Summary
Dette er en protokoll for akutt skive forberedelse fra voksen og aldrende mus hippocampi som utnytter transcardial perfusjon og skive skjæring med iskald NMDG-aCSF for å redusere hypoksisk skade på vevet. De resulterende skivene holder seg friske over mange timer, og er egnet for langsiktig patch-clamp og feltopptak.
Abstract
Akutte hippocampal skiver har gjort det mulig for generasjoner av nevrologer å utforske synaptiske, nevronale og kretsegenskaper i detalj og med høy troskap. Utforskning av LTP- og LTD-mekanismer, enkeltneurn dendrittisk beregning og erfaringsavhengige endringer i kretser, ville ikke ha vært mulig uten dette klassiske preparatet. Men med noen få unntak har de fleste grunnleggende undersøkelser ved hjelp av akutte hippocampalskiver blitt utført ved hjelp av skiver fra gnagere i relativt ung alder, ~ P20-P40, selv om synaptiske og iboende spenningsmekanismer har en lang utviklingshale som når forbi P60. Den viktigste appellen ved å bruke unge hippocampal skiver er bevaring av nevronal helse hjulpet av høyere toleranse for hypoksisk skade. Det er imidlertid behov for å forstå nevronal funksjon på mer modne stadier av utviklingen, ytterligere fremhevet av utviklingen av ulike dyremodeller av nevrodegenerative sykdommer som krever et aldrende hjerneforberedelse. Her beskriver vi en modifikasjon av en akutt hippocampal skive forberedelse som pålitelig leverer sunne skiver fra voksen og aldrende mus hippocampi. Protokollens kritiske trinn er transcardial perfusjon og kutting med iskald natriumfri NMDG-aSCF. Sammen demper disse trinnene den hypoksiinduserte nedgangen i ATP ved halshugging, samt cytotoksisk ødem forårsaket av passive natriumflukser. Vi demonstrerer hvordan å kutte tverrgående skiver av hippocampus pluss cortex ved hjelp av en vibrerende mikrotom. Akutte hippocampal skiver oppnådd på denne måten er pålitelig sunt over mange timer med opptak, og er egnet for både feltopptak og målrettede patch-clamp opptak, inkludert målretting av fluorescerende merkede nevroner.
Introduction
Bruk av pattedyr akutt hjerne skive preparater tilrettelagt eksperimenter på celle- og synaptisk nivå som tidligere var mulig bare i virvelløse preparater som Aplysia1. Utvikling av akutte hippocampal skiver var av særlig betydning, da det er en struktur som er ansvarlig for arbeidsminne og kontekstdannelse, og har en spesialisert trisynaptisk krets som er mottagelig for enkel fysiologisk manipulasjon. Imidlertid er det store flertallet av akutte hjerneskiver fortsatt forberedt fra relativt unge mus og rotter, da det er lettere å bevare sunne nevroner og kretser, og skivene forblir levedyktige i lengre perioder2,3,4. Her introduserer vi endringer i standard kutteprotokoller som resulterer i økt levedyktighet av akutte hippocampalskiver fra voksne og aldrende mus.
Den store hindringen for den langsiktige ex vivo levedyktigheten til pattedyr hjerneparenchyma er den første hypoksiske skaden som oppstår raskt når blodstrømmen til hjernen slutter etter halshugging. Tap av oksygen resulterer i raskt metabolsk forbruk av store energiressurser i hjernen med tap av fosfo-kreatin (P-kreatin) som den raskeste, etterfulgt av glukose, adenosin trifosfat (ATP), og glykogen4. Bevaring av ATP er av særlig betydning for den langsiktige helsen til hjerneskiver, da ATP er nødvendig for å opprettholde membranpotensialet via Na-K ATPase, og dermed nevraleaktiviteten 5,6. ATP-nivået i den voksne gnagerhjernen er ~ 2,5 mM, og den faller stupbraps innen 20 s av halshugging for å nå en basal steady state (~ 0,5 mM) på rundt 1 min post-halshugging4,7,8. Hos unge dyr tar det lengre tid å observere samme fall i ATP (~ 2 min); med fenobarbital anestesi er det ytterligere redusert til 4 min4. Disse betraktningene viser at forebygging av tap av ATP og andre energiressurser er en nødvendig strategi for å forhindre hypoksisk skade på hjernen og i sin tur for å opprettholde helsen til hjerneskiver over lengre perioder, spesielt hos voksne dyr.
Lave temperaturer bremse stoffskiftet. Følgelig har det vist seg at beskjeden hypotermi beskytter hjernens energireserver: hos unge dyr, senke kroppstemperaturen med seks grader, fra 37 ° C til 31 ° C, bevarer ATP nivåer til rundt 80% av normale nivåer over 4 timer kontrollert hypoksi9. P-kreatinnivåer er tilsvarende bevart, samt det totale fosforyleringspotensialet9. Dette tyder på at senking av kroppstemperatur før halshugging kan være nevrobeskyttende, da nesten normale nivåer av ATP kan opprettholdes gjennom skiveskjæring og skive utvinning perioder.
I den grad at en ATP-dråpe ikke kan forhindres helt ved halshugging, forventes en delvis svekket funksjon av Na-K ATPase, etterfulgt av depolarisering via passiv natriumtilstrømning. Som passiv natriumtilstrømning etterfølges av vanninntreden i celler, forårsaker det cytotoksisk ødem og til slutt pyknose. Hos voksne rotter har det å erstatte Na+ ioner med sukrose i skiveskjæringsløsninger vært en vellykket strategi for å lindre byrden av cytotoksiskødem 10,,11. Mer nylig har metylert organiske kasjoner som reduserer natriumkanalpermeabilitet12 vist seg å gi mer effektiv beskyttelse enn sukrose, spesielt i skiver fra voksne mus, med N-metyl-D-glukan (NMDG) som er mest aktuelt på tvers av ulike aldre oghjerneregioner 13,,14,,15,,16.
Tallrike hjerne-slicing protokoller innebærer å bruke kalde temperaturer bare under skive-cutting trinn, noen ganger i kombinasjon med Na+ ion erstatning strategi16,17. Hos unge dyr ser disse protokollene ut til å tilby tilstrekkelig nevrobeskyttelse siden hjernen kan ekstraheres raskt etter halshugging fordi skallen fortsatt er tynn og lett å fjerne3. Denne strategien produserer imidlertid ikke sunne skiver fra voksne dyr. Over tid har en rekke laboratorier som studerer voksne gnagere introdusert transcardial perfusjon med en iskald løsning for å redusere dyrets kroppstemperatur, og derfor hypoksisk skade på hjernen, før halshugging. Denne prosedyren ble brukt til å produsere lillehjernen skiver18, midbrain skiver19, neokortikale skiver11,20, perirhinal cortex21, rotte hippocampus10,22,23, olfactory pære24, ventral striatum25, visuell cortex26.
Til tross for fordelene som tilbys av transcardial perfusjon og Na+ ion erstatning i å forberede skiver fra rotte og i noen hjerneregioner i mus, mus hippocampus er fortsatt en av de mest utfordrende områdene for å beskytte mot hypoksi13,20. Til dags dato innebærer en av de vanligste tilnærmingene til å kutte hippocampus fra aldrende mus og musemodeller av nevrodegenerasjon den klassiske raske kuttingen av den isolerte hippocampi27. I protokollen som er beskrevet her, minimerer vi tapet av ATP i den voksne hjernen ved å innføre hypotermi før halshugging ved å transkarialt perfusere dyret med iskald Na+- gratis NMDG-basert kunstig cerebrospinalvæske (NMDG-aCSF). Skiver kuttes deretter i iskald Na+ -freeNMDG-aCSF. Med denne forbedrede protokollen får vi akutte hippocampalskiver fra voksne og aldrende mus som er sunne i opptil 10 timer etter kutting og passer for langsiktige feltopptak og patch-clamp-studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen utføres i samsvar med Veiledning for omsorg og bruk av laboratoriedyr ved National Institutes of Health og godkjent av Stanford University Institutional Animal Care and Use Committee. Metoder er også i samsvar med retningslinjene til Society for Neuroscience om bruk av dyr og mennesker i nevrovitenskapsforskning.
MERK: Alle mus ble opprettholdt i et patogenfritt miljø. Wild-type mus på blandet C57Bl / 6 x SV / 129J genetisk bakgrunn ble brukt her, med mindre annet er angitt.
1. Oppsett
- Forbered 1 L av 1x aCSF (i mM): 125 NaCl, 26 NaHCO3, 2,3 KCl, 1,26 KH2PO4, 1,3 Mg2SO4·7H2O, 2,5 CaCl2, 25 glukose (tabell 1). Bruk denne løsningen for gjenopprettingskammeret og påfølgende opptak.
MERK: Lagre aCSF som en 10x lagerløsning som inneholder NaCl, NaHCO3, KCl og KH2PO4. Lagre Mg2SO4·7H2O og CaCl2 som 1 M lagerløsninger. Forbered arbeidsløsningen på eksperimentdagen fra de ovennevnte lagerløsningene, og tilsett glukose før du justerer det endelige volumet med 18 MΩ vann.
MERK: Avhengig av hjerneområdet eller musestammen kan kjølt aCSF også brukes til transkardiodfusjon med suksess11,,15,,26. - Forbered 300 ml NMDG-aCSF (i mM): 135 NMDG, 1 KCl, 1,2 KH2PO4,1,5 MgCl2,0,5 CaCl2,20 kolinbikarbonat, 10 glukose (tabell 1). Dette volumet av NMDG-aCSF er tilstrekkelig for både transcardial perfusjon og kutte trinn.
MERK: Lagre NMDG-aCSF som en 3x lagerløsning ved 4 °C. Forbered arbeidsløsning på dagen for eksperimentet; tilsett kolinbikarbonat og glukose før du justerer det endelige volumet med 18 MΩ vann. Boble løsningen med 95% O2/ 5% CO2 for å bufre den, og mette med oksygen.
MERK: NMDG-aksjen starter som svært alkalisk, og krever konsentrert saltsyre (HCl) for å justere pH til ~7,4. Tilsetning av saltsyre bør være treg en gang under pH 8, da det er lett å forsure løsningen til ~ pH 3 med overflødig HCl. Denne justeringen bør gjøres før du legger til divalente kasjoner. Denne NMDG-aCSF oppskriften er natriumfri. Tidligere publiserte NMDG oppskrifter bruker 30 mM NaHCO3 for bufring, noe som resulterer i 30 mM natrium til stede i NMDG-aCSF13,20. - Sett den vibrerende mikrotomkuttebrettet og monteringsskiven til -20 °C.
- Forbered gjenopprettingskammeret.
- Fyll gjenopprettingskammeret til like over skive-holding mesh, holde den på benken ved romtemperatur, og boble.
MERK: Skivegjenvinningskammeret som brukes her er svært lik de klassiske kamrene beskrevet tidligere av Edwards og Konnerth3. aCSF holdes i et glassbeger (400 ml) som holder en rund akrylramme med svart nylonnett limt til bunnen. Akrylrammen er suspendert i midten av begeret via en akrylkrok som hviler over kanten av begeret. Glassbobleren settes helt inn til bunnen. Utformingen gjør det mulig for oksygenering av begge sider av skiver. Boblende gir også konstant blanding av aCSF i gjenopprettingskammeret. Det svarte nettet gir en høy kontrast mot de off-white skiver, som da er lettere å se.
- Fyll gjenopprettingskammeret til like over skive-holding mesh, holde den på benken ved romtemperatur, og boble.
- Forbered transcardialperfusjon og skjæreløsning.
- Chill hele 300 ml NMDG-aCSF i en fryser, til iskrystaller begynner å danne seg på overflaten og veggene i flasken. IKKE for fryse for mye!
- Plasser flasken med kjølt NMDG-aCSF på is og boble. Oppløsningen skal være mellom 0\u20122 °C.
MERK: Slushy NMDG- aCSF innebærer å ha det meste av løsningen som væske, mens en liten brøkdel av slapsete is tilstede vil holde løsningen nær 0 ° C gjennom perfusjon og skjæring. Det bør tas hensyn til å holde iskrystaller borte fra hjernen under kutting.
- Forbered vevsmonteringsskiven.
- Ta disken ut av fryseren, tørk den tørt om nødvendig.
- Klipp ut en blokk på 5% agar fra den tidligere forberedte agarplaten, og lim den i midten av disken ved hjelp av et tynt lag cyanoacrylat lim. Agarstykket skal være omtrent på størrelse med en musehjerne. Plasser disken med limt agar på is, og dekk med papirhåndklær til den er klar til bruk.
- For 5% agar plate, oppløs 5 g agar i 100 ml 18 MΩ vann ved microwaving, og hell i en ren petriskål. Oppbevars ved 4 °C.
- Ta skjærebrettet ut av fryseren, plasser det i mikrotomen, omgi det med is og legg bladet.
2. Transcardial perfusjon og hjerneutvinning
- Overdose mus via en intraperitoneal injeksjon av bedøvelse cocktail. Sjekk for anestesidybden ved å sjekke smerterefleksen (tåklemme); en mus bør ikke vise refleksen når den når dyp anestesi.
MERK: Gnagerbedøvelse cocktail oppskrift: Ketamin HCl (66 mg / ml), xylazine HCl (6,6 mg / ml), acepromazin maleat (0,1 mg / ml), 18 MΩ vann til endelig volum. Dose: 0,4 mg/g kroppsvekt, henholdsvis 0,04 mg/g kroppsvekt, 6 x 10-4 mg/g kroppsvekt for ketamin, xyazin og acepromazin. - Sett opp den peristaltiske pumpen for transkardiosjon. Sett den ene siden av pumpeslangen inn i flasken med iset NMDG-aCSF. Monter den andre siden av slangen med 27 G kanylen som skal settes inn i venstre ventrikkel.
- Still pumpehastigheten på ca. 3,5 ml/min. Ved denne hastigheten er utstrømningen av NMDG-aCSF et raskt drypp, ikke kontinuerlig strømning.
MERK: Perfusjon ved tyngdekraften er en god erstatning for peristaltisk pumpeperfusjon, så lenge den samme omtrentlige strømningshastigheten kan oppnås. En perfusjon ved høy strømningshastighet vil resultere i burst blodkar i hjernen. Et telltale tegn på en altfor rask perfusjon og økt trykk i blodårene er løsning som kommer ut av dyrets nese. - Perfusjon
- Plasser den riktig bedøvede musen på ryggen på en bleie. Bruk papirtape til å tape ned for- og bakbenene slik at brystet og magen blir utsatt.
- Klipp ut en stor flekk av huden på toppen av brystet, går fra under brystbenet til halsen; dette bør gi et stort arbeidsområde. Ta tak i brystbenet med tang, løft forsiktig og begynn å skjære gjennom brystkassen på begge sider til brysthulen er utsatt.
- Skjær gjennom membranen for å eksponere brysthulen. Klaffen på ribbeburet skal festes via et tynt stykke muskler. Det bør være mulig å sette den på en side uten at den faller tilbake på det eksponerte brysthulen. Sjekk at hjertet fortsatt slår. Sørg for at det meste av leveren er synlig.
- Sett 27 G-nålen inn i venstre ventrikkel; musens venstre ventrikkel ser lysere ut i fargen enn til høyre. Finn det mørke, rødfargede høyre atriumet. Skjær gjennom høyre atrium med liten saks; blodet skal begynne å strømme ut.
- Start pumpen som er forhåndsinnstilt til riktig strømningshastighet. Hvis alt ble gjort riktig, bør leveren begynne å endre farge fra rød til brun kort tid etter starten av perfusjonen. Overvåk leverfargen for å bestemme lengden på perfusjonen; leveren skal bli blek brun.
- Kjør pumpen i noen minutter til. Hvis du bruker rektal termometer, bør kroppstemperaturen falle ned til 28 \\ u201229 ° C, og dyrets nese bør være kaldt å ta på.
- Hjerneutvinning.
MERK: For dette trinnet, ha følgende disseksjonsverktøy klare: halshugging saks, liten saks med rett eller vinklet blad, skalpell og #10 blad, enkelt kant blad, #3 tang, slikkepott med den ene siden bøyd til 90°, en slikkepott, en "60°" verktøy (Figur 1A, B), og en liten myk børste.- Decapitate musen med store halshugging saks. Bruk en skalpell med #10 blad, kutt åpne huden på toppen av skallen. Med liten vinklet saks, kutt skallen på midtlinjen. Deretter bruker du #3, lirke bort høyre og venstre halvdel av skallen, vær forsiktig med å ta dura bort med den. Hjernen bør eksponeres nå.
MERK: Hvis dura løsner fra skallen, vil den forbli over hjernen og må fjernes separat. Kantene på den gjenværende duraen kan stramme og skjære dypt gjennom hjernen, noe som potensielt skader hjerneområdet av interesse. - Fjern hjernen ved å øse den ut med en liten slikkepott. Slipp hjernen inn i NMDG-aCSF-løsningen plassert i et eget lite beger på is. La den være der i opptil et minutt.
MERK: I tillegg til hypotermi, firmaer eksponering for den iskalde saltvann opp hjernen, noe som er nødvendig for jevn skjæring. Hele prosedyren fra halshugging til hjerneutvinningen bør være under 30 s.
- Decapitate musen med store halshugging saks. Bruk en skalpell med #10 blad, kutt åpne huden på toppen av skallen. Med liten vinklet saks, kutt skallen på midtlinjen. Deretter bruker du #3, lirke bort høyre og venstre halvdel av skallen, vær forsiktig med å ta dura bort med den. Hjernen bør eksponeres nå.
3. Kutting
- Ta hjernen ut av NMDG-aCSF og legg den på et stykke filterpapir.
- Klipp og fjern en 60° kile fra rostral enden av forebrain ved hjelp av et "60°" verktøy sentrert midt i. Kappeflater vil bli brukt til montering for å oppnå riktig vinkel for tverrgående hippocampal skiver som beskrevet nedenfor (Figur 1A, B).
MERK: To enkantede blader som holdes sammen via en hjemmelaget holder, gjør et brukervennlig verktøy for å lage 60° kutt (figur 1A). - Separate halvkuler ned midtlinjen med skalpellen.
- Lim halvkulene på monteringsskiven som følger. Ta monteringsskiven som har vært på is til nå. Tørk den om nødvendig igjen. Lim hver halvkule foran agarblokken, kutt side ned.
- Sørg for at ventral side av hver halvkule berører agarblokken. Agarblokken gir ekstra støtte under kutting og er avgjørende for jevne skiver. Dorsale sider av hver halvkule skal være vendt mot bladet. Når limt på den kuttede siden, er hver halvkule orientert i forhold til bladet på en måte som resulterer i tverrgående skiver av dorsal hippocampus in situ (Figur 1B).
- Senk disken ned med halvkuler i et skjærekammer som inneholder iskald karbagenert NMDG-aCSF.
- Klipp 400 μm seksjoner. Skjæring bør gjøres på mindre enn 10 min. Ulike mikrotomer vil kreve forskjellige innstillinger for å oppnå denne gangen. Totalt 8\u201210 skiver fra den dorsale hippocampus regionen vil bli oppnådd.
4. Gjenoppretting
- Overfør skiver til et gjenopprettingskammer som inneholder karbagenert aCSF ved romtemperatur ved hjelp av engangsoverføringspipetter med cut-off tips (figur 1C).
MERK: Det anbefales sterkt å styrke utvinningskammeret-aSCF med 5 mM Na-ascorbate og 3 mM Na-pyruvate. Pyruvat er et energisubstrat vist seg å øke produksjonen av ATP i skiver28,mens Na-ascorbate er en frittradikal quencher29. - Inkuber ved romtemperatur (22\u201224 °C) i ca. 2 timer før opptak (opptil 4 timer).
MERK: En lengre inkubasjon ved romtemperatur resulterer i sunnere skiver over lengre perioder, i forhold til standard inkubasjon ved 37 °C i 30 min etterfulgt av romtemperaturinkubasjon. Rewarming ved 37 °C kan introdusere cytotoksisk ødem13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brukte protokollen ovenfor for å generere hippocampus skiver fra CamKIIa-Cre +; WT mus på en blandet genetisk bakgrunn C57Bl / 6 x SV / 129J, på P > 120. Et stort antall pyramidale celler i CA1-feltet (figur 2A) og subiculum (figur 2B) vises i lav kontrast når de observeres under infrarød differensialkontrastmikroskopi (IR-DIC), et kjennetegn på friske celler i et stykkepreparat. Med dette preparatet, en høy hastighet på giga-ohm sel (> 90%) oppnås rutinemessig ved målretting av de sunneste cellene ca. 20\u201250 mikrometer under overflaten. For denne suksessraten er det viktig å bruke et høyt NA-mål for IR-DIC, for eksempel et 60x vannnedsenkingsmål, for å oppnå tilstrekkelig visualisering av pyramidale celler på denne dybden (figur 2A, B).
Patch-clamp opptak fra enkelt nevroner er lett oppnåelig ved hjelp av denne hippocampal skive forberedelse selv i mus over seks måneders alder. Figur 2C viser et eksempeleksperiment ved hjelp av miniatyreksittiske postsynaptiske strømmer (mEPSCer) opptak fra CA1 nevroner. Induksjon av kjemisk NMDA-LTD med bad påføring av 20 μM NMDA i 3 min senker mEPSC-frekvensen i CA1-celler når de vurderes 60 min behandling etter NMDA. Dette funnet tyder på at NMDA-LTD forårsaker aktivitetsavhengig beskjæring av synapser i CA1 hos eldre mus (resultater tilpasset fra Djurisic et al.15). Endring i mEPSC amplitude ble ikke oppdaget. Under mEPSC-opptak ble CA1-celler også fylt med biocytin. Figur 2D avslører en intakt dendrittisk arbor og sunn celle habitus av biocytin-fylt CA1 pyramideeevroner. En robust fordeling av fluorescerende fargestoff i hele cellen gir mulighet for rutinemessig evaluering av dendrittiske ryggraden egenskaper under ulike eksperimentelle forhold.
Ved hjelp av feltopptak ble det lett observert langsiktig potensering (LTP) på ~170 % av CA3-CA1-synapser i skiver fra voksne mus, noe som tyder på vedlikehold av signalkaskader som trengs for LTP (figur 2E,F). Nettverkstilkobling som trengs for et robust felt ekstiende postsynaptisk potensial (fEPSP) signal er også bevart (Figur 2E). Evnen til å vurdere synaptisk plastisitet i hippocampal skiver fra voksne eller aldrende mus er spesielt relevant for musemodeller av nevrodegenerative sykdommer som deres kjennetegn synaptisk dysfunksjon utvikler seg senere i livet.
Sammen viser våre resultater at et akutt hippocampalpreparat fra voksne og aldrende mus gjør det mulig å vurdering av synaptisk funksjon på nivå med både enkeltceller og cellepopulasjoner rutinemessig, så lenge transcardial perfusjon og iskalde NMDG-baserte løsninger brukes til å minimere hypoksisk skade.
Figur 1: Skjæremetode og gjenoppretting av tverrgående hippocampalskiver fra voksne og aldrende mus. (A) Et "60°" verktøy som brukes til å fjerne 60° kilen fra rostral enden av hjernen, sentrert på midtlinjen. (B)Posisjonering av halvkuler for kutting av tverrgående skiver. En illustrasjon av et 60° kutt vises til venstre og øvre høyre paneler; posisjonering av de to halvkulene på overflaten med lim på en måte vist i nedre høyre panel sikrer en vinkelrett orientering av dorsal hippocampus i forhold til bladet. Denne orienteringen resulterer i tverrgående skiver av hippocampus. Gule strukturer er en 3D-gjengivelse av hippocampi i gnagerhjernen (grå). Denne illustrasjonen er tilpasset fra SynapseWeb30. Alle utsikten er av den dorsale siden av hjernen. (C) Transversale hippocampal skiver kuttet fra en 4 måneder gammel mus i et gjenopprettingskammer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Patch-klemme og synaptisk plastisitetsmålinger i hippocampalskiver fra mus på P120\u2012180. (A)Et eksempel IR-DIC mikrograf av CA1-regionen. (B)Eksempel IR-DIC mikrografer av subiculum. I både A og B tas bilder 3 timer etter kutting med et 60x vannnedsenkingsmål. Kalibreringsstangen er 10 μm. (C) Effekten av kjemisk NMDA-LTD på mEPSCer i CA1 nevroner fra P120\u2012180 mus. Øvre panel er eksempel spor av mEPSCer registrert ved baseline og etter NMDA-LTD puls. Nedre venstre panel: NMDA-LTD resulterte i lavere mEPSC-frekvens. Nedre høyre panel: mEPSC amplitude endring etter NMDA-LTD ikke er oppdaget. N = 17 celler ved baseline og n = 15 celler for NMDA-LTD, 6 mus. P = 0,004, t-test. Dette tallet er endret fra Djurisic et al.15. (D)Eksempel på biocytinfylt CA1 pyramidecelle. (E)Eksempel på fEPSP signal fra CA1 stratum radiatum etter Schaffer sikkerhet stimulering. Det grå sporet oppnås under baseline opptak, og det svarte sporet observeres 20 min etter tetanisk stimulering. Hver sporing er i gjennomsnitt 30 påfølgende spor. (F)Kumulativt gjennomsnitt av langsiktig potensering av CA3-CA1 synapser etter 4 tog på 100 Hz induksjon; n = 23 skiver fra 8 WT mus ved ca. P90. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) | ||||
| Ingredienser | Mw | Endelig konk. | g / 2 liter (10X) | g/liter (1X) |
| Nacl | 58.44 | 125 | 146.1 | - |
| NaHCO3 Gjestgiveri | 84.01 | 26 | 43.68 | - |
| KCl (andre | 74.55 | 2.3 | 3.43 | - |
| 2007: 100 000 | 136.1 | 1.26 | 3.44 | - |
| Mg2SO4*7H2O Leilighet | 203.3 | 1.3 | - | 1,3 ml 1M lager |
| CaCl2*2H2O Leilighet | 147.02 | 2.5 | - | 2,5 ml 1M lager |
| Glukose*H2O | 180.2 | 25 | - | 4.5 g |
| a) Legg Mg2SO4 * 7H2O og CaCl2 * 2H2O fra 1M aksjer | ||||
| b) aCSF 10X holde @RT | ||||
| c) aCSF 1X ved 4 °C for 24 timer | ||||
| NMDG-aCSF | ||||
| Ingredienser | Mw | Endelig konk. | g /2 liter (3X) | g/300 ml (1X) |
| NMDG (andre) | 195.22 | 135 | 158.13 | - |
| pH=7,4 med HCl | ||||
| KCl (andre | 74.55 | 1 | 0.4473 | - |
| 2007: 100 000 | 136.1 | 1.2 | 0.9799 | - |
| MgCl2*6H2O | 203.3 | 1.5 | 1.8297 | - |
| CaCl2*2H2O Leilighet | 147.02 | 0.5 | 0.4411 | - |
| Kolin bikarbonat | 80% | 20 | - | 1238 μl |
| Glukose*H2O | 180.2 | 10 | - | 0.54 |
| a) Filtrer og oppbevar 3X lagerløsning ved 4 °C | ||||
Tabell 1: Medieformuleringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som er beskrevet her viser at hippocampal skiver hentet fra voksne og aldrende mus kan forbli sunn og levedyktig i mange timer etter kutting. Skivene som er utarbeidet ved hjelp av denne protokollen, passer for patch-clamp-opptak, samt langvarige feltopptak i CA1-regionene.
Det er to kritiske trinn i denne protokollen. Første trinn er transcardial perfusjon trinn med en iskald løsning. Rask clearance av blod signaliseres ved rask endring av leverfarge. Ekstrahert hjerne skal være off-white i fargen. Hvis hjernen forblir rosa, betyr det at systemisk blod ikke ble erstattet med den kalde NMDG-aCSF, og fallet i kroppstemperaturen ble ikke oppnådd. Dette kan skyldes feil plassering av nålen inn i hjertet, eller fordi hjertet ble punktert gjennom. Hjerner fra dårlig perfused mus bør ikke brukes til kutting. Det andre kritiske trinnet er bruken av NMDG som natriumionerstatning. En velkjent tidligere variant av protokollen som med hell bruker sukrose som erstatning for Na+ i rottehjerner10,,produserer 31 ikke tilstrekkelig sunne hippocampalskiver hos mus (også se Ting et al.13). Bruken av NMDG som natriumionerstatning er avgjørende for museflodcampalskiver.
Mens sunne hippocampalskiver er pålitelig oppnådd ved hjelp av den beskrevne protokollen, er hippocampalpreparatet fra voksne og aldrende dyr fortsatt utfordrende. Dens vanskeligheter endres også med forskjellige muselinjer og genetisk bakgrunn. Potensielle endringer å vurdere er tilsetningsstoffer til NMDG-aCSF og recovery-aCSF løsninger som taurin, D-serine, eller N-acetylcystein (NAC), som kan forsterke nevronal og synaptisk funksjon13,29, øke oksygenering29. Substitusjon av cl-ioner bør også vurderes under perfusjon og kutting32. Bruk av et grensesnittgjenvinningskammer er en annen måte å opprettholde økt oksygenering på, noe som er spesielt relevant for langsiktige plastisitetsfeltopptak. Det beskrevne gjenopprettingskammeret (figur 1C) kan modifiseres for dette formålet (f.eks. en kulturinnsatsrett som er fuktet nedenfra av aSCF, kan erstatte det nedsenkede nettet). Erstatte stålblader med safir eller keramiske blader kan redusere vevskompresjon forverret av tung myelinasjon av hvit materie rundt hippocampus; dette i sin tur kan ytterligere forbedre kvaliteten på nevroner nær skiveoverflaten. Bruk av mikrotomer som er utformet for å minimere den vertikale vibrasjonen (f.eks. null-z i Leica VT1200S), er et annet modifiserbart trinn.
Andre hjerneregioner kan skjæres ved hjelp av protokollen som er beskrevet her, med passende modifikasjoner i skjærevinkler. I tillegg kan strengheten av skivepreparatet justeres, da forskjellige hjerneregioner er følsomme for hypoksi i forskjellige grader.. En protokoll som bruker en NMDG-aSCF er rapportert for voksne mus neocortex og striatum skivepreparater 13,,20; den bruker en NMDG-aCSF som inneholder 30 mM NaHCO3 (det vil si at det ikke er Na+-free)20, og i noen tilfeller transcardial perfusjon er med NMDG-aCSF ved romtemperatur13. Men for en region som er så utsatt for hypoksi som hippocampus, kan bruk av Na+-free NMDG-aCSF og iskald transcardial perfusjon utgjøre en kritisk forskjell.
Denne protokollen gjelder for det store utvalget av transgene muselinjer som modellerer nevrodegenerative sykdommer. Videre kan protokollen også endres ytterligere til hjerneskiver fra andre pattedyrmodellarter. Sammen kan denne protokollen tjene som grunnlag for et standardisert preparat for akutte hippocampalskiver fra aldrende dyr, og dermed lette sammenligninger på tvers av studier i sammenheng med sykdomsmekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Jeg takker Dr. Carla J. Shatz for råd og støtte, og Dr. Barbara K. Brott og Michelle K. Drews for kritisk å lese manuskriptet. Arbeidet støttes av NIH EY02858 og Mathers Charitable Foundation gir til CJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
- Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain. Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus. Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).
- Free Mandel, P. H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals. Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).
- Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).
- Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats. Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).
- Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex. Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).
- Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).
- Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G. Patch-Clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. 1183, Springer. Ch. 14 221-242 (2014).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 1-10 (2015).
- Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids. Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).
- Djurisic, M., et al. PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).
- Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
- Blot, A., Barbour, B. Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau. Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).
- Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli. Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).
- Frick, A., Magee, J., Johnston, D. LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites. Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).
- Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell. PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).
- Brooks, J. M., O'Donnell, P. Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).
- Goel, A., Lee, H. K. Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex. Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).
- Izumi, Y., Zorumski, C. F. Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices. Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).
- Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
- Fiala, J. C., Spacek, J. Hippocampus Rat. , Available from: https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat (1999).
- Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons. Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
