Summary
Dette er en protokol for akut skive forberedelse fra voksne og aldrende mus hippocampi, der udnytter transcardial perfusion og skive skæring med iskold NMDG-aCSF at reducere hypoxiske skader på vævet. De resulterende skiver forbliver sunde over mange timer, og er velegnede til langsigtede patch-clamp og felt-optagelser.
Abstract
Akutte hippocampale skiver har gjort det muligt for generationer af neuroforskere at udforske synaptiske, neuronale, og kredsløb egenskaber i detaljer og med high fidelity. Udforskning af LTP og LTD mekanismer, enkelt neuron dendritisk beregning, og erfaring-afhængige ændringer i kredsløb, ville ikke have været muligt uden denne klassiske forberedelse. Men med nogle få undtagelser, de fleste grundforskning ved hjælp af akut hippocampal skiver er blevet udført ved hjælp af skiver fra gnavere i relativt unge aldre, ~ P20-P40, selv om synaptiske og iboende ophidselse mekanismer har en lang udviklingsmæssige hale, der når forbi P60. Den vigtigste appel ved at bruge unge hippocampal skiver er bevarelse af neuronal sundhed hjulpet af højere tolerance over for hypoxiske skader. Men, der er behov for at forstå neuronal funktion på mere modne stadier af udviklingen, yderligere forstærket af udviklingen af forskellige dyremodeller af neurodegenerative sygdomme, der kræver en aldrende hjerne forberedelse. Her beskriver vi en ændring af en akut hippocampal skive forberedelse, der pålideligt leverer sunde skiver fra voksne og aldrende mus hippocampi. Protokollens kritiske trin er transkardieperfusion og skæring med iskold natriumfri NMDG-aSCF. Tilsammen dæmper disse trin hypoxi-induceret fald i ATP ved halshugning samt cytotoksisk ødem forårsaget af passive natriumflukser. Vi demonstrerer, hvordan man skærer tværgående skiver af hippocampus plus cortex ved hjælp af en vibrerende mikrotom. Akutte hippocampale skiver opnået på denne måde er pålideligt sunde over mange timers optagelse, og er passende for både felt-optagelser og målrettede patch-clamp optagelser, herunder målretning af fluorescerende mærket neuroner.
Introduction
Fremkomsten af pattedyr akut hjerne skive præparater lettet eksperimenter på celle- og synaptisk niveau, der tidligere var kun muligt i hvirvelløse præparater som Aplysia1. Udvikling af akutte hippocampale skiver var af særlig betydning, da det er en struktur, der er ansvarlig for arbejdshukommelse og kontekstdannelse, og har en specialiseret tri-synaptisk kredsløb, der er modtagelig for let fysiologisk manipulation. Men langt størstedelen af akutte hjerne skiver er stadig fremstillet af relativt unge mus og rotter, da det er lettere at bevare sunde neuroner og kredsløb, og skiverne forbliver levedygtige i længere tid2,3,4. Her introducerer vi ændringer af standard udskæringsprotokoller, der resulterer i øget levedygtighed af akutte hippocampale skiver fra voksne og aldrende mus.
Den største hindring for den langsigtede ex vivo levedygtighed pattedyr hjerne parenkym er den oprindelige hypoxiske skader, der opstår hurtigt, når blodtilførslen til hjernen stopper efter halshugning. Tab af ilt resulterer i hurtigt metabolisk forbrug af store energiressourcer i hjernen med tab af fosfor-kreatin (P-kreatin) er den hurtigste, efterfulgt af glukose, adenosin tripfosfat (ATP), og glykogen4. Bevarelse af ATP er af særlig betydning for den langsigtede sundhed hjerne skiver, som ATP er nødvendig for at opretholde membranpotentialet via Na-K ATPase, og dermed neurale aktivitet5,6. ATP-niveauet i den voksne gnaver hjerne er ~ 2,5 mM, og det falder brat inden for 20 s af halshugning at nå en basal steady state (~ 0,5 mM) på omkring 1 min post-halshugning4,7,8. Hos unge dyr tager det længere tid at observere det samme fald i ATP (~2 min); med fænobarbital anæstesi det er yderligere bremset til 4 min4. Disse overvejelser viser, at forebyggelse af tab af ATP og andre energiressourcer er en nødvendig strategi for at forebygge hypoxiske skader på hjernen og til gengæld for at opretholde sundheden for hjerneskiver over længere perioder, især hos voksne dyr.
Lave temperaturer bremse stofskiftet. Det er derfor blevet påvist, at beskedne hypotermi beskytter hjernens energireserver: hos unge dyr, der sænker kropstemperaturen med seks grader, fra 37 °C til 31 °C, bevarer ATP-niveauet til ca. 80 % af de normale niveauer over 4 timer kontrolleret hypoxi9. P-kreatin niveauer er ligeledes bevaret, samt den samlede fosforylering potentiale9. Dette tyder på, at sænke kropstemperaturen før halshugning kunne være neuroprotektive, som næsten normale niveauer af ATP kunne opretholdes gennem skiven skæring og skive restitutionsperioder.
I det omfang et ATP-fald ikke kan forhindres fuldstændigt ved halshugning, forventes en delvist forringet funktion af Na-K ATPase, efterfulgt af depolarisering via passiv natriumtilstrømning. Da den passive natriumtilstrømning efterfølges af vand indtræden i celler, forårsager det cytotoksisk ødem og i sidste ende pyknose. Hos voksne rotter har udskiftning af na+ ioner med saccharose i skæreopløsninger været en vellykket strategi for at lette byrden ved cytotoksisk ødem10,11. For nylig, methylerede organiske kationer, der reducerer natrium kanal permeabilitet12 har vist sig at tilbyde mere effektiv beskyttelse end saccharose, især i skiver fra voksne mus, med N-methyl-D-glucamin (NMDG) er mest anvendelig på tværs af forskellige aldre og hjerne regioner13,14,15,16.
Talrige hjerne-udskæring protokoller indebærer brug af kolde temperaturer kun under skive-skæring trin, undertiden i kombination med Na+ ion udskiftning strategi16,17. Hos unge dyr, disse protokoller synes at tilbyde tilstrækkelig neuroprotection da hjernen kan udvindes hurtigt efter halshugning, fordi kraniet er stadig tynd og let at fjerne3. Men denne strategi producerer ikke sunde skiver fra voksne dyr. Over tid har en række laboratorier, der studerer voksne gnavere, indført transkardiisk perfusion med en iskold opløsning for at nedsætte dyrets kropstemperatur og dermed hypoxiske skader på hjernen før halshugning. Denne procedure blev anvendt med succes til at producere cerebellar skiver18, midbrain skiver19, neocortical skiver11,,20,perirhinal cortex21, rotte hippocampus10,22,,23, olfaktoriskepære 24, ventral striatum25, visuel cortex26.
På trods af de fordele, som transcardial perfusion og Na+ ion udskiftning i udarbejdelsen skiver fra rotte og i nogle hjerneregioner i mus, mus hippocampus er fortsat en af de mest udfordrende områder for at beskytte mod hypoxi13,20. Til dato, en af de mest almindelige tilgange til udskæring hippocampus fra aldrende mus og mus modeller af neurodegeneration indebærer den klassiske hurtige udskæring af den isolerede hippocampi27. I den protokol, der er beskrevet her, minimerer vi tabet af ATP i den voksne hjerne ved at indføre hypotermi før halshugning ved transkardiisk perfusing dyret med iskold Na+- gratis NMDG-baserede kunstige cerebrospinalvæske (NMDG-aCSF). Skiver skæres derefter i iskold Na+-fri NMDG-aCSF. Med denne forbedrede protokol opnår vi akutte hippocampale skiver fra voksne og aldrende mus, der er sunde i op til 10 timer efter udskæring og er passende til langsigtede felt-optagelser og patch-clamp undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen udføres i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr fra National Institutes of Health og godkendt af Stanford University Institutional Animal Care and Use Committee. Metoder er også i overensstemmelse med politikkerne i Society for Neuroscience om brugen af dyr og mennesker i Neuroscience Research.
BEMÆRK: Alle mus blev vedligeholdt i et patogenfrit miljø. Vilde mus på blandet C57Bl/ 6 x SV/ 129J genetisk baggrund blev anvendt her, medmindre andet er angivet.
1. Opsætning
- Forbered 1 L af 1x aCSF (i mM): 125 NaCl, 26 NaHCO3, 2,3 KCl, 1,26 KH2PO4, 1,3 Mg2SO4·7H2O, 2,5 CaCl2,25 glucose (Tabel 1). Brug denne løsning til genoprettelseskammeret og efterfølgende optagelser.
BEMÆRK: Opbevar aCSF som en 10x lagerløsning, der indeholder NaCl, NaHCO3,KCl og KH2PO4. Opbevar Mg2SO4·7H2O og CaCl2 som 1 M lagerløsninger. Forbered arbejdsløsningen på forsøgsdagen fra ovenstående stockløsninger, og tilsæt glukose, før du justerer det endelige volumen med 18 MΩ vand.
BEMÆRK: Afhængigt af hjerneregionen eller musestammen kan kølet aCSF også bruges til transkardiisk perfusion med succes11,,15,26. - Der klargøres 300 ml NMDG-aCSF (i mM): 135 NMDG, 1 KCl, 1,2 KH2PO4, 1,5 MgCl2, 0,5 CaCl2, 20 cholin bikarbonat, 10 glucose (Tabel 1). Denne mængde NMDG-aCSF er tilstrækkelig til både transcardial perfusion og skæretrin.
BEMÆRK: Opbevar NMDG-aCSF som en 3x lageropløsning ved 4 °C. Forbered arbejdsløsning på eksperimentets dag. cholinbikarbonat og glukose, før det endelige volumen justeres med 18 MΩ vand. Boble opløsningen med 95%O2/5%CO2 til buffer det, og mætte med ilt.
BEMÆRK: NMDG-materiel starter som meget alkalisk og kræver koncentreret saltsyre (HCl) for at justere pH-oli til ~7,4. Tilsætning af saltsyre bør være langsom én gang under pH 8, da det er let at forskønne opløsningen til ~ pH 3 med overskydende HCl. Denne justering bør foretages, før der tilføjes divalent kationer. Denne NMDG-aCSF opskrift er natrium-fri. Tidligere offentliggjorte NMDG opskrifter bruger 30 mM NaHCO3 til buffering, hvilket resulterer i 30 mM natrium til stede i NMDG-aCSF13,20. - Indstil den vibrerende mikrotomiskærebakke og monteringsskiven til -20 °C.
- Gør genoprettelseskammeret klar.
- Fyld opsvindingskammeret til lige over skiven-bedrift mesh, holde det på bænken ved stuetemperatur, og boble.
BEMÆRK: Skiven opsving kammer, der anvendes her er meget lig de klassiske kamre, der tidligere er beskrevet af Edwards og Konnerth3. aCSF holdes i et glasbæger (400 ml), der holder en rund akrylramme med sort nylonnet limet til bunden. Akrylrammen er ophængt midt i bægeret via en akrylkrog, der hviler over bægerglassets kant. Glasbobleren indsættes helt ned til bunden. Designet giver mulighed for iltning af begge sider af skiver. Boblende giver også konstant blanding af ACSF i recovery kammer. Den sorte maske giver en høj kontrast mod de off-white skiver, som derefter er lettere at se.
- Fyld opsvindingskammeret til lige over skiven-bedrift mesh, holde det på bænken ved stuetemperatur, og boble.
- Forbered den transkardieperfusions- og skæreopløsning.
- Chill hele 300 ml NMDG-aCSF i en fryser, indtil iskrystaller begynder at danne på overfladen og væggene i flasken. Må ikke over-fryse!
- Placer flasken med kølet NMDG-aCSF på is og boble. Opløsningen skal være mellem 0\u20122 °C.
BEMÆRK: Slushy NMDG- aCSF indebærer at have det meste af opløsningen som væske, mens en lille brøkdel af slushy is til stede vil holde opløsningen nær 0 °C i hele perfusion og skæring. Der skal være omhu for at holde iskrystaller væk fra hjernen under opskæringen.
- Klargør disken til vævsmontering.
- Tag disken ud af fryseren, tør den tørre, hvis det er nødvendigt.
- Skær en blok på 5% agar fra den tidligere forberedte agar plade, og lim det i midten af disken ved hjælp af et tyndt lag af cyanoacrylat lim. Den agar stykke bør være på størrelse med en mus hjerne. Placer disken med limet agar på is, og dække med papirservietter, indtil den er klar til brug.
- For 5% agar plade, opløses 5 g agar i 100 ml 18 MΩ vand ved microwaving, og hældes i en ren petriskål. Opbevares ved 4 °C.
- Tag skærebakken ud af fryseren, læg den i mikrotomen, omram den med is, og læg klingen i.
2. Transcardial perfusion og hjerneudvinding
- Overdosis mus via en intraperitoneal injektion af bedøvelsescocktail. Kontroller for anæstesi dybde ved at kontrollere smerte refleks (tå knivspids); en mus bør ikke udstille refleks, når den når dyb anæstesi.
BEMÆRK: Gnaver anæstesi cocktail opskrift: Ketamin HCl (66 mg/ml), xylazine HCl (6,6 mg/ ml), acepromazin hanat (0,1 mg/ ml), 18 MΩ vand til endelig volumen. Dosis: 0,4 mg/g kropsvægt, 0,04 mg/g kropsvægt, 6 x 10-4 mg/g kropsvægt for henholdsvis ketamin, xylazin og acepromazin. - Opsæt den peristaltiske pumpe til transkardieperfusion. Sæt den ene side af pumpeslangen i flasken med iset NMDG-aCSF. Sæt den anden side af slangen med 27 G nålen, der vil blive indsat i venstre hjertekammer.
- Indstil pumpehastigheden til ca. 3,5 ml/min. Ved denne hastighed er udstrømningen af NMDG-aCSF et hurtigt drop, ikke kontinuerligt flow.
BEMÆRK: Perfusion ved tyngdekraften er en god erstatning for den peristaltiske pumpe perfusion, så længe den samme omtrentlige flow-hastighed kan opnås. En perfusion ved høj flow-hastighed vil resultere i brast blodkar i hjernen. En afslørende tegn på en alt for hurtig perfusion og forhøjet tryk i blodkarrene er opløsning, der kommer ud af næsen af dyret. - Perfusion
- Placer korrekt bedøvet mus på ryggen på en ble. Brug papir tape, tape ned sin forreste og bagben, således at brystet og maven er udsat.
- Skær et stort plaster på huden på toppen af brystet, går fra under brystbenet til halsen; dette bør udgøre et stort arbejdsområde. Grib brystbenet med scer, løft forsigtigt, og begynde at skære gennem brystkassen på begge sider, indtil brysthulen er udsat.
- Skær gennem mellemgulvet for at udsætte brysthulen. Klappen i brystkassen skal efterlades fastgjort via et tyndt stykke muskel. Det bør være muligt at sætte den på en side uden at få den til at falde tilbage på det udsatte brysthule. Tjek, at hjertet stadig slår. Sørg for, at det meste af leveren er synlig.
- Sæt 27 G nålen i venstre hjertekammer; musens venstre hjertekammer ser lysere ud i farven end højre. Find det mørke rødfarvede højre atrium. Skær gennem højre atrium med lille saks; blodet skal begynde at flyde ud.
- Start den pumpe, der er forudindstillet til den korrekte flowhastighed. Hvis alt blev gjort korrekt, leveren skal begynde at ændre farve fra rød til brun kort efter starten af perfusion. Overvåge leveren farve til at bestemme længden af perfusion; leveren skal blive lysebrun.
- Kør pumpen i nogle minutter mere. Hvis du bruger rektal termometer, kropstemperaturen bør falde ned til 28\u201229 °C, og dyrets næse skal være koldt at røre ved.
- Hjerneudvinding.
BEMÆRK: Til dette trin skal du have følgende dissektionsværktøjer klar: halshugningssaks, lille saks med lige eller vinklet klinge, skalpel og #10 klinge, enkeltkantklinge, #3-kraftæcesker, spatel med den ene side bøjet til 90°, en spatel, et værktøj "60°" (Figur 1A,B) og en lille blød børste.- Halshugge musen med store halshugning saks. Ved hjælp af en skalpel #10 kniv, skær åbne huden på toppen af kraniet. Med små vinklede saks, skære kraniet på midterlinjen. Dernæst ved hjælp af #3, lirke væk højre og venstre halvdele af kraniet, være omhyggelig med at tage dura væk med det. Hjernen skal eksponeres nu.
BEMÆRK: Hvis duraen løsner sig fra kraniet, vil det blive over hjernen og skal fjernes separat. Kanterne af de resterende dura kan stramme og skære dybt gennem hjernen, potentielt skade hjernen region af interesse. - Fjern hjernen ved at øse den ud med en lille spatel. Drop hjernen ind i NMDG-aCSF-opløsningen placeret i et separat lille bægerglas på is. Lad det stå der i op til et minut.
BEMÆRK: Ud over hypotermi, udsættelse for iskold saltvand virksomheder op i hjernen, som er nødvendig for selv at skære. Hele proceduren fra halshugning til hjerneudvinding bør være under 30 s.
- Halshugge musen med store halshugning saks. Ved hjælp af en skalpel #10 kniv, skær åbne huden på toppen af kraniet. Med små vinklede saks, skære kraniet på midterlinjen. Dernæst ved hjælp af #3, lirke væk højre og venstre halvdele af kraniet, være omhyggelig med at tage dura væk med det. Hjernen skal eksponeres nu.
3.
- Tag hjernen ud af NMDG-aCSF og læg den på et stykke filterpapir.
- Skær og fjern en 60° kile fra forhjernens rostrale ende ved hjælp af et "60°"-værktøj centreret ved midterlinjen. Snitflader vil blive brugt til montering for at opnå den korrekte vinkel for tværgående hippocampale skiver som beskrevet nedenfor (Figur 1A, B).
BEMÆRK: To enkeltkantede knive, der holdes sammen via en hjemmelavet holder, er et brugervenligt værktøj til fremstilling af 60° snit(Figur 1A). - Separate halvkugler ned midterlinjen med skalpel.
- Lim halvkuglerne på monteringsdisken som følger. Tag monteringsdisken, der har været på is indtil nu. Tør den tørres af igen, hvis det er nødvendigt. Lim hver halvkugle foran agar blok, skåret ned siden ned.
- Sørg for, at den ventrale side af hver halvkugle rører agarblokken. Agar-blokken giver ekstra støtte under skæring og er afgørende for lige skiver. Dorsale sider af hver halvkugle skal vende mod bladet. Når hver halvkugle limes på den afskårne side, er den orienteret i forhold til klingen på en måde, der resulterer i tværgående skiver af dorsal hippocampus in situ (Figur 1B).
- Nedsænk disken med halvkugler i et skærekammer, der indeholder iskold carbogenated NMDG-aCSF.
- Skær 400 μm sektioner. Skæring skal ske på mindre end 10 min. Forskellige mikrotomer kræver forskellige indstillinger for at opnå denne gang. I alt 8\u201210 skiver fra den dorsale hippocampus region vil blive opnået.
4. Inddrivelse
- Overfør skiver til et bjærgningskammer, der indeholder carbogenated aCSF ved stuetemperatur ved hjælp af engangsoverførselspipetter med afskæringsspidser (Figur 1C).
BEMÆRK: Det anbefales på det kraftigste at befæste bjærgningskammer-aSCF med 5 mM Na-ascorbat og 3 mM Na-pyruvat. Pyruvat er et energiunderlag , der har vist sig at øge produktionen af ATP iskiver 28, mens Na-ascorbate er en frit radikal quencher29. - Inkuber ved stuetemperatur (22\u201224 °C) i ca. 2 timer før optagelse (op til 4 timer).
BEMÆRK: En længere inkubation ved stuetemperatur resulterer i sundere skiver i længere tid i forhold til standardinkubationen ved 37 °C i 30 minutter efterfulgt af indpuvning af stuetemperatur. Rewarming ved 37 °C kan indføre cytotoksisk ødem13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi anvendte ovenstående protokol til at generere hippocampus skiver fra CamKIIa-Cre +; WT mus på en blandet genetisk baggrund C57Bl/ 6 x SV/ 129J, ved P > 120. Et stort antal pyramideceller i feltet CA1 (Figur 2A) og subiculum (figur 2B) vises i lav kontrast, når det observeres under infrarød differentialkontrastmikroskopi (IR-DIC), et kendetegn for sunde celler i et skivepræparat. Med dette præparat, en høj sats af giga-ohm sæler (> 90%) opnås rutinemæssigt, når de målretter mod de sundeste celler ca. 20\u201250 mikron under overfladen. For denne succesrate, er det vigtigt at bruge en høj NA mål for IR-DIC, såsom en 60x vand-nedsænkning mål, for at opnå tilstrækkelig visualisering af pyramideceller på denne dybde (Figur 2A, B).
Patch-clamp optagelser fra enkelte neuroner er let opnåelige ved hjælp af denne hippocampal skive forberedelse selv i mus over seks måneder. Figur 2C viser et eksempeleksperiment ved hjælp af miniature excitatoriske postsynaptiske strømme (mEPSCs) optagelser fra CA1 neuroner. Induktion af kemiske NMDA-LTD med bad anvendelse af 20 μM NMDA for 3 min sænker mEPSC frekvens i CA1 celler, når vurderet 60 min post-NMDA behandling. Dette resultat tyder på, at NMDA-LTD forårsager aktivitetsafhængig beskæring af synapser i CA1 hos ældre mus (resultater tilpasset fra Djurisic et al.15). Der blev ikke fundet ændring i mEPSC amplitude. Under mEPSC-optagelser blev CA1-celler også fyldt med biocytin. Figur 2D afslører en intakt dendritisk arbor og sund celle habitus af biocytin-fyldte CA1 pyramideformede neuroner. En robust fordeling af fluorescerende farvestof i hele cellen giver mulighed for rutinemæssig evaluering af dendritiske rygsøjlen egenskaber under forskellige eksperimentelle betingelser.
Ved hjælp af felt-optagelser, langsigtet potensering (LTP) på ~ 170% af CA3-CA1 synapser i skiver fra voksne mus blev let observeret, hvilket tyder på vedligeholdelse af signalering kaskader er nødvendige for LTP (Figur 2E, F). Netværksforbindelse er nødvendig for et robust felt excitatoriske postsynaptiske potentiale (fEPSP) signal er også bevaret (Figur 2E). Evnen til at vurdere synaptisk plasticitet i hippocampale skiver fra voksne eller aldrende mus er især relevant for musemodeller af neurodegenerative sygdomme, da deres karakteristiske synaptiske dysfunktion udvikler sig senere i livet.
Sammen viser vores resultater, at en akut hippocampal præparat fra voksne og aldrende mus giver mulighed for vurdering af synaptisk funktion på niveau med både enkelte celler og population af celler rutinemæssigt, så længe transkardieperfusion og iskolde NMDG-baserede løsninger bruges til at minimere hypoxiske skader.
Figur 1: Skæringsmetode og genfinding af tværgående hippocampale skiver fra voksne og aldrende mus. (A) Et "60°"-værktøj, der anvendes til at fjerne 60° kilen fra hjernens rostrale ende, centreret på midterlinjen. b) Placering af halvkugler til skæring af tværgående skiver. En illustration af et 60° snit vises på venstre og øverste højre paneler; positionering af de to halvkugler på overfladen med lim på en måde vist i nederste højre panel sikrer en vinkelret orientering af dorsale hippocampus i forhold til bladet. Denne orientering resulterer i tværgående skiver af hippocampus. Gule strukturer er en 3D-gengivelse af hippocampi i gnaver hjernen (grå). Denne illustration er tilpasset fra SynapseWeb30. Alle synspunkter er af den dorsale side af hjernen. (C)Tværgående hippocampale skiver skåret fra en 4 måneder gammel mus i et bjærgningskammer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Patch-clamp og synaptisk plasticitetsmålinger i hippocampale skiver fra mus ved P120\u2012180. (A) Et eksempel på IR-DIC mikrograf af CA1-regionen. (B) Eksempel IR-DIC mikrografer af subiculum. I både A og B tages billeder 3 timer efter skæring med et 60x vandnedsænkningsmål. Kalibreringsstang er 10 μm. (C) Virkningen af kemiske NMDA-LTD på mEPSCs i CA1 neuroner fra P120\u2012180 mus. Øverste panel er eksempelspor af mEPC'er registreret ved baseline og efter NMDA-LTD puls. Nederste venstre panel: NMDA-LTD resulterede i lavere mEPSC frekvens. Nederste højre panel: mEPSC amplitude forandring efter NMDA-LTD er ikke opdaget. N = 17 celler ved baseline og n = 15 celler for NMDA-LTD, 6 mus. P = 0,004, t-test. Dette tal er blevet ændret fra Djurisic et al.15. d)Eksempel på biocytinfyldt CA1-pyramidecelle. (E)Eksempel på fEPSP-signal fra CA1 stratum radiatum efter Stimulering af Schaffer-sikkerhedsstillelse. Den grå spor er opnået under baseline optagelse, og den sorte spor er observeret 20 min efter taftisk stimulation. Hver sporing er i gennemsnit 30 på hinanden følgende spor. fF) akkumuleret gennemsnit af langtidsintensementation af CA3-CA1 synapser efter 4 tog med 100 Hz induktion n = 23 skiver fra 8 WT-mus ved ca. P90. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) | ||||
| Ingredienser | Mw | Endelig conc. (mM) | g/2 liter (10X) | g/liter (1x) |
| Nacl | 58.44 | 125 | 146.1 | - |
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | 43.68 | - |
| KCl | 74.55 | 2.3 | 3.43 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.26 | 3.44 | - |
| Mg2SO4*7H2O | 203.3 | 1.3 | - | 1,3 ml 1M-lager |
| CaCl2*2H2O | 147.02 | 2.5 | - | 2,5 ml 1M-lager |
| Glucose*H2O | 180.2 | 25 | - | 4,5 g |
| a) Tilføj Mg2SO4*7H2O og CaCl2*2H2O fra 1M-lagre | ||||
| b) aCSF 10X holde @RT | ||||
| c) aCSF 1X @4°C for 24 timer | ||||
| NMDG-ACSF | ||||
| Ingredienser | Mw | Endelig conc. (mM) | g/2 liter (3x) | g/300 ml (1X) |
| NMDG | 195.22 | 135 | 158.13 | - |
| pH=7,4 med HCl | ||||
| KCl | 74.55 | 1 | 0.4473 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.2 | 0.9799 | - |
| mgcl2*6H2O | 203.3 | 1.5 | 1.8297 | - |
| CaCl2*2H2O | 147.02 | 0.5 | 0.4411 | - |
| Bikarbonat af cholin | 80% | 20 | - | 1238 μl |
| Glucose*H2O | 180.2 | 10 | - | 0.54 |
| a) Filtrere og opbevare 3X lagerløsning ved 4°C | ||||
Tabel 1: Medieformuleringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet her, viser, at hippocampale skiver fra voksne og aldrende mus kan forblive sunde og levedygtige i mange timer efter opskæring. De udsnit, der er udarbejdet ved hjælp af denne protokol, er velegnede til patch-clamp-optagelser samt langvarige feltoptagelser i CA1-områderne.
Der er to kritiske trin i denne protokol. Første skridt er transkardieperfusionstrinnet med en iskold opløsning. Hurtig clearance af blod signaleres ved hurtig ændring af leverfarve. Ekstraheret hjerne bør være off-white i farven. Hvis hjernen forbliver lyserød, betyder det, at systemisk blod ikke blev erstattet med den kolde NMDG-aCSF, og faldet i kropstemperaturen blev ikke opnået. Dette kan være forårsaget af forkert placering af nålen ind i hjertet, eller fordi hjertet var punkteret igennem. Hjerner fra dårligt perfunderes mus bør ikke anvendes til udskæring. Det andet kritiske trin er brugen af NMDG som natriumionerstatning. En velkendt tidligere variation af protokollen, der med succes bruger saccharose som erstatning for Na+ i rotte hjerner10,31 producerer ikke tilstrækkeligt sunde hippocampal skiver i mus (se også Ting et al.13). Brugen af NMDG som natriumion erstatning er afgørende for mus hippocampal skiver.
Mens sunde hippocampal skiver er pålideligt opnås ved hjælp af den beskrevne protokol, hippocampal forberedelse fra voksne og aldrende dyr er fortsat udfordrende. Dens vanskeligheder ændrer sig også med forskellige muselinjer og genetiske baggrunde. Potentielle ændringer til at overveje er tilsætningsstoffer til NMDG-aCSF og recovery-aCSF løsninger som taurin, D-serin, eller N-acetylcystein (NAC), der kunne forøge neuronal og synaptisk funktion13,29, øge iltning29. Substitution af Cl- ioner bør også overvejes under perfusion ogskæring 32. Brug af en grænseflade opsving kammer er en anden måde at opretholde øget iltning, som er særligt relevant for langsigtede plasticitet felt-optagelser. Det beskrevne restitutionskammer (figur 1C) kan ændres til dette formål (f.eks. kan en kulturskærerskål, der fugtes nedefra af aSCF, erstatte det neddykkede net). Udskiftning af stålblade med safir eller keramiske knive kan nedsætte vævskompressionen, der forværres af kraftig myelination af hvidt stof omkring hippocampus; dette igen kunne yderligere forbedre kvaliteten af neuroner nær skiven overflade. Brug af mikrotomer designet til at minimere den lodrette vibration (f.eks nul-z i Leica VT1200S), er en anden modificerbar trin.
Andre hjerneregioner kan skæres i skiver ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her, med passende ændringer i skærevinkler. Desuden kan stringens af skiven forberedelse justeres, som forskellige hjerneregioner er følsomme over for hypoxi til forskellige grader.. En protokol, der anvender en NMDG-aSCF er blevet rapporteret for voksne mus neocortex og striatum skive præparater13,20; det bruger en NMDG-aCSF, der indeholder 30 mM NaHCO3 (dvs. det er ikke Na+-fri)20, og i nogle tilfælde transcardial perfusion er med NMDG-aCSF ved stuetemperatur13. Men for en region så modtagelig for hypoxi som hippocampus, ved hjælp af Na+-fri NMDG-aCSF og iskold transkardieperfusion kunne gøre en kritisk forskel.
Denne protokol gælder for det store udvalg af transgene muselinjer modellering neurodegenerative sygdomme. Desuden kan protokollen ændres yderligere til hjerneskiver fra andre pattedyrmodelarter. Sammen kunne denne protokol tjene som grundlag for en standardiseret forberedelse til akutte hippocampale skiver fra aldrende dyr, og dermed lette sammenligninger på tværs af undersøgelser i forbindelse med sygdomsmekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har intet at afsløre.
Acknowledgments
Jeg takker Dr. Carla J. Shatz for råd og støtte, og Dr. Barbara K. Brott og Michelle K. Drews for kritisk at læse manuskriptet. Arbejdet er støttet af NIH EY02858 og Mathers Charitable Foundation tilskud til CJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
- Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain. Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus. Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).
- Free Mandel, P. H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals. Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).
- Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).
- Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats. Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).
- Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex. Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).
- Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).
- Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G. Patch-Clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. 1183, Springer. Ch. 14 221-242 (2014).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 1-10 (2015).
- Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids. Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).
- Djurisic, M., et al. PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).
- Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
- Blot, A., Barbour, B. Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau. Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).
- Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli. Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).
- Frick, A., Magee, J., Johnston, D. LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites. Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).
- Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell. PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).
- Brooks, J. M., O'Donnell, P. Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).
- Goel, A., Lee, H. K. Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex. Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).
- Izumi, Y., Zorumski, C. F. Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices. Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).
- Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
- Fiala, J. C., Spacek, J. Hippocampus Rat. , Available from: https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat (1999).
- Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons. Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
