Summary
Este é um protocolo para preparação aguda de fatias de hipocampi de camundongos adultos e envelhecidos que se aproveita da perfusão transcárrica e corte de fatias com NMDG-aCSF gelado para reduzir danos hipóxicos ao tecido. As fatias resultantes permanecem saudáveis durante muitas horas, e são adequadas para grampos de remendo de longo prazo e gravações de campo.
Abstract
As fatias agudas de hipocampal permitiram que gerações de neurocientistas explorassem propriedades sinápticas, neuronais e circuitos em detalhes e com alta fidelidade. A exploração de mecanismos LTP e LTD, a computação dendrítica de neurônio único e as mudanças dependentes da experiência nos circuitos não teriam sido possíveis sem esta preparação clássica. No entanto, com algumas exceções, a pesquisa mais básica usando fatias de hipocampal agudas tem sido realizada usando fatias de roedores de idades relativamente jovens, ~P20-P40, embora mecanismos de excitabilidade sináptica e intrínseca tenham uma longa cauda de desenvolvimento que ultrapassa p60. O principal apelo do uso de jovens fatias hipocampais é a preservação da saúde neuronal auxiliada pela maior tolerância aos danos hipóxicos. No entanto, é preciso entender a função neuronal em estágios mais maduros de desenvolvimento, ainda mais acentuados pelo desenvolvimento de vários modelos animais de doenças neurodegenerativas que requerem uma preparação cerebral envelhecida. Aqui descrevemos uma modificação em uma preparação aguda de fatia hipocampal que fornece fatias saudáveis de hipocampi de camundongos adultos e envelhecidos. Os passos críticos do protocolo são a perfusão transcárdica e o corte com NMDG-aSCF sem sódio frio. Juntos, essas etapas atenuam a queda induzida pela hipóxia no ATP após a decapitação, bem como o edema citotóxico causado por fluxos passivos de sódio. Demonstramos como cortar fatias transversais de hipocampo mais córtex usando um microtoma vibrante. As fatias hipocampais agudas obtidas desta forma são confiáveis e saudáveis ao longo de muitas horas de gravação, e são apropriadas tanto para gravações de campo quanto para gravações direcionadas de grampos de remendo, incluindo o alvo de neurônios fluorescentes rotulados.
Introduction
O advento das preparações de fatias cerebrais agudas de mamíferos facilitou experimentos no nível celular e sináptico que antes eram possíveis apenas em preparações de invertebrados como a Aplysia1. O desenvolvimento de fatias hipocampais agudas foi de particular significado, pois é uma estrutura responsável pela formação da memória e do contexto, e possui um circuito tri-sináptico especializado que é amenable à fácil manipulação fisiológica. No entanto, a grande maioria das fatias cerebrais agudas ainda são preparadas a partir de camundongos e ratos relativamente jovens, pois é mais fácil preservar neurônios e circuitos saudáveis, e as fatias permanecem viáveis por períodos mais longos de tempo2,3,4. Aqui, introduzimos modificações nos protocolos de corte padrão que resultam em maior viabilidade de fatias hipocampais agudas de camundongos adultos e envelhecidos.
O principal impedimento para a viabilidade ex vivo a longo prazo do parenchyma cerebral mamífero é o dano hipóxico inicial que ocorre rapidamente quando o fluxo sanguíneo para o cérebro pára após a decapitação. A perda de oxigênio resulta no rápido consumo metabólico dos principais recursos energéticos do cérebro, sendo a perda de fosfo-creatina (P-creatina) a mais rápida, seguida por glicose, adenosina triptofato (ATP) e glicógeno4. A preservação da ATP é de particular importância para a saúde a longo prazo das fatias cerebrais, pois a ATP é necessária para manter o potencial de membrana através do ATPase Na-K e, consequentemente, da atividade neural5,,6. O nível ATP no cérebro de roedor adulto é de ~2,5 mM, e cai vertiginosamente dentro de 20 s de decapitação para alcançar um estado basal estável (~0,5 mM) em torno de 1 min pós-decapitação4,,7,,8. Em animais jovens, leva mais tempo para observar a mesma queda em ATP (~2 min); com anestesia fenobarbital é ainda mais retardada para 4 min4. Essas considerações mostram que prevenir a perda de ATP e outros recursos energéticos é uma estratégia necessária para evitar danos hipóxicos ao cérebro e, por sua vez, manter a saúde das fatias cerebrais por períodos mais longos de tempo, especialmente em animais adultos.
Baixas temperaturas atrasam o metabolismo. Consequentemente, foi demonstrado que a hipotermia modesta protege as reservas de energia cerebral: em animais jovens, reduzindo a temperatura corporal em seis graus, de 37 °C para 31 °C, preserva os níveis de ATP para cerca de 80% dos níveis normais acima de 4h de hipóxia controlada9. Os níveis de p-creatina são igualmente preservados, bem como o potencial global de fosforilação9. Isso sugere que a redução da temperatura corporal antes da decapitação pode ser neuroprotetora, uma vez que os níveis quase normais de ATP poderiam ser mantidos através dos períodos de corte de fatias e recuperação de fatias.
Na medida em que uma queda de ATP não pode ser completamente impedida após a decapitação, espera-se uma função parcialmente prejudicada do ATPase Na-K, seguida de despolarização via influxo passivo de sódio. Como o fluxo passivo de sódio é seguido pela entrada de água nas células, causa edema citotóxico e, eventualmente, pyknose. Em ratos adultos, substituir íons Na+ por sacarose em soluções de corte de fatias tem sido uma estratégia bem sucedida para aliviar a carga do edema citotóxico10,11. Mais recentemente, as cáras orgânicas metiladas que diminuem a permeabilidade do canal de sódio12 têm mostrado oferecer proteção mais eficaz do que a sacarose, especialmente em fatias de camundongos adultos, com n-metil-D-glucamine (NMDG) sendo mais amplamente aplicável em diferentes idades e regiões cerebrais13,,14,,15,,16.
Numerosos protocolos de corte cerebral envolvem o uso de temperaturas frias apenas durante a etapa de corte de fatias, às vezes em combinação com a estratégia de substituição de íons Na+ 16,17. Em animais jovens, esses protocolos parecem oferecer neuroproteção suficiente, uma vez que os cérebros podem ser extraídos rapidamente após a decapitação porque o crânio ainda é fino e fácil de remover3. No entanto, essa estratégia não produz fatias saudáveis de animais adultos. Com o tempo, vários laboratórios que estudam roedores adultos introduziram perfusão transcárrica com uma solução gelada para diminuir a temperatura corporal do animal e, portanto, danos hipóxicos ao cérebro, antes da decapitação. Este procedimento foi aplicado com sucesso para produzir fatias cerebelares18, fatias de cérebro médio19, fatias neocorticais11,20, córtex perirhinal21, hipocampo de rato10,22,23, bulbo olfativo24, estriado ventral25, córtex visual26.
Apesar das vantagens oferecidas pela perfusão transcárdia e substituiçãode íons na preparação de fatias de ratos e em algumas regiões cerebrais em camundongos, o hipocampo de camundongos continua sendo uma das áreas mais desafiadoras para proteger da hipóxia13,20. Até o momento, uma das abordagens mais comuns para cortar hipocampo de camundongos envelhecidos e modelos de camundongos de neurodegeneração envolve o corte rápido clássico do hipocampo isolado27. No protocolo aqui descrito, minimizamos a perda de ATP no cérebro adulto introduzindo hipotermia antes da decapitação, perfumando transcardialmente o animal com Na+- fluido cerebrospinal artificial à base de NMDG (NMDG-aCSF). As fatias são então cortadas em Na+-free NMDG-aCSF. Com este protocolo aprimorado, obtemos fatias hipocampais agudas de camundongos adultos e envelhecidos que são saudáveis por até 10 h após o corte e são apropriados para gravações de campo de longo prazo e estudos de grampo de remendo.
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Protocol
O protocolo é realizado de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais laboratoriais dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Stanford. Os métodos também estão de acordo com as Políticas da Sociedade para a Neurociência sobre o Uso de Animais e Humanos na Pesquisa em Neurociência.
NOTA: Todos os camundongos foram mantidos em um ambiente livre de patógenos. Ratos do tipo selvagem em c57Bl/ 6 x SV/ 129J de fundo genético foram usados aqui, a menos que observados de outra forma.
1. Configuração
- Prepare 1 L de 1x aCSF (em mM): 125 NaCl, 26 NaHCO3, 2.3 KCl, 1.26 KH2PO4, 1.3 Mg2SO4·7H2O, 2.5 CaCl2, 25 glicose(Tabela 1). Use esta solução para a câmara de recuperação e gravações subsequentes.
NOTA: Armazene aCSF como uma solução de estoque de 10x que contenha NaCl, NaHCO3, KCl e KH2PO4. Armazene Mg2SO4·7H2O e CaCl2 como soluções de estoque de 1 M. Prepare a solução de trabalho no dia do experimento a partir das soluções de estoque acima, e adicione glicose antes de ajustar o volume final com 18 MΩ de água.
NOTA: Dependendo da região cerebral ou da cepa do camundongo, a ACSF refrigerado também pode ser usado para perfusão transcárdia com sucesso11,,15,26. - Prepare 300 mL de NMDG-aCSF (em mM): 135 NMDG, 1 KCl, 1.2 KH2PO4, 1,5 MgCl2, 0,5 CaCl2,20 bicarbonato de colina, 10 glicose(Tabela 1). Este volume de NMDG-aCSF é suficiente tanto para perfusão transcárvia quanto para etapas de corte.
NOTA: Armazene o NMDG-aCSF como uma solução de estoque de 3x a 4 °C. Preparar solução de trabalho no dia do experimento; adicionar bicarbonato de colina e glicose antes de ajustar o volume final com 18 MΩ de água. Bolha a solução com 95%O2/5%CO2 para tamponá-la, e saturar com oxigênio.
NOTA: O estoque de NMDG começa como altamente alcalino, e requer ácido clorídrico concentrado (HCl) para ajustar o pH para ~7,4. A adição de ácido clorídrico deve ser lenta uma vez abaixo do pH 8, pois é fácil acidificar a solução para ~pH 3 com excesso de HCl. Este ajuste deve ser feito antes de adicionar cations divalent. Esta receita NMDG-aCSF é livre de sódio. As receitas NMDG publicadas anteriormente usam 30 mM NaHCO3 para tamponamento, o que resulta em 30 mM de sódio presente no NMDG-aCSF13,20. - Ajuste a bandeja de corte de microtóme vibratório e o disco de montagem para -20 °C.
- Prepare a câmara de recuperação.
- Encha a câmara de recuperação um pouco acima da malha de corte, mantenha-a no banco à temperatura ambiente e bolha.
NOTA: A câmara de recuperação de fatias usada aqui é muito semelhante às câmaras clássicas descritas anteriormente por Edwards e Konnerth3. aCSF é mantido em um copo de vidro (400 mL) que contém uma moldura acrílica redonda com malha de nylon preto colada na parte inferior. O quadro acrílico está suspenso no meio do béquer através de um gancho de acrílico apoiado sobre a borda do béquer. O bolha de vidro é inserido até o fundo. O projeto permite a oxigenação de ambos os lados das fatias. Borbulhar também fornece mistura constante de aCSF na câmara de recuperação. A malha preta fornece um alto contraste contra as fatias off-white, que são então mais fáceis de ver.
- Encha a câmara de recuperação um pouco acima da malha de corte, mantenha-a no banco à temperatura ambiente e bolha.
- Prepare a solução de perfusão transcárvia e corte.
- Esfrie os 300 mL inteiros de NMDG-aCSF em um congelador, até que os cristais de gelo comecem a se formar na superfície e nas paredes da garrafa. NÃO congele demais!
- Coloque a garrafa com NMDG-aCSF refrigerado no gelo e na bolha. A solução deve ser entre 0\u20122 °C.
NOTA: Slushy NMDG- aCSF implica ter a maior parte da solução como líquido, enquanto uma pequena fração de gelo slushy presente manterá a solução perto de 0 °C durante toda a perfusão e corte. Deve-se tomar cuidado para afastar cristais de gelo do cérebro durante o corte.
- Prepare o disco de montagem de tecido.
- Tire o disco do congelador, limpe-o se necessário.
- Corte um bloco de 5% de ágar da placa de ágar previamente preparada, e cole-o no centro do disco usando uma fina camada de cola cianoacrilato. A peça de ágar deve ser do tamanho de um cérebro de rato. Coloque o disco com ágar colado no gelo e cubra com toalhas de papel até que esteja pronto para usar.
- Para 5% de placa de ágar, dissolva 5 g de ágar em 100 mL de água de 18 MΩ por microwaving, e despeje em uma placa de petri limpa. Mantenha a 4 °C.
- Tire a bandeja de corte do congelador, coloque-a no microtome, cerque-a com gelo e carregue a lâmina.
2. Perfusão transcárvia e extração cerebral
- Ratos de overdose através de uma injeção intraperitoneal de coquetel anestésico. Verifique a profundidade da anestesia verificando o reflexo da dor (beliscão do dedo do pé); um rato não deve exibir o reflexo uma vez que atinge anestesia profunda.
NOTA: Receita de coquetel de anestesia de roedores: Cetamina HCl (66 mg/mL), xylazine HCl (6,6 mg/mL), acepromazina maleate (0,1 mg/mL), 18 MΩ de água para o volume final. Dose: 0,4 mg/g peso corporal, 0,04 mg/g peso corporal, 6 x 10-4 mg/g peso corporal para cetamina, xilazina e acepromazina, respectivamente. - Configure a bomba peristáltica para perfusão transcárlica. Insira um lado da tubulação da bomba na garrafa com NMDG-aCSF gelado. Coloque o outro lado da tubulação com a agulha de 27 G que será inserida no ventrículo esquerdo.
- Coloque a velocidade da bomba em aproximadamente 3,5 mL/min. Nesta velocidade, o fluxo de saída do NMDG-aCSF é um fluxo rápido, não contínuo.
NOTA: A perfusão por gravidade é um bom substituto para a perfusão da bomba peristáltica, desde que a mesma taxa de fluxo aproximada possa ser alcançada. Uma perfusão a alta vazão resultará em ruptura de vasos sanguíneos no cérebro. Um sinal de uma perfusão excessivamente rápida e aumento da pressão nos vasos sanguíneos é uma solução saindo do nariz do animal. - Perfusão
- Coloque o mouse anestesiado corretamente em suas costas em uma fralda. Usando fita adesiva, fita para baixo suas pernas dianteiras e traseiras para que o peito e o abdômen sejam expostos.
- Corte um grande pedaço da pele no topo do peito, indo de baixo do esterno até a garganta; isso deve fornecer uma grande área de trabalho. Pegue o esterno com fórceps, levante suavemente e comece a cortar a caixa torácica em ambos os lados até que a cavidade torácica seja exposta.
- Corte o diafragma para expor a cavidade torácica. O retalho da caixa torácica deve ser deixado preso através de um fino pedaço de músculo. Deve ser possível colocá-lo em um lado sem tê-lo cair de volta sobre a cavidade torácica exposta. Verifique se o coração ainda está batendo. Certifique-se de que a maior parte do fígado é visível.
- Inserir a agulha de 27 G no ventrículo esquerdo; o ventrículo esquerdo do mouse parece mais leve em cores do que a direita. Localize o átrio direito de cor vermelha escura. Corte pelo átrio direito com uma tesoura pequena; o sangue deve começar a fluir para fora.
- Inicie a bomba que foi predefinida para a velocidade de fluxo correta. Se tudo foi feito corretamente, o fígado deve começar a mudar de cor de vermelho para marrom logo após o início da perfusão. Monitorar a cor hepática para determinar o comprimento da perfusão; o fígado deve ficar marrom pálido.
- Execute a bomba por mais alguns minutos. Se usar o termômetro retal, a temperatura corporal deve cair para 28\u201229 °C, e o nariz do animal deve estar frio ao toque.
- Extração cerebral.
NOTA: Para esta etapa, tenha as seguintes ferramentas de dissecção prontas: tesoura de decapitação, tesoura pequena com lâmina reta ou angular, bisturi e #10 lâmina, lâmina de borda única, fórceps #3, espátula com um lado dobrado a 90°, uma espátula, uma ferramenta "60°"(Figura 1A,B),e uma pequena escova macia.- Decapitar o rato com uma grande tesoura de decapitação. Usando um bisturi com #10 lâmina, abra a pele em cima do crânio. Com uma tesoura pequena em ângulo, corte o crânio na linha média. Em seguida, usando o #3 fórceps, retire as metades direita e esquerda do crânio, tomando cuidado para levar a dura com ele. O cérebro deve ser exposto agora.
NOTA: Se a dura se desprender do crânio, ela permanecerá sobre o cérebro e terá que ser removida separadamente. As bordas da dura restante podem apertar e cortar profundamente através do cérebro, potencialmente danificando a região do cérebro de interesse. - Remova o cérebro recolhendo-o com uma pequena espátula. Jogue o cérebro na solução NMDG-aCSF colocada em um pequeno béquer separado no gelo. Deixe lá por até um minuto.
NOTA: Além da hipotermia, a exposição ao soro fisiológico gelado firma o cérebro, o que é necessário até mesmo para cortar. Todo o procedimento, desde a decapitação até a extração cerebral, deve ser inferior a 30 anos.
- Decapitar o rato com uma grande tesoura de decapitação. Usando um bisturi com #10 lâmina, abra a pele em cima do crânio. Com uma tesoura pequena em ângulo, corte o crânio na linha média. Em seguida, usando o #3 fórceps, retire as metades direita e esquerda do crânio, tomando cuidado para levar a dura com ele. O cérebro deve ser exposto agora.
3. Fatiamento
- Tire o cérebro do NMDG-aCSF e coloque-o em um pedaço de papel filtro.
- Corte e remova uma cunha de 60° da extremidade rostral do cérebro do cérebro usando uma ferramenta "60°" centrada na linha média. As superfícies cortadas serão usadas para montagem para alcançar o ângulo adequado para fatias hipocampais transversais conforme discutido abaixo (Figura 1A,B).
NOTA: Duas lâminas de borda única mantidas juntas através de um suporte caseiro fazem uma ferramenta fácil de usar para fazer o corte de 60°(Figura 1A). - Separe hemisférios abaixo da linha média com o bisturi.
- Cole os hemisférios no disco de montagem da seguinte forma. Pegue o disco de montagem que esteve no gelo até agora. Se necessário, limpe-o novamente. Cole cada hemisfério na frente do bloco de ágar, corte o lado para baixo.
- Certifique-se de que o lado ventral de cada hemisfério está tocando o bloco de ágar. O bloco de ágar fornece suporte adicional durante o corte e é essencial para fatias uniformes. Os lados dorsais de cada hemisfério devem estar voltados para a lâmina. Quando colado no lado do corte, cada hemisfério é orientado em relação à lâmina de uma forma que resulta em fatias transversais de hipocampo dorsal in situ(Figura 1B).
- Submergir o disco com hemisférios em uma câmara de corte contendo NMDG-aCSF caricaturado a frio do gelo.
- Corte seções de 400 μm. O corte deve ser feito em menos de 10 minutos. Diferentes microtomes exigirão diferentes configurações para alcançar este tempo. Um total de 8\u201210 fatias da região do hipocampo dorsal serão obtidas.
4. Recuperação
- Transfira fatias para uma câmara de recuperação contendo aCSF carbogenado à temperatura ambiente usando pipetas de transferência descartáveis com pontas de corte(Figura 1C).
NOTA: É altamente recomendável fortificar a câmara de recuperação-aSCF com 5 mM Na-ascorbate e 3 mM Na-pyruate. Piruvato é um substrato de energia mostrado para impulsionar a produção de ATP em fatias28, enquanto Na-ascorbate é um quencher de radicais livres29. - Incubar à temperatura ambiente (22\u201224 °C) por aproximadamente 2 h antes de gravar (até 4h).
NOTA: Uma maior incubação à temperatura ambiente resulta em fatias mais saudáveis por períodos mais longos de tempo, em relação à incubação padrão a 37 °C por 30 minutos seguidos de incubação da temperatura ambiente. O reaquecimento a 37 °C pode introduzir edema citotóxico13.
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Representative Results
Aplicamos o protocolo acima para gerar fatias de hipocampo da CamKIIa-Cre+; Camundongos WT em um fundo genético misto C57Bl/ 6 x SV/ 129J, em P > 120. Um grande número de células piramidas no campo CA1 (Figura 2A) e subículo (Figura 2B) aparecem em baixo contraste quando observadas sob microscopia de contraste diferencial infravermelho (IR-DIC), uma marca registrada de células saudáveis em uma preparação de fatias. Com esta preparação, uma alta taxa de selos giga-ohm (>90%) é rotineiramente alcançado ao atingir as células mais saudáveis aproximadamente 20\u201250 mícrons abaixo da superfície. Para essa taxa de sucesso, é importante utilizar um alto objetivo de NA para IR-DIC, como um objetivo de imersão em água de 60x, a fim de alcançar a visualização adequada de células piramida nesta profundidade(Figura 2A,B).
Gravações de grampos de patches de neurônios únicos são facilmente alcançáveis usando esta preparação de fatia hipocampal mesmo em camundongos com mais de seis meses de idade. A Figura 2C mostra um experimento de exemplo usando gravações de correntes postsinásticas em miniatura (mEPSCs) de neurônios CA1. Indução de NMDA-LTD químico com aplicação de banho de 20 μM NMDA para 3 min reduz a frequência mEPSC em células CA1 quando avaliada 60 min tratamento pós-NMDA. Este achado sugere que o NMDA-LTD causa poda dependente da atividade de sinapses em CA1 em camundongos mais velhos (resultados adaptados de Djurisic et al.15). Não foi detectada alteração na amplitude do MEPSC. Durante as gravações do MEPSC, as células CA1 também foram preenchidas com biocittina. A Figura 2D revela uma árvore dendrítica intacta e habitus de células saudáveis de neurônios piramicidas CA1 cheios de biocitina. Uma distribuição robusta do corante fluorescente em toda a célula permite uma avaliação rotineira das propriedades da coluna dendrítica em diferentes condições experimentais.
Utilizando gravações de campo, a potencialização de longo prazo (LTP) de ~170% das sinapses CA3-CA1 em fatias de camundongos adultos foi prontamente observada, sugerindo a manutenção de cascatas de sinalização necessárias para LTP (Figura 2E,F). A conectividade de rede necessária para um robusto sinal de potencial exiptático de campo (fEPSP) também está preservada(Figura 2E). A capacidade de avaliar a plasticidade sináptica em fatias hipocampais de camundongos adultos ou envelhecidos é especialmente relevante para modelos de camundongos de doenças neurodegenerativas à medida que sua disfunção sináptica marcante se desenvolve mais tarde na vida.
Juntos, nossos resultados demonstram que uma preparação hipocampal aguda de camundongos adultos e envelhecidos permite a avaliação da função sináptica ao nível de células únicas e população de células rotineiramente, desde que a perfusão transcárrica e soluções baseadas em NMDG geladas sejam usadas para minimizar danos hipóxicos.
Figura 1: Método de corte e recuperação de fatias hipocampais transversais de camundongos adultos e envelhecidos. (A) Uma ferramenta "60°" usada para remover a cunha de 60° da extremidade rostral do cérebro, centrada na linha média. (B) Posicionamento dos hemisférios para corte de fatias transversais. Uma ilustração de um corte de 60° é mostrada nos painéis esquerdo e superior direito; o posicionamento dos dois hemisférios na superfície com cola de forma mostrada no painel inferior direito garante uma orientação perpendicular do hipocampo dorsal em relação à lâmina. Essa orientação resulta em fatias transversais de hipocampo. Estruturas amarelas são uma renderização 3D de hipocampi dentro do cérebro de roedor (cinza). Esta ilustração é adaptada do SynapseWeb30. Todas as vistas são do lado dorsal do cérebro. (C) Fatias hipocampais transversais cortadas de um rato de 4 meses de idade em uma câmara de recuperação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Medidas de fixação e plasticidade sináptica em fatias hipocampais de camundongos em P120\u2012180. (A) Um exemplo de micrografo IR-DIC da região do CA1. (B) Exemplo de micrografos IR-DIC de subiculum. Tanto no A quanto no B, as imagens são tiradas 3h após o corte com um objetivo de imersão em água de 60x. Barra de calibração é de 10 μm. (C) O efeito do NMDA-LTD químico em mEPSCs em neurônios CA1 de ratos P120\u2012180. Painel superior são traços de exemplo de mEPSCs registrados na linha de base e após o pulso NMDA-LTD. Painel inferior esquerdo: NMDA-LTD resultou em menor frequência mEPSC. Painel inferior direito: mudança de amplitude mEPSC após a não ser detectada no NMDA-LTD. N = 17 células na linha de base e n = 15 células para NMDA-LTD, 6 camundongos. P = 0,004, t-test. Este número foi modificado a partir de Djurisic et al.15. (D) Exemplo de célula piramida CA1 cheia de biocitina. (E) Exemplo de sinal fEPSP do radiador de estrato CA1 após estimulação colateral de Schaffer. O traço cinza é obtido durante a gravação da linha de base, e o traço preto é observado 20 minutos após a estimulação tetanica. Cada traço é uma média de 30 traços consecutivos. (F) Média acumulada de potencialização de longo prazo das sinapses CA3-CA1 após 4 trens de indução de 100 Hz; n = 23 fatias de 8 ratos WT em aproximadamente P90. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Fluido cefalorraquidiano artificial (aCSF) | ||||
| Ingredientes | Mw | Conc. final (mM) | g/2 Litros (10X) | g/Litro (1X) |
| Nacl | 58.44 | 125 | 146.1 | - |
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | 43.68 | - |
| Kcl | 74.55 | 2.3 | 3.43 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.26 | 3.44 | - |
| MG2SO4 *7H2O | 203.3 | 1.3 | - | 1,3 ml de estoque de 1M |
| CaCl2 *2H2O | 147.02 | 2.5 | - | 2,5 ml de estoque de 1M |
| Glicose*H2O | 180.2 | 25 | - | 4,5 g |
| a) Adicionar mg2SO4 *7H2O e CaCl2 *2H2O de ações de 1M | ||||
| b) aCSF 10X manter @RT | ||||
| c) aCSF 1X @4°C para 24h | ||||
| NMDG-aCSF | ||||
| Ingredientes | Mw | Conc. final (mM) | g/2 Litros (3X) | g/300 ml (1X) |
| NMDG | 195.22 | 135 | 158.13 | - |
| pH=7,4 com HCl | ||||
| Kcl | 74.55 | 1 | 0.4473 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.2 | 0.9799 | - |
| MgCl2 *6H2O | 203.3 | 1.5 | 1.8297 | - |
| CaCl2 *2H2O | 147.02 | 0.5 | 0.4411 | - |
| Bicarbonato de colina | 80% | 20 | - | 1238 μl |
| Glicose*H2O | 180.2 | 10 | - | 0.54 |
| a) Filtrar e armazenar a solução de estoque 3X a 4°C | ||||
Tabela 1: Formulações de mídia.
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Discussion
O protocolo descrito aqui demonstra que as fatias hipocampais obtidas de camundongos adultos e envelhecidos podem permanecer saudáveis e viáveis por muitas horas após o corte. As fatias preparadas usando este protocolo são apropriadas para gravações de grampos de remendo, bem como gravações de campo de longa duração nas regiões ca1.
Há dois passos críticos neste protocolo. O primeiro passo é o passo de perfusão transcárvia com uma solução gelada. A liberação rápida do sangue é sinalizada pela rápida mudança da cor do fígado. O cérebro extraído deve ser off-white na cor. Se o cérebro permanecer rosa, significa que o sangue sistêmico não foi substituído pelo NMDG-aCSF frio, e a queda na temperatura corporal não foi alcançada. Isso pode ser causado por colocação inadequada da agulha no coração, ou porque o coração foi perfurado. Cérebros de camundongos mal perfundidos não devem ser usados para cortar. O segundo passo crítico é o uso de NMDG como substituto de íons de sódio. Uma variação anterior bem conhecida do protocolo que usa com sucesso a sacarose como substituto de Na+ em cérebros de ratos10,31 não produz fatias hipocampais suficientemente saudáveis em camundongos (veja também Ting et al.13). O uso de NMDG como substituto de íons de sódio é fundamental para fatias hipocampais de camundongos.
Enquanto as fatias hipocampais saudáveis são obtidas de forma confiável usando o protocolo descrito, a preparação hipocampal de animais adultos e idosos permanece desafiadora. Sua dificuldade também muda com diferentes linhas de camundongos e origens genéticas. As modificações potenciais a considerar são aditivos para nMDG-aCSF e soluções de recuperação-aCSF como taurina, D-serina ou N-acetilcisteína (NAC), que poderiam aumentar a função neuronal e sináptica13,,29, aumentar a oxigenação29. A substituição de íons-cl também deve ser considerada durante a perfusão e cortede 32. O uso de uma câmara de recuperação de interface é outra maneira de manter o aumento da oxigenação, que é especialmente relevante para gravações de campo de plasticidade de longo prazo. A câmara de recuperação descrita (Figura 1C) é modificável para esse fim (por exemplo, um prato de inserção de cultura que é umedecido de baixo pela ASCF, poderia substituir a malha submersa). A substituição de lâminas de aço por lâminas de safira ou cerâmica pode diminuir a compressão tecidual exacerbada pela mielinação pesada da matéria branca em torno do hipocampo; isso, por sua vez, poderia melhorar ainda mais a qualidade dos neurônios perto da superfície da fatia. O uso de microtomes projetados para minimizar a vibração vertical (por exemplo, zero-z em Leica VT1200S), é outro passo modificável.
Outras regiões cerebrais poderiam ser cortadas usando o protocolo descrito aqui, com modificações apropriadas em ângulos de corte. Além disso, a stringency da preparação da fatia pode ser ajustada, pois diferentes regiões cerebrais são sensíveis à hipóxia em diferentes graus.. Um protocolo que usa um NMDG-aSCF foi relatado para preparações de neocórtex e fatia de estriatum adulto13,20; ele usa um NMDG-aCSF que contém 30 mM NaHCO3 (ou seja, não é Na+-livre)20, e em alguns casos a perfusão transcárdia é com NMDG-aCSF à temperatura ambiente13. No entanto, para uma região tão suscetível à hipóxia como o hipocampo, usar Na+-free NMDG-aCSF e perfusão transcárdia gelada pode fazer uma diferença crítica.
Este protocolo é aplicável à vasta gama de linhas de camundongos transgênicos que modelam doenças neurodegenerativas. Além disso, o protocolo poderia ser modificado para fatias cerebrais de outras espécies modelo de mamíferos, também. Juntos, esse protocolo poderia servir de base para uma preparação padronizada para fatias hipocampais agudas de animais envelhecidos e, assim, facilitar comparações entre estudos no contexto de mecanismos de doença.
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Disclosures
O autor não tem nada a revelar.
Acknowledgments
Carla J. Shatz por conselhos e apoio, e Dr. Barbara K. Brott e Michelle K. Drews por lerem criticamente o manuscrito. O trabalho é apoiado pelo NIH EY02858 e pela Mathers Charitable Foundation concede ao CJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
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