Summary
Il s’agit d’un protocole pour la préparation des tranches aiguës de l’adulte et le vieillissement hippocampi souris qui tire parti de la perfusion transcardique et la coupe de tranches avec la glace-froid NMDG-aCSF pour réduire les dommages hypoxiques au tissu. Les tranches qui en résultent restent en bonne santé pendant de nombreuses heures et conviennent aux corrections à long terme et aux enregistrements sur le terrain.
Abstract
Les tranches hippocampales aiguës ont permis à des générations de neuroscientifiques d’explorer en détail les propriétés synaptiques, neuronales et de circuits et avec une haute fidélité. L’exploration des mécanismes de LTP et de LTD, le calcul dendritique de neurone simple, et les changements d’expérience-dépendant dans les circuits, n’aurait pas été possible sans cette préparation classique. Cependant, à quelques exceptions près, la plupart des recherches fondamentales utilisant des tranches hippocampales aiguës ont été effectuées à l’aide de tranches de rongeurs d’âges relativement jeunes, ~P20-P40, même si les mécanismes synaptiques et intrinsèques d’excitabilité ont une longue queue de développement qui atteint le P60. L’attrait principal de l’utilisation de jeunes tranches hippocampales est la préservation de la santé neuronale facilitée par une plus grande tolérance aux dommages hypoxiques. Cependant, il est nécessaire de comprendre la fonction neuronale à des stades plus matures du développement, accentué par le développement de divers modèles animaux de maladies neurodégénératives qui nécessitent une préparation du cerveau vieillissant. Ici, nous décrivons une modification à une préparation aiguë de tranche hippocampal qui fournit de manière fiable des tranches saines de l’adulte et le vieillissement hippocampe souris. Les étapes critiques du protocole sont la perfusion transcardique et la coupe avec nmdg-aSCF sans sodium sans glace. Ensemble, ces étapes atténuent la baisse induite par l’hypoxie dans l’ATP lors de la décapitation, ainsi que l’œdème cytotoxique provoqué par les flux passifs de sodium. Nous montrons comment couper les tranches transversales de l’hippocampe plus le cortex à l’aide d’un microtome vibrant. Les tranches hippocampales aiguës obtenues de cette façon sont fiables et saines pendant de nombreuses heures d’enregistrement, et sont appropriées pour les enregistrements sur le terrain et les enregistrements ciblés de correction-clamp, y compris le ciblage des neurones fluorescents étiquetés.
Introduction
L’avènement des préparations aiguës de tranches cérébrales des mammifères a facilité des expériences au niveau cellulaire et synaptique qui n’étaient auparavant possibles que dans les préparations d’invertébrés comme l’Aplysia1. Le développement de tranches hippocampales aiguës était d’une importance particulière, car il s’agit d’une structure responsable de la mémoire de travail et de la formation de contexte, et dispose d’un circuit tri-synaptique spécialisé qui est susceptible de manipulation physiologique facile. Cependant, la grande majorité des tranches cérébrales aiguës sont encore préparées à partir de souris et de rats relativement jeunes, car il est plus facile de préserver les neurones et les circuits sains, et les tranches restent viables pendant de plus longues périodes de temps2,3,4. Ici, nous introduisons des modifications aux protocoles de tranchage standard qui se traduisent par une viabilité accrue des tranches hippocampales aiguës des souris adultes et vieillissantes.
Le principal obstacle à la viabilité ex vivo à long terme du parenchyme cérébral des mammifères est les dommages hypoxiques initiaux qui se produisent rapidement une fois que le flux sanguin vers le cerveau cesse après la décapitation. La perte d’oxygène entraîne une consommation métabolique rapide de ressources énergétiques importantes dans le cerveau avec la perte de phospho-créatine (P-créatine) étant la plus rapide, suivie par le glucose, l’adénosine triphosphate (ATP), et le glycogène4. La préservation de l’ATP est d’une importance particulière pour la santé à long terme des tranches de cerveau, comme ATP est nécessaire pour maintenir le potentiel de la membrane via le Na-K ATPase, et par conséquent l’activité neuronale5,6. Le niveau d’ATP dans le cerveau adulte de rongeur est ~2.5 mM, et il tombe précipitamment dans 20 s de décapitation pour atteindre un état stable basal (~0.5 mM) à environ 1 min post-décapitation4,7,8. Chez les jeunes animaux, il faut plus de temps pour observer la même baisse de l’ATP (~2 min); avec anesthésie phénobarbitale, il est encore ralenti à 4 min4. Ces considérations montrent que la prévention de la perte d’ATP et d’autres ressources énergétiques est une stratégie nécessaire pour prévenir les dommages hypoxiques au cerveau et à son tour pour maintenir la santé des tranches de cerveau sur de plus longues périodes de temps, en particulier chez les animaux adultes.
Les basses températures ralentissent le métabolisme. Par conséquent, il a été démontré que l’hypothermie modeste protège les réserves d’énergie du cerveau: chez les jeunes animaux, abaissant la température corporelle de six degrés, de 37 °C à 31 °C, préserve les niveaux d’ATP à environ 80% des niveaux normaux de plus de 4 h d’hypoxie contrôlée9. Les niveaux de p-créatine sont également préservés, ainsi que le potentiel global de phosphorylation9. Ceci suggère que l’abaissement de la température du corps avant la décapitation pourrait être neuroprotecteur, car des niveaux presque normaux d’ATP pourraient être maintenus par les périodes de découpage et de récupération de tranche.
Dans la mesure où une baisse d’ATP ne peut pas être complètement empêchée lors de la décapitation, on s’attend à une fonction partiellement altérée de l’ATPase Na-K, suivie d’une dépolarisation par l’afflux passif de sodium. Comme l’afflux passif de sodium est suivi par l’entrée de l’eau dans les cellules, il provoque l’œdème cytotoxique et éventuellement la pyknose. Chez les rats adultes, le remplacement des ions Na+ par du saccharose dans des solutions de coupe de tranches a été une stratégie réussie pour alléger le fardeau de l’œdème cytotoxique10,11. Plus récemment, les cations organiques méthylées qui diminuent la perméabilité des canaux de sodium12 ont montré qu’elles offrent une protection plus efficace que le saccharose, en particulier dans les tranches de souris adultes, le N-méthyl-D-glucamine (NMDG) étant le plus largement applicable à différents âges et régions du cerveau13,14,15,16.
De nombreux protocoles de coupe du cerveau impliquent l’utilisation de températures froides seulement pendant l’étape de coupe de tranches, parfois en combinaison avec la stratégie de remplacement de Na+ ion16,17. Chez les jeunes animaux, ces protocoles semblent offrir une neuroprotection suffisante puisque les cerveaux peuvent être extraits rapidement après la décapitation parce que le crâne est encore mince et facile à enlever3. Cependant, cette stratégie ne produit pas de tranches saines d’animaux adultes. Au fil du temps, un certain nombre de laboratoires d’étude des rongeurs adultes ont introduit la perfusion transcardique avec une solution glacée pour diminuer la température corporelle de l’animal, et donc des dommages hypoxiques au cerveau, avant la décapitation. Cette procédure a été appliquée avec succès pour produire des tranches de cérebelaire18, tranches de midbrain19, tranches néocorticales11,20, cortex périrhinal21, hippocampe rat10,22,23, ampoule olfactive24, striatum ventral25, cortex visuel26.
En dépit des avantages offerts par la perfusion transcardique et le remplacement de Na+ ion dans la préparation des tranches de rat et dans certaines régions du cerveau chez la souris, l’hippocampe souris reste l’un des domaines les plus difficiles à protéger de l’hypoxie13,20. À ce jour, l’une des approches les plus courantes pour trancher l’hippocampe à partir de souris vieillissantes et de modèles de souris de neurodégénérescence implique le tranchage rapide classique de l’hippocampe isolé27. Dans le protocole décrit ici, nous minimisons la perte d’ATP dans le cerveau adulte en introduisant l’hypothermie avant la décapitation par transcardially perfuser l’animal avecna+ glacé - fluide céphalo-rachidien artificiel à base de NMDG libre (NMDG-aCSF). Les tranches sont ensuite coupées en Na+-free NMDG-aCSF. Avec ce protocole amélioré, nous obtenons des tranches hippocampales aiguës de souris adultes et vieillissantes qui sont en bonne santé jusqu’à 10 h après le tranchage et sont appropriés pour les enregistrements de terrain à long terme et les études de patch-clamt.
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Protocol
Le protocole est réalisé conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health et approuvé par le Stanford University Institutional Animal Care and Use Committee. Les méthodes sont également conformes aux politiques de la Society for Neuroscience on the Use of Animals and Humans in Neuroscience Research.
REMARQUE : Toutes les souris ont été maintenues dans un environnement exempt d’agents pathogènes. Des souris de type sauvage sur des antécédents génétiques mixtes C57Bl/ 6 x SV/ 129J ont été utilisées ici, sauf indication contraire.
1. Configuration
- Préparer 1 L de 1x aCSF (en mM): 125 NaCl, 26 NaHCO3, 2,3 KCl, 1,26 KH2PO4, 1,3 Mg2SO4·7H2O, 2,5 CaCl2, 25 glucose (Tableau 1). Utilisez cette solution pour la chambre de récupération et les enregistrements ultérieurs.
REMARQUE : Stockez l’ACSF sous forme de solution de stock 10x qui contient naCl, NaHCO3,KCl et KH2PO4. Stockez Mg2SO4·7H2O et CaCl2 comme solutions de stock de 1 M. Préparer la solution de travail le jour de l’expérience à partir des solutions de stock ci-dessus, et ajouter du glucose avant d’ajuster le volume final avec 18 MΩ d’eau.
NOTE: Selon la région du cerveau ou la souche de souris, aCSF réfrigéré peut également être utilisé pour la perfusion transcardique avec succès11,15,26. - Préparer 300 mL de NMDG-aCSF (en mM): 135 NMG, 1 KCl, 1.2 KH2PO4, 1.5 MgCl2, 0.5 CaCl2, 20 bicarbonate de choline, 10 glucose (Tableau 1). Ce volume de NMDG-aCSF est suffisant pour la perfusion transcardique et les étapes de coupe.
REMARQUE : Stockez NMDG-aCSF comme solution de stock 3x à 4 °C. Préparer une solution de travail le jour de l’expérience; ajouter le bicarbonate de choline et le glucose avant d’ajuster le volume final avec 18 MΩ d’eau. Bullez la solution avec 95%O2/5%CO2 pour la tamponner, et saturer avec de l’oxygène.
REMARQUE : Le stock de NMDG commence comme très alcalin et nécessite de l’acide chlorhydrique concentré (HCl) pour ajuster le pH à ~7,4. L’ajout d’acide chlorhydrique doit être lent une fois en dessous du pH 8, car il est facile d’acidifier la solution à ~pH 3 avec l’excès de HCl. Cet ajustement doit être effectué avant d’ajouter des cations divalentes. Cette recette NMDG-aCSF est sans sodium. Les recettes NMDG précédemment publiées utilisent 30 mM NaHCO3 pour la mise en mémoire tampon, ce qui se traduit par 30 mM de sodium présents dans NMDG-aCSF13,20. - Réglez le plateau de coupe de microtome vibrant et le disque de montage à -20 °C.
- Préparer la chambre de récupération.
- Remplissez la chambre de récupération juste au-dessus de la maille de fixation de tranches, gardez-la sur le banc à température ambiante, et bullez..
NOTE: La chambre de récupération de tranches utilisée ici est très similaire aux chambres classiques décrites précédemment par Edwards et Konnerth3. aCSF est conservé dans un bécher en verre (400 mL) qui tient un cadre acrylique rond avec maille de nylon noir collé au fond. Le cadre acrylique est suspendu au milieu du bécher via un crochet acrylique reposant sur le bord du bécher. Le bulleur de verre est inséré jusqu’au fond. La conception permet l’oxygénation des deux côtés des tranches. Le bouillonnement fournit également un mélange constant d’aCSF dans la chambre de récupération. Le maillage noir offre un contraste élevé avec les tranches blanc cassé, qui sont alors plus faciles à voir.
- Remplissez la chambre de récupération juste au-dessus de la maille de fixation de tranches, gardez-la sur le banc à température ambiante, et bullez..
- Préparer la perfusion transcardique et la solution de coupe.
- Refroidir les 300 ml entiers de NMDG-acsf dans un congélateur, jusqu’à ce que des cristaux de glace commencent à se former à la surface et aux parois de la bouteille. NE PAS trop geler!
- Placez la bouteille avec le NMDG-aCSF réfrigéré sur la glace et la bulle. La solution doit être comprise entre 0\u20122 °C.
REMARQUE : Slushy NMDG- aCSF implique d’avoir la plupart de la solution comme liquide, tandis qu’une petite fraction de glace fondante présente gardera la solution près de 0 °C tout au long de la perfusion et de la coupe. Il faut prendre soin d’éloigner les cristaux de glace du cerveau pendant la coupe.
- Préparez le disque de montage tissulaire.
- Sortez le disque du congélateur, essuyez-le si nécessaire.
- Découpez un bloc d’agar de 5% de la plaque d’agar préalablement préparée, et collez-le au centre du disque à l’aide d’une fine couche de colle cyanoacrylate. La pièce d’agar devrait être d’environ la taille d’un cerveau de souris. Placez le disque avec de l’agar collé sur de la glace et couvrez-le de serviettes en papier jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
- Pour 5% de plaque d’agar, dissoudre 5 g d’agar dans 100 mL d’eau de 18 MΩ par micro-ondes, et verser dans une boîte de Pétri propre. Conserver à 4 °C.
- Sortez le plateau de découpe du congélateur, placez-le dans le microtome, entourez-le de glace et chargez la lame.
2. Perfusion transcardique et extraction du cerveau
- Souris de surdosage par une injection intrapéritoneal du cocktail anesthésique. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant le réflexe de douleur (pincement aux orteils); une souris ne doit pas montrer le réflexe une fois qu’elle atteint l’anesthésie profonde.
REMARQUE : Recette de cocktail d’anesthésie de rongeur : Kétamine HCl (66 mg/mL), xylazine HCl (6.6 mg/mL), maléate d’acepromazine (0.1 mg/mL), 18 MΩ d’eau au volume final. Dose : 0,4 mg/g de poids corporel, 0,04 mg/g de poids corporel, 6 x 10-4 mg/g de poids corporel pour la kétamine, la xylazine et l’acépromazine, respectivement. - Mettre en place la pompe péristaltique pour la perfusion transcardique. Insérez un côté du tube de la pompe dans la bouteille avec NMDG-aCSF glacé. Placez l’autre côté du tube avec l’aiguille de 27 G qui sera insérée dans le ventricule gauche.
- Réglez la vitesse de la pompe à environ 3,5 mL/min. À cette vitesse, la sortie de NMDG-aCSF est un débit rapide et non continu.
REMARQUE : La perfusion par gravité est un bon substitut à la perfusion de la pompe péristaltique, tant que le même débit approximatif peut être atteint. Une perfusion à débit élevé entraînera une explosion des vaisseaux sanguins dans le cerveau. Un signe révélateur d’une perfusion trop rapide et d’une pression accrue dans les vaisseaux sanguins est la solution sortant du nez de l’animal. - Perfusion
- Placez la souris correctement anesthésiée sur son dos sur une couche. À l’aide de ruban adhésif, collez le ruban adhésif sur les pattes avant et arrière afin que la poitrine et l’abdomen soient exposés.
- Découpez une grande parcelle de la peau au sommet de la poitrine, allant du dessous du sternum à la gorge; cela devrait fournir une grande zone de travail. Prenez le sternum avec des forceps, soulevez doucement, et commencez à couper à travers la cage thoracique des deux côtés jusqu’à ce que la cavité thoracique est exposée.
- Couper à travers le diaphragme afin d’exposer la cavité thoracique. Le rabat de la cage thoracique doit être laissé attaché par un mince morceau de muscle. Il devrait être possible de le mettre sur un côté sans qu’il retombe sur la cavité thoracique exposée. Vérifiez que le cœur bat encore. Assurez-vous que la majeure partie du foie est visible.
- Insérez l’aiguille de 27 G dans le ventricule gauche; le ventricule gauche de la souris semble plus léger que la droite. Localisez l’atrium droit de couleur rouge foncé. Couper à travers l’atrium droit avec de petits ciseaux; le sang devrait commencer à couler.
- Démarrez la pompe qui a été prédéfinie à la vitesse de débit correcte. Si tout a été fait correctement, le foie devrait commencer à changer de couleur du rouge au brun peu de temps après le début de la perfusion. Surveiller la couleur du foie pour déterminer la longueur de la perfusion; le foie doit devenir brun pâle.
- Faites fonctionner la pompe pendant quelques minutes de plus. Si vous utilisez un thermomètre rectal, la température corporelle doit descendre à 28\u201229 °C, et le nez de l’animal doit être froid au toucher.
- Extraction cérébrale.
REMARQUE : Pour cette étape, préparez les outils de dissection suivants : ciseaux de décapitation, petits ciseaux avec lame droite ou inclinée, scalpel et lame de #10, lame à bord unique, #3 forceps, spatule d’un côté plié à 90°, spatule, outil « 0 »(figure 1A,B),et une petite brosse molle.- Décapiter la souris avec de grands ciseaux de décapitation. À l’aide d’un scalpel avec #10 lame, couper la peau sur le dessus du crâne. Avec de petits ciseaux inclinés, couper le crâne à la ligne médiane. Ensuite, en utilisant les #3 forceps, arracher les moitiés droite et gauche du crâne, en prenant soin d’emporter le dura loin avec elle. Le cerveau devrait être exposé maintenant.
REMARQUE : Si la dura se détache du crâne, elle restera au-dessus du cerveau et doit être enlevée séparément. Les bords du dura restant peuvent se resserrer et trancher profondément à travers le cerveau, potentiellement endommager la région du cerveau d’intérêt. - Retirez le cerveau en le ramassant à l’aide d’une petite spatule. Déposez le cerveau dans la solution NMDG-aCSF placée dans un petit bécher séparé sur la glace. Laissez-le là jusqu’à une minute.
REMARQUE : En plus de l’hypothermie, l’exposition à la solution saline glacée raffermit le cerveau, ce qui est nécessaire pour même couper. L’ensemble de la procédure de décapitation à l’extraction du cerveau devrait être inférieur à 30 s.
- Décapiter la souris avec de grands ciseaux de décapitation. À l’aide d’un scalpel avec #10 lame, couper la peau sur le dessus du crâne. Avec de petits ciseaux inclinés, couper le crâne à la ligne médiane. Ensuite, en utilisant les #3 forceps, arracher les moitiés droite et gauche du crâne, en prenant soin d’emporter le dura loin avec elle. Le cerveau devrait être exposé maintenant.
3. Découpage
- Sortez le cerveau du NMDG-aCSF et placez-le sur un morceau de papier filtre.
- Couper et retirer un coin de 60° de l’extrémité rostrale du cerveau avant à l’aide d’un outil « 0 » centré sur la ligne médiane. Les surfaces coupées seront utilisées pour le montage afin d’obtenir l’angle approprié pour les tranches d’hippocampe transversales, comme nousl’avonsvu ci-dessous ( figure 1A,B).
REMARQUE : Deux lames à un tranchant maintenues ensemble par l’intermédiaire d’un support fait maison constituent un outil facile à utiliser pour la coupe de 60° (figure 1A). - Séparer les hémisphères en bas de la ligne médiane avec le scalpel.
- Collez les hémisphères sur le disque de montage comme suit. Prenez le disque de montage qui a été sur la glace jusqu’à présent. Si nécessaire, essuyez-le à nouveau. Collez chaque hémisphère devant le bloc d’agar, côté coupé vers le bas.
- Assurez-vous que le côté ventral de chaque hémisphère touche le bloc d’agar. Le bloc d’agar fournit un soutien supplémentaire pendant la coupe et est essentiel pour même les tranches. Les côtés dorsaux de chaque hémisphère doivent être orientés vers la lame. Lorsqu’il est collé sur le côté coupé, chaque hémisphère est orienté par rapport à la lame d’une manière qui se traduit par des tranches transversales d’hippocampe dorsal in situ (Figure 1B).
- Submergez le disque avec des hémisphères dans une chambre de coupe contenant du NMDG-aCSF carbogené glacé.
- Couper 400 sections de μm. La coupe doit être faite en moins de 10 min. Différents microtomes nécessiteront différents paramètres pour atteindre ce temps. Un total de 8\u201210 tranches de la région de l’hippocampe dorsal sera obtenu.
4. Récupération
- Transférer les tranches dans une chambre de récupération contenant de l’aCSF carbogénée à température ambiante à l’aide de pipettes de transfert jetables avec des pointes de coupure (figure 1C).
NOTE: Il est fortement recommandé de fortifier chambre de récupération-aSCF avec 5 mM Na-ascorbate et 3 mM Na-pyruvate. Pyruvate est un substrat énergétique montré pour stimuler la production d’ATP en tranches28, tandis que Na-ascorbate est un quencher de radical libre29. - Incuber à température ambiante (22\u201224 °C) pendant environ 2 h avant l’enregistrement (jusqu’à 4 h).
REMARQUE : Une incubation plus longue à température ambiante entraîne des tranches plus saines pendant de plus longues périodes, par rapport à l’incubation standard à 37 °C pendant 30 min suivie d’une incubation à température ambiante. Le réchauffement à 37 °C peut introduire l’oedème cytotoxique13.
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Representative Results
Nous avons appliqué le protocole ci-dessus pour générer des tranches d’hippocampe de CamKIIa-Cre+; Souris WT sur un fond génétique mixte C57Bl/ 6 x SV/ 129J, à P > 120. Un grand nombre de cellules pyramidales dans le champ CA1 (figure 2A) et le subiculum (figure 2B) apparaissent en contraste faible lorsqu’elles sont observées sous microscopie différentielle de contraste infrarouge (IR-DIC), une caractéristique des cellules saines dans une préparation de tranches. Avec cette préparation, un taux élevé de joints giga-ohm (>90%) est systématiquement atteint lors du ciblage des cellules les plus saines environ 20\u201250 microns sous la surface. Pour ce taux de réussite, il est important d’utiliser un objectif élevé de NA pour IR-DIC, tel qu’un objectif d’immersion 60x d’eau, afin d’obtenir une visualisation adéquate des cellules pyramidales à cette profondeur (Figure 2A,B).
Les enregistrements de patch-clamp à partir de neurones simples sont facilement réalisables en utilisant cette préparation de tranche hippocampal même chez les souris de plus de six mois. La figure 2C montre une expérience d’exemple utilisant des enregistrements de courants postsynaptiques excitateurs miniatures (MEPSC) provenant de neurones CA1. L’induction du produit chimique NMDA-LTD avec l’application de bain de 20 μM NMDA pour 3 min abaisse la fréquence de mEPSC dans les cellules CA1 lorsqu’elle est évaluée 60 min post-NMDA. Cette constatation suggère que NMDA-LTD provoque l’élagage des synapses dépendantes de l’activité chez les souris plus âgées (résultats adaptés de Djurisic et al.15). Le changement dans l’amplitude de mEPSC n’a pas été détecté. Pendant les enregistrements de mEPSC, les cellules de CA1 ont également été remplies de biocytine. La figure 2D révèle une arborescence dendritique intacte et un habitus cellulaire sain des neurones pyramidaux DEA1 remplis de biocytine. Une distribution robuste du colorant fluorescent dans toute la cellule permet d’évaluer de routine les propriétés de la colonne vertébrale dendritique dans différentes conditions expérimentales.
À l’aide d’enregistrements sur le terrain, on a facilement observé la potentialisation à long terme (LTP) d’environ 170 % des synapses CA3-CA1 en tranches de souris adultes, ce qui suggère le maintien des cascades de signalisation nécessaires au PLT (figure 2E,F). La connectivité réseau nécessaire pour un signal de postsynaptique excitateur robuste sur le terrain (FEPSP) est également préservée (Figure 2E). La capacité d’évaluer la plasticité synaptique dans les tranches hippocampales de souris adultes ou vieillissantes est particulièrement pertinente pour les modèles de souris de maladies neurodégénératives que leur dysfonctionnement synaptique caractéristique se développe plus tard dans la vie.
Ensemble, nos résultats démontrent qu’une préparation hippocampale aiguë des souris adultes et vieillissantes permet l’évaluation de la fonction synaptique au niveau des cellules simples et de la population de cellules régulièrement, tant que la perfusion transcardique et les solutions à base de NMDG glace-froid sont employées pour minimiser des dommages hypoxiques.
Figure 1 : Méthode de coupe et récupération des tranches hippocampales transversales de souris adultes et vieillissantes. (A) Un outil « 0 » utilisé pour enlever le coin de 60° de l’extrémité rostral du cerveau, centré sur la ligne médiane. (B) Positionnement des hémisphères pour la coupe des tranches transversales. Une illustration d’une coupe de 60° est montrée sur les panneaux gauche et supérieur droit; le positionnement des deux hémisphères sur la surface avec de la colle de manière indiquée dans le panneau inférieur droit assure une orientation perpendiculaire de l’hippocampe dorsal par rapport à la lame. Cette orientation se traduit par des tranches transversales d’hippocampe. Les structures jaunes sont un rendu 3D de l’hippocampe dans le cerveau des rongeurs (gris). Cette illustration est adaptée de SynapseWeb30. Toutes les vues sont du côté dorsal du cerveau. (C) Tranches hippocampales transversales coupées à partir d’une souris de 4 mois dans une chambre de récupération. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Mesures de la plasticité des pinces et synaptiques dans les tranches hippocampales de souris à P120\u2012180. (A) Un exemple de micrographe IR-DIC de la région CA1. (B) Exemple de micrographes IR-DIC de subiculum. En A et B, les images sont prises 3 h après la coupe avec un objectif d’immersion 60x d’eau. La barre d’étalonnage est de 10 μm. (C) L’effet de la NMDA-LTD chimique sur les MEPSC dans les neurones CA1 des souris P120\u2012180. Les panneaux supérieurs sont des traces d’exemples de MEPSC enregistrées à la ligne de base et après l’impulsion NMDA-LTD. Panneau inférieur gauche : NMDA-LTD a entraîné une fréquence mEPSC plus faible. Panneau inférieur droit : changement d’amplitude du MEPSC après la détection de NMDA-LTD. N = 17 cellules à la ligne de base et n = 15 cellules pour NMDA-LTD, 6 souris. P = 0,004, t-test. Ce chiffre a été modifié à partir de Djurisic et al.15. (D) Exemple de cellule pyramidale CA1 remplie de biocytine. (E) Exemple de signal fEPSP de la strate raditum CA1 après stimulation collatérale de Schaffer. La trace grise est obtenue pendant l’enregistrement de base, et la trace noire est observée 20 min après stimulation tétanique. Chaque trace est en moyenne de 30 traces consécutives. (F) Moyenne cumulative de la potentialisation à long terme des synapses CA3-CA1 après 4 trains d’induction de 100 Hz; n = 23 tranches de 8 souris WT à environ P90. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) | ||||
| Ingrédients | Mw | Conc final (mM) | g/2 Litres (10X) | g/Litre (1X) |
| Nacl | 58.44 | 125 | 146.1 | - |
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | 43.68 | - |
| Kcl | 74.55 | 2.3 | 3.43 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.26 | 3.44 | - |
| Mg2SO4*7H2O | 203.3 | 1.3 | - | 1,3 ml de stock de 1 M |
| CaCl2*2H2O | 147.02 | 2.5 | - | 2,5 ml de stock de 1 M |
| Glucose*H2O | 180.2 | 25 | - | 4,5 g |
| a) Ajouter Mg2SO4*7H2O et CaCl2*2H2O à partir de stocks 1M | ||||
| b) aCSF 10X garder @RT | ||||
| c) aCSF 1X @4°C pour 24h | ||||
| NMDG-aCSF | ||||
| Ingrédients | Mw | Conc final (mM) | g/2 Litres (3X) | g/300 ml (1X) |
| NMDG | 195.22 | 135 | 158.13 | - |
| pH=7,4 avec HCl | ||||
| Kcl | 74.55 | 1 | 0.4473 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.2 | 0.9799 | - |
| MgCl2*6H2O | 203.3 | 1.5 | 1.8297 | - |
| CaCl2*2H2O | 147.02 | 0.5 | 0.4411 | - |
| Choline Bicarbonate | 80% | 20 | - | 1238 μl |
| Glucose*H2O | 180.2 | 10 | - | 0.54 |
| a) Filtrer et stocker la solution de stock 3X à 4°C | ||||
Tableau 1 : Formulations de médias.
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Discussion
Le protocole décrit ici démontre que les tranches hippocampales obtenues à partir de souris adultes et vieillissantes peuvent rester en bonne santé et viables pendant de nombreuses heures après la coupe. Les tranches préparées à l’aide de ce protocole sont appropriées pour les enregistrements de pinces à patch, ainsi que les enregistrements de terrain de longue durée dans les régions CA1.
Il y a deux étapes critiques dans ce protocole. La première étape est l’étape de perfusion transcardique avec une solution glacée. Le dégagement rapide du sang est signalé par le changement rapide de la couleur du foie. Le cerveau extrait doit être de couleur blanc cassé. Si le cerveau reste rose, cela signifie que le sang systémique n’a pas été remplacé par le froid NMDG-aCSF, et la baisse de la température corporelle n’a pas été réalisée. Cela pourrait être causé par un placement inapproprié de l’aiguille dans le cœur, ou parce que le cœur a été perforé à travers. Les cerveaux de souris mal perfusées ne doivent pas être utilisés pour trancher. La deuxième étape critique est l’utilisation de NMDG comme substitut d’ion de sodium. Une variation antérieure bien connue du protocole qui utilise avec succès le saccharose comme substitut de Na+ dans le cerveau des rats10,31 ne produit pas suffisamment de tranches hippocampales en bonne santé chez les souris (voir également Ting et al.13). L’utilisation de NMDG comme substitut d’ion de sodium est essentielle pour les tranches hippocampales de souris.
Tandis que les tranches d’hippocampe saines sont obtenues de manière fiable utilisant le protocole décrit, la préparation hippocampal des animaux adultes et vieillissants reste difficile. Sa difficulté change également avec différentes lignes de souris et milieux génétiques. Les modifications potentielles à considérer sont des additifs aux solutions NMDG-aCSF et recovery-aCSF comme la taurine, la D-serine ou la N-acétylcystéine (NAC), qui pourraient augmenter la fonction neuronale et synaptique13,29, augmenter l’oxygénation29. La substitution des ions Cl-ions doit également être envisagée pendant la perfusion et la coupe32. L’utilisation d’une chambre de récupération d’interface est une autre façon de maintenir une oxygénation accrue, ce qui est particulièrement pertinent pour les enregistrements de champ de plasticité à long terme. La chambre de récupération décrite (figure 1C) est modifiable à cette fin (p. ex., un plat d’insertion de culture qui est humidifié par le bas par l’ASCF, pourrait remplacer le maillage submergé). Le remplacement des lames d’acier par des lames de saphir ou de céramique pourrait diminuer la compression tissulaire exacerbée par une forte myélinisation de la matière blanche autour de l’hippocampe; cela pourrait à son tour améliorer encore la qualité des neurones près de la surface de la tranche. L’utilisation de microtomes conçus pour minimiser les vibrations verticales (p. ex., zéro-z dans Leica VT1200S), est une autre étape modifiable.
D’autres régions du cerveau pourraient être tranchées à l’aide du protocole décrit ici, avec des modifications appropriées dans les angles de coupe. En outre, la rigueur de la préparation de tranche peut être ajustée, car différentes régions du cerveau sont sensibles à l’hypoxie à différents degrés. Un protocole qui utilise un NMDG-aSCF a été signalé pour les préparations adultes de tranches de souris13,20; il utilise un NMDG-aCSF qui contient 30 mM NaHCO3 (c’est-à-dire qu’il n’est pas Na+-gratuit)20, et dans certains cas la perfusion transcardique est avec NMDG-aCSF à température ambiante13. Cependant, pour une région aussi sensible à l’hypoxie que l’hippocampe, l’utilisation de Na+-free NMDG-aCSF et la perfusion transcardique glacée pourrait faire une différence critique.
Ce protocole s’applique à la vaste gamme de lignes de souris transgéniques modélisant les maladies neurodégénératives. En outre, le protocole pourrait être modifié en tranches cérébrales d’autres espèces modèles de mammifères, ainsi. Ensemble, ce protocole pourrait servir de base pour une préparation normalisée pour les tranches hippocampales aiguës des animaux vieillissants, et ainsi faciliter les comparaisons entre les études dans le contexte des mécanismes de la maladie.
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Disclosures
L’auteur n’a rien à divulguer.
Acknowledgments
Je remercie la Dre Carla J. Shatz pour ses conseils et leur soutien, ainsi que la Dre Barbara K. Brott et Michelle K. Drews d’avoir lu le manuscrit de façon critique. Les travaux sont soutenus par les NIH EY02858 et les subventions de la Fondation de bienfaisance Mathers à CJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
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