले एक प्रोटोकॉल की सूचना दी गई है । यह एक एनएमडीजी-एसीएसएफ का उपयोग करता है जिसमें 30 mM NaHCO3 (यानी यह एनए+-मुक्तनहीं है)20,और कुछ उदाहरणों में ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन कमरे के तापमान13पर एनएमडीजी-ACSF के साथ है। हालांकि, हिप्पोकैम्पस के रूप में हाइपोक्सिया के लिए अतिसंवेदनशील क्षेत्र के लिए, ना+मुक्त एनएमडीजी-ACSF और बर्फ-ठंडे ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन का उपयोग करने से एक महत्वपूर्ण अंतर हो सकता है।

यह प्रोटोकॉल न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के मॉडलिंग ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की विशाल सरणी पर लागू होता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल आगे अन्य स्तनधारी मॉडल प्रजातियों से मस्तिष्क स्लाइस के लिए संशोधित किया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह से । एक साथ, यह प्रोटोकॉल उम्र बढ़ने वाले जानवरों से तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस के लिए एक मानकीकृत तैयारी के लिए एक आधार के रूप में काम कर सकता है, और इस प्रकार रोग तंत्र के संदर्भ में अध्ययनों में तुलना की सुविधा प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

मैं डॉ कार्ला जे Shatz सलाह और समर्थन के लिए शुक्रिया अदा करता हूं, और डॉ बारबरा के Brott और मिशेल के Drews गंभीर पांडुलिपि पढ़ने के लिए । काम NIH EY02858 और मैथर्स चैरिटेबल फाउंडेशन सीजेएस को अनुदान द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
“60 degree” tool made in-house
#10 scalpel blade Bard-Parker (Aspen Surgical) 371110
1M CaCl2 Fluka Analytical 21114
95%O2/5%CO2 Praxiar or another local supplier
Acepromazine maleate (AceproJect) Henry Schein 5700850
Agar Fisher BP1423-500
Beakers, measuring cylinders, reagent bottles
Brushes size 00-2 Ted Pella Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.
CCD camera Olympus XM10
Choline bicarbonate Pfalz & Bauer C21240
Cyanoacrilate glue Krazy glue Singles
Decapitation scissors FST 14130-17
Feather blades Feather FA-10
Filter paper #2 Whatman Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.
Forceps A. Dumont & Fils Inox 3c
Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3 Robuglas.com 18103 or 18113 Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.
Glucose Sigma-Aldrich G8270
HCl Fisher A144SI-212
Ice buckets
KCl Sigma-Aldrich P4504
Ketamine HCl (KetaVed) VEDCO NDC 50989-996-06
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662
Leica Tissue slicer VT1000S The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2
Magnetic stirrers and stir bars
Mg2SO4 x 7H2O Sigma-Aldrich 230391
MgCl2 Sigma-Aldrich M9272
MilliQ water machine Millipore Source for 18 Mohm water
Na-ascorbate Sigma-Aldrich A4035
Na-pyruvate Sigma-Aldrich P8574
NaCl Sigma-Aldrich S3014
NaHCO3 EMD SX0320-1
Needle 27G1/2
NMDG Sigma-Aldrich M2004
Paper tape
Peristaltic pump Cole-Parmer #7553-70
Peristaltic pump head Cole-Parmer Masterflex #7518-00
Personna blades Personna double edge Amazon
pH meter
Recovery chamber in-house made
Scalpel blade handle size 3 Bard-Parker (Aspen Surgical) 371030
Scissors angled blade FST 14081-09
Single edge industrial razor blade #9 VWR 55411
Spatulas
Transfer pipettes Samco Scientific 225
Upright microscope Olympus BX51WI
Xylazine HCl (XylaMed) VetOne 510650

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References

  1. Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
  2. Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
  3. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).
  4. Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain. Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).
  5. Lipton, P., Whittingham, T. S. The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).
  6. Lipton, P., Whittingham, T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus. Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).
  7. Free Mandel, P. H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals. Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).
  8. Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).
  9. Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats. Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).
  10. Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).
  11. Thomson, A. M., Bannister, A. P. Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex. Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).
  12. Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).
  13. Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G. Patch-Clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. 1183, Springer. Ch. 14 221-242 (2014).
  14. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 1-10 (2015).
  15. Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids. Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).
  16. Djurisic, M., et al. PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).
  17. Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
  18. Blot, A., Barbour, B. Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau. Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).
  19. Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli. Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).
  20. Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).
  21. Moyer, J. R., Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
  22. Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).
  23. Frick, A., Magee, J., Johnston, D. LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites. Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).
  24. Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell. PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).
  25. Brooks, J. M., O'Donnell, P. Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).
  26. Goel, A., Lee, H. K. Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex. Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).
  27. Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).
  28. Izumi, Y., Zorumski, C. F. Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices. Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).
  29. Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
  30. Fiala, J. C., Spacek, J. Hippocampus Rat. , Available from: https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat (1999).
  31. Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons. Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).
  32. Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).

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