Summary
Dit is een protocol voor acute slice voorbereiding van volwassen en veroudering muis hippocampi die gebruik maakt van transcardiale perfusie en slice snijden met ijskoude NMDG-aCSF om hypoxische schade aan het weefsel te verminderen. De resulterende plakjes blijven gedurende vele uren gezond en zijn geschikt voor langdurige patch-clamp en field-recordings.
Abstract
Acute hippocampal plakjes hebben generaties neurowetenschappers in staat gesteld om synaptische, neuronale en circuit eigenschappen in detail en met hoge trouw te verkennen. Verkenning van LTP- en LTD-mechanismen, enkelvoudige neuron dendritische berekening en ervaringsafhankelijke veranderingen in circuits zouden niet mogelijk zijn geweest zonder deze klassieke voorbereiding. Echter, met een paar uitzonderingen, meest elementaire onderzoek met behulp van acute hippocampal plakjes is uitgevoerd met behulp van plakjes van knaagdieren van relatief jonge leeftijden, ~ P20-P40, hoewel synaptische en intrinsieke prikkelbaarheid mechanismen hebben een lange ontwikkelingsstaart die voorbij P60 bereikt. De belangrijkste aantrekkingskracht van het gebruik van jonge hippocampal plakjes is het behoud van neuronale gezondheid geholpen door een hogere tolerantie voor hypoxische schade. Echter, Er is een noodzaak om neuronale functie te begrijpen in meer volwassen stadia van ontwikkeling, verder geaccentueerd door de ontwikkeling van verschillende dierlijke modellen van neurodegeneratieve ziekten die een veroudering van de hersenen voorbereiding vereisen. Hier beschrijven we een wijziging aan een acute hippocampal slice voorbereiding die betrouwbaar levert gezonde plakjes van volwassen en veroudering muis hippocampi. De kritieke stappen van het protocol zijn transcardiale perfusie en snijden met ijskoude natriumvrije NMDG-aSCF. Samen verzachten deze stappen de door hypoxie veroorzaakte daling van atp bij onthoofding, evenals cytotoxisch oedeem veroorzaakt door passieve natriumfluxen. We laten zien hoe transversale plakjes hippocampus plus cortex kunnen snijden met behulp van een trillende microtome. Acute hippocampal plakjes verkregen op deze manier zijn betrouwbaar gezond gedurende vele uren van de opname, en zijn geschikt voor zowel veld-opnames en gerichte patch-klem opnames, met inbegrip van targeting van fluorescerend gelabeld neuronen.
Introduction
De komst van zoogdier acute hersenen slice preparaten vergemakkelijkt experimenten op cellulair en synaptisch niveau die voorheen alleen mogelijk waren in ongewervelde preparaten zoals Aplysia1. Ontwikkeling van acute hippocampal plakjes was van bijzonder belang, want het is een structuur die verantwoordelijk is voor het werkgeheugen en contextvorming, en heeft een gespecialiseerde tri-synaptische circuits die vatbaar is voor eenvoudige fysiologische manipulatie. Echter, de overgrote meerderheid van de acute hersenen plakjes zijn nog steeds bereid van relatief jonge muizen en ratten, want het is gemakkelijker om gezonde neuronen en circuits te behouden, en de plakjes levensvatbaar blijven voor langere tijd2,3,4. Hier introduceren we wijzigingen in standaard snijprotocollen die resulteren in een verhoogde levensvatbaarheid van acute hippocampale plakjes van volwassen en oudere muizen.
De belangrijkste belemmering voor de lange termijn ex vivo levensvatbaarheid van zoogdier hersenen parenchyma is de eerste hypoxische schade die snel optreedt zodra de bloedtoevoer naar de hersenen stopt na onthoofding. Verlies van zuurstof resulteert in een snelle metabole consumptie van belangrijke energiebronnen in de hersenen met het verlies van fosfo-creatine (P-creatine) is de snelste, gevolgd door glucose, adenosine triphosfate (ATP), en glycogeen4. Behoud van ATP is van bijzonder belang voor de gezondheid op lange termijn van de hersenen plakjes, zoals ATP nodig is om het membraan potentieel te behouden via de Na-K ATPase, en dus de neurale activiteit5,6. Het ATP-niveau in het volwassen knaagdierbrein is ~2,5 mM, en het daalt snel binnen 20 s van onthoofding om een basale steady state (~0,5 mM) te bereiken op ongeveer 1 min na de onthoofding4,7,8. Bij jonge dieren duurt het langer om dezelfde daling van de ATP (~ 2 min) waar te nemen; met fenobarbital anesthesie wordt het verder vertraagd tot 4 min4. Deze overwegingen tonen aan dat het voorkomen van verlies van ATP en andere energiebronnen is een noodzakelijke strategie om hypoxische schade aan de hersenen te voorkomen en op zijn beurt om de gezondheid van de hersenen plakjes te handhaven over langere perioden van tijd, vooral bij volwassen dieren.
Lage temperaturen vertragen de stofwisseling. Bijgevolg is aangetoond dat bescheiden onderkoeling de energiereserves van de hersenen beschermt: bij jonge dieren, waarbij de lichaamstemperatuur met zes graden wordt verlaagd, van 37 °C tot 31 °C, behoudt atp-niveaus tot ongeveer 80% van de normale niveaus meer dan 4 uur van gecontroleerde hypoxie9. P-creatine niveaus zijn eveneens bewaard gebleven, evenals de totale fosforylatie potentieel9. Dit suggereert dat het verlagen van de lichaamstemperatuur voorafgaand aan onthoofding neuroprotectieve zou kunnen zijn, als bijna-normale niveaus van ATP kan worden gehandhaafd door de slice snijden en slice herstel periodes.
In de mate dat een ATP-daling bij onthoofding niet volledig kan worden voorkomen, wordt een gedeeltelijk verminderde functie van de Na-K ATPase verwacht, gevolgd door depolarisatie via passieve natriuminstroom. Als de passieve natrium instroom wordt gevolgd door water binnenkomst in cellen, het veroorzaakt cytotoxisch oedeem en uiteindelijk pyknosis. Bij volwassen ratten is het vervangen van Na+ ionen door sacharose in slice-cutting oplossingen een succesvolle strategie geweest om de last van cytotoxisch oedeem10,11te verlichten . Meer recentelijk hebben gemethyleerde organische kations die de doorlaatbaarheid van natriumkanaal verminderen12, aangetoond dat ze een effectievere bescherming bieden dan sacharose, vooral in plakjes van volwassen muizen, waarbij N-methyl-D-glucamine (NMDG) het meest van toepassing is in verschillende leeftijden en hersengebieden13,14,15,16.
Tal van brein-snijden protocollen betrekken het gebruik van koude temperaturen alleen tijdens de slice-cutting stap, soms in combinatie met Na+ ionvervanging strategie16,17. Bij jonge dieren lijken deze protocollen voldoende neuroprotectie te bieden, omdat de hersenen snel na onthoofding kunnen worden geëxtraheerd omdat de schedel nog dun is en gemakkelijk te verwijderen3. Deze strategie produceert echter geen gezonde plakjes van volwassen dieren. Na verloop van tijd hebben een aantal laboratoria die volwassen knaagdieren bestuderen transcardiale perfusie geïntroduceerd met een ijskoude oplossing om de lichaamstemperatuur van het dier te verlagen, en dus hypoxische schade aan de hersenen, voorafgaand aan onthoofding. Deze procedure werd met succes toegepast op de productie van cerebellar plakjes18, midbrain plakjes19, neocorticale plakjes11,20, perirhinale cortex21, rat hippocampus10,22,23, reukbol24, ventrale striatum25, visuele cortex26.
Ondanks de voordelen die transcardiale perfusie en Na+ ionenvervanging bieden bij het bereiden van plakjes ratten en in sommige hersengebieden bij muizen, blijft muis hippocampus een van de meest uitdagende gebieden om te beschermen tegen hypoxie13,20. Tot op heden, een van de meest voorkomende benaderingen voor het snijden hippocampus van veroudering muizen en muis modellen van neurodegeneratie omvat de klassieke snelle snijden van de geïsoleerde hippocampi27. In het hier beschreven protocol minimaliseren we het verlies van ATP in de volwassen hersenen door onderkoeling te introduceren voorafgaand aan de onthoofding door het dier transcardieel te doorbrengen met ijskoude Na+- gratis op NMDG gebaseerde kunstmatige hersenvocht (NMDG-aCSF). Plakjes worden vervolgens gesneden in ijskoude Na+-vrije NMDG-aCSF. Met dit verbeterde protocol verkrijgen we acute hippocampal plakjes van volwassen en oudere muizen die gezond zijn voor maximaal 10 uur na het snijden en geschikt zijn voor lange termijn veldopnames en patch-clamp studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol wordt uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health en goedgekeurd door de Stanford University Institutional Animal Care and Use Committee. Methoden zijn ook in overeenstemming met het beleid van de Society for Neuroscience on the Use of Animals and Humans in Neuroscience Research.
OPMERKING: Alle muizen werden onderhouden in een ziekteverwekkervrije omgeving. Wild-type muizen op gemengde C57Bl/ 6 x SV/ 129J genetische achtergrond werden hier gebruikt, tenzij anders vermeld.
1. Setup
- Bereid 1 L van 1x aCSF (in mM): 125 NaCl, 26 NaHCO3, 2.3 KCl, 1.26 KH2PO4, 1.3 Mg2SO4·7H2O, 2.5 Ca2, 25 glucose (Tabel 1). Gebruik deze oplossing voor de herstelkamer en de daaropvolgende opnames.
OPMERKING: Sla aCSF op als een 10x-voorraadoplossing die NaCl, NaHCO3,KCl en KH2PO4bevat. Sla Mg2SO4·7H2O en CaCl2 op als 1 M voorraadoplossingen. Bereid de werkoplossing voor op de dag van het experiment van de bovenstaande voorraadoplossingen en voeg glucose toe voordat u het uiteindelijke volume aanpast met 18 MΩ-water.
OPMERKING: Afhankelijk van het hersengebied of de muisstam kan gekoelde aCSF ook worden gebruikt voor transcardiale perfusie met succes11,,15,26. - Bereid 300 mL NMDG-aCSF (in mM): 135 NMDG, 1 KCl, 1.2 KH2PO4, 1.5 MgCl2, 0.5 CaCl2, 20 choline bicarbonaat, 10 glucose (Tabel 1). Dit volume van NMDG-aCSF is voldoende voor zowel transcardial perfusie als snijstappen.
OPMERKING: Sla NMDG-aCSF op als een 3x voorraadoplossing bij 4 °C. Bereid de werkoplossing voor op de dag van het experiment; voeg choline bicarbonaat en glucose toe voordat u het uiteindelijke volume aanpast met 18 MΩ water. Bel de oplossing met 95%O2/5%CO2 om het te bufferen en verzadigen met zuurstof.
OPMERKING: NMDG voorraad begint als zeer alkalisch, en vereist geconcentreerd zoutzuur (HCl) om pH aan te passen aan ~ 7,4. Toevoeging van zoutzuur moet eenmaal langzaam onder pH 8, want het is gemakkelijk om de oplossing te verzuren tot ~ pH 3 met overtollige HCl. Deze aanpassing moet worden gedaan voorafgaand aan het toevoegen van divalent cations. Dit NMDG-aCSF recept is natriumvrij. Eerder gepubliceerde NMDG-recepten gebruiken 30 mM NaHCO3 voor buffering, wat resulteert in 30 mM natrium aanwezig in NMDG-aCSF13,20. - Stel de trillende microtome snijlade en montageschijf in op -20 °C.
- Bereid de herstelkamer voor.
- Vul de herstelkamer tot net boven de slice-holding mesh, houd het op de bank op kamertemperatuur, en bel.
OPMERKING: De hier gebruikte slice recovery kamer is zeer vergelijkbaar met de klassieke kamers eerder beschreven door Edwards en Konnerth3. aCSF wordt bewaard in een glazen bekerglas (400 mL) dat een ronde acryl frame met zwarte nylon mesh aan de onderkant gelijmd houdt. Het acrylframe wordt in het midden van de beker opgehangen via een acrylhaak die over de rand van het bekerglas rust. De glazen bubbler wordt helemaal naar de bodem geplaatst. Het ontwerp zorgt voor oxygenatie van beide zijden van plakjes. Borrelen zorgt ook voor een constante vermenging van aCSF in de herstelkamer. Het zwarte gaas zorgt voor een hoog contrast met de off-white plakjes, die dan gemakkelijker te zien zijn.
- Vul de herstelkamer tot net boven de slice-holding mesh, houd het op de bank op kamertemperatuur, en bel.
- Bereid de transcardiale perfusie- en snijoplossing voor.
- Chill de volledige 300 mL NMDG-aCSF in een vriezer, totdat ijskristallen beginnen te vormen op het oppervlak en de wanden van de fles. NIET te bevriezen!
- Leg de fles met gekoelde NMDG-aCSF op ijs en bubbel. De oplossing moet tussen 0\u20122 °C liggen.
OPMERKING: Slushy NMDG- aCSF impliceert dat het grootste deel van de oplossing als vloeistof, terwijl een kleine fractie van slushy ijs aanwezig zal houden van de oplossing in de buurt van 0 °C tijdens perfusie en snijden. Zorg moet worden genomen om weg te houden ijskristallen uit de hersenen tijdens het snijden.
- Bereid de weefselbevestigingsschijf voor.
- Haal de schijf uit de vriezer, veeg het droog indien nodig.
- Knip een blok van 5% agar uit de eerder voorbereide agarplaat en lijm het in het midden van de schijf met behulp van een dunne laag cyanoacrylaatlijm. De agar stuk moet ongeveer de grootte van een muis hersenen. Plaats de schijf met gelijmde agar op ijs, en bedek met papieren handdoeken totdat deze klaar is voor gebruik.
- Los voor 5% agarplaat 5 g agar op in 100 mL van 18 MΩ water door microwaving, en giet in een schone petrischaal. Houd op 4 °C.
- Haal de snijlade uit de vriezer, plaats het in de microtome, omring het met ijs en laad het mes.
2. Transcardiale perfusie en hersenextractie
- Overdosering muizen via een intraperitoneale injectie van verdoving cocktail. Controleer op de anesthesiediepte door de pijnreflex te controleren (teenknijper); een muis mag de reflex niet vertonen zodra hij diepe anesthesie bereikt.
OPMERKING: Recept voor anesthesie van knaagdieren: Ketamine HCl (66 mg/mL), xylazine HCl (6,6 mg/mL), acepromazine maleaat (0,1 mg/mL), 18 MΩ water tot eindvolume. Dosis: 0,4 mg/g lichaamsgewicht, 0,04 mg/g lichaamsgewicht, 6 x 10-4 mg/g lichaamsgewicht voor ketamine, xylazine en acepromazine, respectievelijk. - Stel de peristaltische pomp op voor transcardiale perfusie. Steek één kant van de pompslang in de fles met ijs NMDG-aCSF. Plaats de andere kant van de slang met de 27 G naald die in de linker ventrikel wordt gestoken.
- Stel de pompsnelheid in op ongeveer 3,5 mL/min. Met deze snelheid is de uitstroom van NMDG-aCSF een snelle druppel, geen continue stroom.
OPMERKING: Perfusie door de zwaartekracht is een goede vervanging voor de perfusie van de perfusie van de perfusie van de perfusie, zolang dezelfde geschatte stroomsnelheid kan worden bereikt. Een perfusie bij hoge stroomsnelheid zal resulteren in gebarsten bloedvaten in de hersenen. Een veelbetekenend teken van een te snelle perfusie en verhoogde druk in bloedvaten is oplossing die uit de neus van het dier komt. - Perfusie
- Plaats de goed verdoofde muis op zijn rug op een luier. Met behulp van papier tape, tape vaststelling van de voor-en achterpoten, zodat de borst en buik worden blootgesteld.
- Snijd een groot stukje van de huid boven op de borst, gaande van onder het borstbeen naar de keel; dit moet zorgen voor een groot werkgebied. Pak het borstbeen met tangen, til voorzichtig op en begin aan beide kanten door de ribbenkast te snijden totdat de borstholte wordt blootgesteld.
- Snijd door het middenrif om de borstholte bloot te leggen. De flap van de ribbenkast moet via een dun stukje spier worden bevestigd. Het moet mogelijk zijn om het op een kant te zetten zonder dat het terugvalt op de blootgestelde borstholte. Controleer of het hart nog klopt. Zorg ervoor dat het grootste deel van de lever zichtbaar is.
- Steek de 27 G naald in de linker ventrikel; de linker ventrikel van de muis ziet er lichter van kleur uit dan rechts. Zoek het donkerrood gekleurde rechteratrium. Snijd door het rechter atrium met een kleine schaar; het bloed moet beginnen te stromen.
- Start de pomp die is ingesteld op de juiste stroomsnelheid. Als alles correct werd gedaan, moet de lever beginnen te veranderen van kleur van rood naar bruin kort na het begin van de perfusie. Controleer de leverkleur om de lengte van de perfusie te bepalen; de lever moet lichtbruin worden.
- Voer de pomp nog een paar minuten uit. Bij gebruik van rectale thermometer moet de lichaamstemperatuur dalen tot 28\u201229 °C en moet de neus van het dier koud aansn.
- Hersenextractie.
OPMERKING: Voor deze stap, hebben de volgende dissectie tools klaar: onthoofding schaar, kleine schaar met rechte of schuine mes, scalpel en #10 mes, enkele rand blad, #3 tangen, spatel met een kant gebogen tot 90 °, een spatel, een "60°" gereedschap (Figuur 1A,B), en een kleine zachte borstel.- Onthoofd de muis met een grote onthoofdingsschaar. Met behulp van een scalpel met #10 mes, opengesneden de huid op de top van de schedel. Met een kleine schuine schaar, snijd de schedel op de middellijn. Vervolgens, met behulp van de #3 tangen, wrikken weg de rechter en linker helften van de schedel, voorzichtig om de dura weg te nemen met het. De hersenen moeten nu worden blootgesteld.
LET OP: Als de dura loskomt van de schedel, blijft deze over de hersenen en moet deze afzonderlijk worden verwijderd. De randen van de resterende dura kan aanscherpen en snijd diep door de hersenen, potentieel schadelijk voor de hersenen gebied van belang. - Verwijder de hersenen door het eruit te scheppen met een kleine spatel. Laat de hersenen in de NMDG-aCSF-oplossing geplaatst in een aparte kleine beker op ijs. Laat het daar voor maximaal een minuut.
OPMERKING: Naast onderkoeling, blootstelling aan de ijskoude zoutoplossing bedrijven in de hersenen, die nodig is voor zelfs snijden. De hele procedure van onthoofding tot de hersenextractie moet onder de 30 s zijn.
- Onthoofd de muis met een grote onthoofdingsschaar. Met behulp van een scalpel met #10 mes, opengesneden de huid op de top van de schedel. Met een kleine schuine schaar, snijd de schedel op de middellijn. Vervolgens, met behulp van de #3 tangen, wrikken weg de rechter en linker helften van de schedel, voorzichtig om de dura weg te nemen met het. De hersenen moeten nu worden blootgesteld.
3. Snijden
- Haal de hersenen uit de NMDG-aCSF en plaats het op een stuk filterpapier.
- Snijd en verwijder een 60° wig uit het rostrale uiteinde van de voorhersenen met behulp van een "60°" gereedschap gecentreerd op de middellijn. Snijoppervlakken zullen worden gebruikt voor montage om de juiste hoek te bereiken voor transversale hippocampal plakjes zoals hieronder besproken (Figuur 1A,B).
OPMERKING: Twee eensnijdende messen die via een zelfgemaakte houder bij elkaar worden gehouden, maken een gebruiksvriendelijk hulpmiddel voor het maken van de 60° snede(figuur 1A). - Aparte hemisferen in de middellijn met de scalpel.
- Lijm de hemisferen als volgt op de montageschijf. Neem de montageschijf die tot nu toe in het ijs stond. Veeg het indien nodig weer droog. Lijm elk halfrond voor het agar blok, snijd kant naar beneden.
- Zorg ervoor dat de ventrale kant van elk halfrond het agarblok raakt. Het agar blok biedt extra ondersteuning tijdens het snijden en is essentieel voor zelfs plakjes. Dorsale zijden van elke hemisfeer moet worden geconfronteerd met het blad. Wanneer gelijmd op de snijkant, elke hemisfeer is gericht ten opzichte van het blad op een manier die resulteert in dwarse plakjes van rug hippocampus in situ (Figuur 1B).
- Dompel de schijf met hemisferen onder in een snijkamer met ijskoude carbogenated NMDG-aCSF.
- Snijd 400 μm secties. Snijden moet worden gedaan in minder dan 10 minuten. Verschillende microtomen vereisen verschillende instellingen om deze tijd te bereiken. In totaal worden 8\u201210 plakjes uit de rug hippocampus regio verkregen.
4. Herstel
- Breng plakjes over naar een herstelkamer met carbogenated aCSF bij kamertemperatuur met behulp van wegwerptransferpipettes met cut-off tips(figuur 1C).
OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen om de herstelkamer-aSCF te versterken met 5 mM Na-ascorbaat en 3 mM Na-pyruvaat. Pyruvate is een energiesubstraat die de productie van ATP in plakjes28stimuleert, terwijl Na-ascorbaat een vrije radicalen quencher29is. - Incubeer bij kamertemperatuur (22\u201224 °C) gedurende ongeveer 2 uur voor de opname (tot 4 uur).
OPMERKING: Een langere incubatie bij kamertemperatuur resulteert in gezondere plakjes voor langere tijd, ten opzichte van de standaard incubatie bij 37 °C gedurende 30 minuten, gevolgd door kamertemperatuur incubatie. Opwarmen bij 37 °C kan cytotoxisch oedeem13introduceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We pasten het bovenstaande protocol toe om hippocampusplakjes te genereren van CamKIIa-Cre+; WT muizen op een gemengde genetische achtergrond C57Bl/ 6 x SV/ 129J, bij P > 120. Grote aantallen piramidale cellen in het CA1-veld(figuur 2A) en subiculum (figuur 2B) verschijnen in een laag contrast wanneer waargenomen onder infrarood differentiaal contrastmicroscopie (IR-DIC), een kenmerk van gezonde cellen in een segmentpreparaat. Met deze voorbereiding, een hoog percentage giga-ohm zeehonden (>90%) wordt routinematig bereikt bij het richten van de gezondste cellen ongeveer 20\u201250 micron onder het oppervlak. Voor dit slagingspercentage is het belangrijk om een hoge NA-doelstelling voor IR-DIC te gebruiken, zoals een 60x wateronderdompelingsdoelstelling, om een adequate visualisatie van piramidale cellen op deze diepte te bereiken(figuur 2A,B).
Patch-clamp opnames van enkele neuronen zijn gemakkelijk haalbaar met behulp van deze hippocampal slice voorbereiding, zelfs bij muizen ouder dan zes maanden. Figuur 2C toont een voorbeeldexperiment met miniatuur excitatory postsynaptic currents (mEPSCs) opnames van CA1 neuronen. Inductie van chemische NMDA-LTD met badtoepassing van 20 μM NMDA voor 3 min verlaagt mEPSC-frequentie in CA1-cellen bij beoordeling van 60 min post-NMDA behandeling. Deze bevinding suggereert dat NMDA-LTD activiteitsafhankelijk snoeien van synapsen in CA1 bij oudere muizen veroorzaakt (resultaten aangepast aan Djurisic et al.15). Verandering in mEPSC amplitude werd niet gedetecteerd. Tijdens mEPSC-opnames werden ca1-cellen ook gevuld met biocytine. Figuur 2D onthult een intacte dendritische prieel en gezonde celbewooning van met biocytine gevulde CA1 piramidale neuronen. Een robuuste verdeling van de fluorescerende kleurstof door de cel zorgt voor routinematige evaluatie van dendritische wervelkolom eigenschappen onder verschillende experimentele omstandigheden.
Met behulp van veldopnamen werd op lange termijn potentiëring (LTP) van ~170% van de CA3-CA1-synapsen in plakjes van volwassen muizen gemakkelijk waargenomen, wat suggereert dat er sprake was van onderhoud van signaleringscascade's die nodig zijn voor LTP(figuur 2E,F). Netwerkconnectiviteit die nodig is voor een robuust veld excitatory postsynaptic potential (fEPSP) signaal blijft ook behouden (Figuur 2E). De mogelijkheid om synaptische plasticiteit te beoordelen in hippocampale plakjes van volwassen of ouder wordende muizen is vooral relevant voor muismodellen van neurodegeneratieve ziekten als hun kenmerk synaptische disfunctie ontwikkelt zich later in het leven.
Samen tonen onze resultaten aan dat een acute hippocampale voorbereiding van volwassen en verouderende muizen het mogelijk maakt om synaptische functie op het niveau van zowel enkele cellen als populatie cellen routinematig te beoordelen, zolang transcardiale perfusie en ijskoude NMDG-gebaseerde oplossingen worden gebruikt om hypoxische schade te minimaliseren.
Figuur 1: Snijmethode en herstel van transversale hippocampale plakjes van volwassen en ouder wordende muizen. (A) Een "60°"-gereedschap dat wordt gebruikt voor het verwijderen van de 60°-wig van het rostrale uiteinde van de hersenen, gecentreerd op de middellijn. (B) Positionering van de hemisferen voor het snijden van dwarsknetjes. Een illustratie van een 60° snede wordt getoond op de linker en de rechterbovenpanelen; positionering van de twee hemisferen op het oppervlak met lijm op de manier weergegeven in het rechteronderpaneel zorgt voor een loodrechte oriëntatie van dorsale hippocampus ten opzichte van het blad. Deze oriëntatie resulteert in transversale plakjes hippocampus. Gele structuren zijn een 3D-weergave van hippocampi in de knaagdierhersenen (grijs). Deze illustratie is aangepast van SynapseWeb30. Alle uitzichten zijn van de rugkant van de hersenen. (C) Transversale hippocampal plakjes gesneden van een 4 maanden oude muis in een herstelkamer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Patch-clamp en synaptische plasticiteit metingen in hippocampal plakjes van muizen op P120\u2012180. (A) Een voorbeeld IR-DIC micrograaf van CA1-regio. (B) Voorbeeld IR-DIC-micrografen van subiculum. In zowel A als B worden beelden 3 uur na het snijden genomen met een 60x wateronderdompelingsdoelstelling. Kalibratiebalk is 10 μm. (C) Het effect van chemische NMDA-LTD op mEPSCs in CA1 neuronen van P120\u2012180 muizen. Bovenste paneel zijn voorbeeldsporen van mEPSCs geregistreerd bij baseline en na NMDA-LTD puls. Paneel linksonder: NMDA-LTD resulteerde in een lagere mEPSC-frequentie. Rechteronderpaneel: mEPSC amplitude change after NMDA-LTD is nottected. N = 17 cellen bij aanvang en n = 15 cellen voor NMDA-LTD, 6 muizen. P = 0,004, t-test. Dit cijfer is gewijzigd van Djurisic et al.15. (D) Voorbeeld van met biocytine gevulde CA1 piramidale cel. (E) Voorbeeld van fEPSP signaal van CA1 stratum radiatum na Schaffer collateral stimulation. Het grijze spoor wordt verkregen tijdens de basisregistratie, en het zwarte spoor wordt 20 minuten na tetanische stimulatie waargenomen. Elk spoor is een gemiddelde van 30 opeenvolgende sporen. (F) Cumulatief gemiddelde van de langdurige potentiëring van CA3-CA1 synapsen na 4 treinen van 100 Hz inductie; n = 23 plakjes van 8 WT muizen op ongeveer P90. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Kunstmatige hersenvocht (aCSF) | ||||
| Ingrediënten | Mw | Definitieve conc. (mM) | g/2 liter (10X) | g/liter (1X) |
| Nacl | 58.44 | 125 | 146.1 | - |
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | 43.68 | - |
| Kcl | 74.55 | 2.3 | 3.43 | - |
| KH2PO4 KH2PO4 | 136.1 | 1.26 | 3.44 | - |
| Mg2SO4*7H2O | 203.3 | 1.3 | - | 1,3 ml voorraad van 1 M |
| CaCl2*2H2O | 147.02 | 2.5 | - | 2,5 ml voorraad van 1 M |
| Glucose*H2O | 180.2 | 25 | - | 4,5 g |
| a) Voeg Mg2SO4*7H2O en CaCl2*2H2O toe uit 1M-voorraden | ||||
| b) aCSF 10X houden @RT | ||||
| c) aCSF 1X @4°C voor 24u | ||||
| NMDG-aCSF | ||||
| Ingrediënten | Mw | Definitieve conc. (mM) | g/2 liter (3x) | g/300 ml (1X) |
| NMDG | 195.22 | 135 | 158.13 | - |
| pH=7.4 met HCl | ||||
| Kcl | 74.55 | 1 | 0.4473 | - |
| KH2PO4 KH2PO4 | 136.1 | 1.2 | 0.9799 | - |
| MgCl2*6H2O | 203.3 | 1.5 | 1.8297 | - |
| CaCl2*2H2O | 147.02 | 0.5 | 0.4411 | - |
| Choline Bicarbonaat | 80% | 20 | - | 1238 μl |
| Glucose*H2O | 180.2 | 10 | - | 0.54 |
| a) Filter en bewaar 3x voorraadoplossing bij 4°C | ||||
Tabel 1: Mediaformuleringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven protocol toont aan dat hippocampale plakjes verkregen van volwassen en oudere muizen gezond en levensvatbaar kunnen blijven gedurende vele uren na het snijden. De segmenten die met dit protocol zijn bereid, zijn geschikt voor patch-clamp-opnames, evenals langdurige veldopnames in de CA1-regio's.
Er zijn twee kritieke stappen in dit protocol. Eerste stap is de transcardiale perfusiestap met een ijskoude oplossing. Snelle klaring van het bloed wordt gesignaleerd door een snelle verandering van de leverkleur. Geëxtraheerd brein moet worden off-wit van kleur. Als de hersenen roze blijven, betekent dit dat systemisch bloed niet werd vervangen door de koude NMDG-aCSF, en de daling van de lichaamstemperatuur werd niet bereikt. Dit kan worden veroorzaakt door onjuiste plaatsing van de naald in het hart, of omdat het hart werd doorboord. Hersenen van slecht geperfundeerde muizen mogen niet worden gebruikt voor het snijden. De tweede kritieke stap is het gebruik van NMDG als natriumionvervanger. Een bekende eerdere variant van het protocol dat met succes sacharose gebruikt als substituut voor Na+ in rathersenen10,31 produceert niet voldoende gezonde hippocampal plakjes bij muizen (zie ook Ting et al.13). Het gebruik van NMDG als natriumionvervanger is van cruciaal belang voor de plakjes van de muis hippocampal.
Terwijl gezonde hippocampal plakjes betrouwbaar worden verkregen met behulp van het beschreven protocol, blijft de hippocampale voorbereiding van volwassen en vergrijzende dieren uitdagend. De moeilijkheid verandert ook met verschillende muislijnen en genetische achtergronden. Mogelijke wijzigingen te overwegen zijn additieven aan NMDG-aCSF en recovery-aCSF oplossingen zoals taurine, D-serine, of N-acetylcysteine (NAC), dat zou kunnen vergroten neuronale en synaptische functie13,29, verhoging van de oxygenatie29. Substitutie van Cl-ionen moet ook worden overwogen tijdens perfusie en snijden32. Het gebruik van een interface recovery kamer is een andere manier om verhoogde oxygenatie te behouden, wat vooral relevant is voor lange termijn plasticiteit veldopnamen. De beschreven herstelkamer (figuur 1C) is voor dat doel aanpasbaar (bijvoorbeeld een kweekinsteekschaal die van onderaf wordt bevochtigd door aSCF, kan het ondergedompelde net vervangen). Het vervangen van stalen messen door saffier of keramische messen kan weefselcompressie verminderen die verergerd wordt door zware myeminatie van witte stof rond hippocampus; dit op zijn beurt zou verder kunnen verbeteren van de kwaliteit van neuronen in de buurt van het snijoppervlak. Het gebruik van microtomen die zijn ontworpen om de verticale trillingen te minimaliseren (bijvoorbeeld nul-z in Leica VT1200S), is een andere aanpasbare stap.
Andere hersengebieden kunnen worden gesneden met behulp van het protocol hier beschreven, met de juiste wijzigingen in het snijden hoeken. Bovendien kan de striktheid van de slice-preparaat worden aangepast, omdat verschillende hersengebieden gevoelig zijn voor hypoxie in verschillende mate.. Een protocol dat gebruik maakt van een NMDG-aSCF is gemeld voor volwassen muis neocortex en striatum slice preparaten13,20; het maakt gebruik van een NMDG-aCSF dat 30 mM NaHCO3 bevat (d.w.z. het is niet Na+-vrij)20, en in sommige gevallen is transcardiale perfusie met NMDG-aCSF bij kamertemperatuur13. Echter, voor een gebied zo gevoelig voor hypoxie als hippocampus, met behulp van Na+-vrije NMDG-aCSF en ijskoude transcardial perfusie kan een cruciaal verschil maken.
Dit protocol is van toepassing op de enorme reeks transgene muislijnen modelleren neurodegeneratieve ziekten. Bovendien zou het protocol verder kunnen worden gewijzigd in de hersenen plakjes van andere zoogdier model soorten, ook. Samen zou dit protocol als basis kunnen dienen voor een gestandaardiseerde voorbereiding op acute hippocampale plakjes van oudere dieren, en zo vergelijkingen tussen studies in de context van ziektemechanismen vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen.
Acknowledgments
Ik dank Dr. Carla J. Shatz voor advies en ondersteuning, en Dr. Barbara K. Brott en Michelle K. Drews voor het kritisch lezen van het manuscript. Het werk wordt ondersteund door NIH EY02858 en de Mathers Charitable Foundation subsidies aan CJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
- Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain. Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus. Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).
- Free Mandel, P. H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals. Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).
- Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).
- Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats. Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).
- Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex. Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).
- Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).
- Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G. Patch-Clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. 1183, Springer. Ch. 14 221-242 (2014).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 1-10 (2015).
- Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids. Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).
- Djurisic, M., et al. PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).
- Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
- Blot, A., Barbour, B. Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau. Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).
- Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli. Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).
- Frick, A., Magee, J., Johnston, D. LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites. Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).
- Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell. PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).
- Brooks, J. M., O'Donnell, P. Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).
- Goel, A., Lee, H. K. Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex. Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).
- Izumi, Y., Zorumski, C. F. Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices. Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).
- Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
- Fiala, J. C., Spacek, J. Hippocampus Rat. , Available from: https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat (1999).
- Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons. Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
