Summary
Это протокол для острого приготовления ломтик от взрослых и старения мыши гиппокампа, который использует транскардиальной перфузии и ломтик резки с холодной льдий NMDG-ACSF для уменьшения гипоксического повреждения ткани. Полученные ломтики остаются здоровыми в течение многих часов, и подходят для долгосрочного патч-зажима и полевых записей.
Abstract
Острые ломтики гиппокампа позволили поколениям нейробиологов исследовать синаптические, нейронные и схемные свойства в деталях и с высокой точностью. Изучение механизмов LTP и LTD, одно нейрон дендритных вычислений и опытозависимых изменений в схеме было бы невозможно без этой классической подготовки. Тем не менее, за некоторыми исключениями, большинство фундаментальных исследований с использованием острых ломтиков гиппокампа была выполнена с использованием ломтиков от грызунов относительно молодого возраста, P20-P40, хотя синаптические и внутренние механизмы возбудимости имеют длинный хвост развития, который достигает прошлого P60. Основной привлекательностью использования молодых ломтиков гиппокампа является сохранение нейронов здоровья, которому способствует более высокая толерантность к гипоксическим повреждениям. Тем не менее, необходимо понимать функции нейронов на более зрелых стадиях развития, что еще больше усугубляется развитием различных животных моделей нейродегенеративных заболеваний, которые требуют старения мозга подготовки. Здесь мы описываем модификацию острого препарата гиппокампа ломтик, который надежно обеспечивает здоровые ломтики от взрослых и старения мыши гиппокампа. Критическими шагами протокола являются транскардиальная перфузия и резка с ледяной натрия без NMDG-ASCF. Вместе эти шаги смягчают гипоксию индуцированной капли в АТФ при обезглавливании, а также цитотоксический отек, вызванный пассивными потоками натрия. Мы демонстрируем, как сократить поперечные ломтики гиппокампа плюс кора с помощью вибрирующих микротомов. Острые гиппокампа ломтики, полученные таким образом, надежно здоровы в течение многих часов записи, и подходят как для полевых записей и целевых патч-зажим записей, в том числе ориентации флуоресцентно помечены нейронов.
Introduction
Появление млекопитающих острых препаратов кусок мозга способствовали эксперименты на клеточном и синаптическом уровне, которые ранее были возможны только в беспозвоночных препаратов, как Аплизия1. Особое значение имеет развитие острых ломтиков гиппокампа, так как это структура, отвечающая за рабочую память и контекстообразование, и имеет специализированную трехсинаптическую схему, которая поддается легкой физиологической манипуляции. Тем не менее, подавляющее большинство острых ломтиков мозга по-прежнему готовятся из относительно молодых мышей и крыс, так как легче сохранить здоровые нейроны и схемы, и ломтики остаются жизнеспособными в течение более длительных периодоввремени 2,3,4. Здесь мы вводим изменения в стандартные протоколы нарезки, которые приводят к повышению жизнеспособности острых ломтиков гиппокампа от взрослых и стареющих мышей.
Основным препятствием для долгосрочной ex vivo жизнеспособности млекопитающих мозга parenchyma является первоначальный гипоксический ущерб, который происходит быстро, как только поток крови к мозгу останавливается после обезглавливания. Потеря кислорода приводит к быстрому метаболическому потреблению основных энергетических ресурсов в головном мозге с потерей фосфо-креатина (P-креатина) является наиболее быстрым, а затем глюкозы, аденозинтрифосфата (АТФ), и гликоген4. Сохранение АТФ имеет особое значение для долгосрочного здоровья ломтиков мозга, так как АТФ необходим для поддержания мембранного потенциала через Na-K ATPase, и, следовательно, нейронной активности5,6. Уровень АТФ в мозге взрослого грызуна составляет 2,5 мМ, и он резко падает в пределах 20 с обезглавливания, чтобы достичь базального устойчивого состояния (0,5 мМ) на уровне около 1 мин после обезглавливания4,7,8. У молодых животных, это занимает больше времени, чтобы наблюдать то же падение в АТФ (2 мин); с фенобарбитальной анестезией он далее замедлился до 4 мин4. Эти соображения показывают, что предотвращение потери АТФ и других энергетических ресурсов является необходимой стратегией для предотвращения гипоксического повреждения мозга и, в свою очередь, для поддержания здоровья ломтиков мозга в течение более длительных периодов времени, особенно у взрослых животных.
Низкие температуры замедляют обмен веществ. Следовательно, было продемонстрировано, что скромное переохлаждение защищает запасы энергии мозга: у молодых животных, снижая температуру тела на шесть градусов, с 37 градусов до 31 градусов по Цельсию, сохраняет уровни АТФ примерно до 80% от нормального уровня более 4 ч контролируемой гипоксии9. Уровни P-креатина также сохранены, также, как общий потенциал фосфорилирования9. Это говорит о том, что снижение температуры тела до обезглавливания может быть нейропротекторным, так как почти нормальные уровни АТФ могут поддерживаться через ломтик резки и ломтик периодов восстановления.
В той степени, что падение АТФ не может быть полностью предотвращено при обезглавливании, ожидается частично нарушенная функция Na-K ATPase, за которой последует деполяризация через пассивный приток натрия. Как пассивный приток натрия сопровождается водой вступления в клетки, он вызывает цитотоксический отек и в конечном итоге пикноз. У взрослых крыс, замена ионов Na' с сахарозой в срез-резки решений была успешная стратегия, чтобы облегчить бремя цитотоксического отека10,11. Совсем недавно, метилированные органические катиции, которые уменьшают проницаемость канала натрия12 показали, чтобы предложить более эффективную защиту, чем сахароза, особенно в ломтики от взрослых мышей, с N-метил-D-глюкамин (NMDG) наиболее широко применимы в разных возрастов и мозговых регионах13,14,15,16.
Многочисленные протоколы нарезки мозга включают использование холодных температур только во время срезающего шага, иногда в сочетании со стратегией замены иона Naй 16,17. У молодых животных, эти протоколы, как представляется, предлагают достаточно нейрозащиты, так как мозг может быть извлечен быстро после обезглавливания, потому что череп все еще тонкий и легко удалить3. Тем не менее, эта стратегия не производит здоровые ломтики от взрослых животных. Со временем в ряде лабораторий, изучающих взрослых грызунов, введена транскардиальная перфузия с ледяным раствором для снижения температуры тела животного и, следовательно, гипоксического повреждения мозга до обезглавливания. Эта процедура была успешно применена для производства мозжечковых ломтиков18,ломтики среднего мозга19, неокортиковые ломтики11,20, периринальной коры21, крыса гиппокампа10,22,23,обонятельная луковица24, вентральная стриятная тум25, визуальная кора26.
Несмотря на преимущества, предлагаемые транскардиальной перфузии и Naион замены в подготовке ломтиков от крысы и в некоторых областях мозга у мышей, мышь гиппокампа остается одним из самых сложных областей для защиты от гипоксии13,20. На сегодняшний день, один из наиболее распространенных подходов к нарезке гиппокампа от старения мышей и мыши модели нейродегенерации включает в себя классические быстро нарезки изолированных гиппокампа27. В протоколе, описанном здесь, мы минимизируем потерю АТФ во взрослом мозгу, вводя переохлаждение до обезглавливания путем транскардиальной перфузии животного с ледянойNa- свободной NMDG основе искусственной спинномозговой жидкости (NMDG-aCSF). Ломтики затем вырезать в ледяной Na--бесплатноNMDG-aCSF. С помощью этого расширенного протокола мы получаем острые ломтики гиппокампа от взрослых и стареющих мышей, которые здоровы до 10 ч после нарезки и подходят для долгосрочных полевых записей и патч-зажим исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол проводится в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения и одобрен Комитетом по уходу и использованию животных Стэнфордского университета. Методы также в соответствии с политикой Общества неврологии по использованию животных и людей в неврологии исследований.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все мыши были сохранены в патогенной среде. Здесь использовались мыши дикого типа на смешанном генетическом фоне C57Bl/ 6 x SV/ 129J, если не указано иное.
1. Настройка
- Подготовка 1 L из 1x aCSF (в мММ): 125 NaCl, 26 NaHCO3, 2,3 KCl, 1,26 KH2PO4, 1,3 Mg2SO47H2O, 2.5 CaCl2, 25 глюкозы (Таблица 1). Используйте это решение для камеры восстановления и последующих записей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните aCSF как 10x стоковое решение, которое содержит NaCl, NaHCO3,KCl и KH2PO4. Храните Mg2SO4No7H2O и CaCl2 в качестве 1 M фондовых решений. Подготовьте рабочий раствор в день эксперимента из вышеуказанных фондовых растворов и добавьте глюкозу перед регулировкой конечного объема с 18 MΩ водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от области мозга или мыши деформации, охлажденный aCSF также может быть использован для транскардиальной перфузии с успехом11,15,26. - Подготовка 300 м л NMDG-aCSF (в мММ): 135 NMDG, 1 KCl, 1.2 KH2PO4, 1.5 MgCl2, 0.5 CaCl2, 20 хололин бикарбонат, 10 глюкозы (Таблица 1). Такого объема NMDG-aCSF достаточно как для транскардиальной перфузии, так и для резки шагов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните NMDG-aCSF в качестве 3x раствора запаса при 4 градусах Цельсия. Подготовка рабочего решения в день эксперимента; добавить холин бикарбонат и глюкозы до корректировки окончательного объема с 18 MΩ воды. Пузырь раствор с 95%O2/5%CO2, чтобы буфер его, и насытить кислородом.
ПРИМЕЧАНИЕ: NMDG запас начинается как высоко щелочной, и требует концентрированной соляной кислоты (HCl) для регулировки рН до 7,4 евро. Добавление соляной кислоты должно быть медленным, как только ниже рН 8, так как это легко подкислить раствор для PH 3 с избытком HCl. Эта корректировка должна быть сделана до добавления divalent катинов. Этот рецепт NMDG-aCSF не содержит натрия. Ранее опубликованные рецепты NMDG используют 30 mM NaHCO3 для буферизации, что приводит к 30 мМ натрия присутствует в NMDG-aCSF13,20. - Установите вибрирующий микротом резки лоток и монтаж диска до -20 градусов по Цельсию.
- Подготовьте камеру восстановления.
- Заполните камеру восстановления, чтобы чуть выше среза-держа сетки, держать его на скамейке при комнатной температуре, и пузырь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Камера восстановления ломтика, используемая здесь, очень похожа на классические камеры, описанные ранее Эдвардсом и Коннертом3. aCSF хранится в стеклянном стакане (400 мЛ), который держит круглую акриловую раму с черной нейлоновой сеткой, приклеенной ко дну. Акриловая рама подвешена в середине стакана через акриловый крюк, лежащий над краем стакана. Стеклянный пузырька вставляется на дно. Конструкция позволяет оксигенации обеих сторон ломтиков. Bubbling также обеспечивает постоянное смешивание aCSF в камере восстановления. Черная сетка обеспечивает высокий контраст с белыми ломтиками, которые затем легче увидеть.
- Заполните камеру восстановления, чтобы чуть выше среза-держа сетки, держать его на скамейке при комнатной температуре, и пузырь.
- Подготовьте транскардиальный перфузионный и режущий раствор.
- Охладите все 300 мЛ NMDG-aCSF в морозильной камере, пока кристаллы льда не начнут образовываться на поверхности и стенках бутылки. НЕ чрезмерной заморозки!
- Поместите бутылку с охлажденным NMDG-aCSF на лед и пузырь. Решение должно быть между 0'u20122 C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Slushy NMDG-aCSF подразумевает, что большая часть раствора в качестве жидкости, в то время как небольшая часть слякотной лед настоящее будет держать раствор вблизи 0 градусов по Цельсию во время перфузии и резки. Следует проявлять осторожность, чтобы держаться подальше кристаллы льда от мозга во время резки.
- Подготовьте тканевой диск.
- Возьмите диск из морозильной камеры, протрите его сухим, если это необходимо.
- Вырежьте блок 5% агара из ранее подготовленной агар-пластины и приклеите его в центре диска с помощью тонкого слоя цианоакрилатного клея. Кусок агара должен быть размером с мозг мыши. Поместите диск с клееным агаром на лед и накройте бумажными полотенцами, пока он не будет готов к использованию.
- Для 5% агар пластины, растворить 5 г агара в 100 мл 18 MΩ воды с помощью микроволновой воды, и вылить в чистую чашку Петри. Держите на уровне 4 градусов по Цельсию.
- Возьмите режущий лоток из морозильной камеры, поместите его в микротом, окружите его льдом и загрузите лезвие.
2. Транскардиальная перфузия и извлечения мозга
- Передозировка мышей через интраперитонеальную инъекцию обезболивающего коктейля. Проверьте глубину анестезии, проверяя болевой рефлекс (щепотка ног); мышь не должна проявлять рефлекс, как только она достигает глубокой анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепт коктейля по анестезии грызунов: Кетамин HCl (66 мг/мЛ), ксилазин HCl (6,6 мг/мл), ацепромазин малеат (0,1 мг/мл), 18 MΩ воды до конечного объема. Доза: 0,4 мг/г массы тела, 0,04 мг/г массы тела, 6 х 10-4 мг/г массы тела для кетамина, ксилазина и ацепромазина, соответственно. - Настройка перистальтического насоса для транскардиальной перфузии. Вставьте одну сторону насоса трубки в бутылку со льдом NMDG-aCSF. Fit другой стороне трубки с 27 G иглы, которые будут вставлены в левый желудочек.
- Установите скорость насоса примерно на 3,5 м/мин. При такой скорости отток NMDG-aCSF является быстрым капельным, а не непрерывным потоком.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузия гравитацией является хорошей заменой перистальтического перфузии насоса, до тех пор, как же приблизительный поток скорость может быть достигнуто. Перфузия при высокой скорости потока приведет к разрыву кровеносных сосудов в головном мозге. Явным признаком чрезмерно быстрого перфузии и повышенного давления в кровеносных сосудах является раствор, выходящих из носа животного. - Перфузии
- Поместите правильно анестезируемую мышь на спину на подгузник. Используя бумажную ленту, лентой вниз его передние и задние ноги, так что грудь и живот подвергаются.
- Вырежьте большой участок кожи на груди, идя от ниже грудины к горлу; это должно обеспечить большую рабочую зону. Захватите грудину с щипцами, поднимите осторожно, и начать резки через грудную клетку с обеих сторон, пока грудная полость подвергается.
- Прорежьте диафрагму для того, чтобы разоблачить грудную полость. Заслонка грудной клетки должна быть оставлена прикрепленным через тонкий кусок мышцы. Это должно быть возможно, чтобы установить его на стороне, не имея его падать обратно на открытые грудной полости. Убедитесь, что сердце все еще бьется. Убедитесь, что большая часть печени видна.
- Вставьте 27 G иглы в левый желудочек; левый желудочек мыши выглядит светлее по цвету, чем справа. Найдите темное правое предсердие красного цвета. Прорежьте правый предсердий маленькими ножницами; кровь должна начать вытекать.
- Запустите насос, который был задан к правильной скорости потока. Если все было сделано правильно, печень должна начать менять цвет с красного на коричневый вскоре после начала перфузии. Мониторинг цвета печени, чтобы определить длину перфузии; печень должна стать бледно-коричневой.
- Выполнить насос в течение нескольких минут. При использовании ректального термометра температура тела должна опуститься до 28х20229 градусов по Цельсию, а нос животного должен быть холодным на ощупь.
- Извлечение мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага, есть следующие инструменты вскрытия готовы: ножницы обезглавливания, маленькие ножницы с прямым или угловым лезвием, скальпель и #10 лезвие, однослойное лезвие, #3 щипцы, шпатель с одной стороны согнуты до 90 ", шпатель, "60" инструмент (Рисунок 1A,B), и небольшая мягкая кисть.- Обезглавливать мышь большими ножницами обезглавливания. Используя скальпель с #10 лезвием, разрезать кожу на верхней части черепа. С небольшими угловыми ножницами, вырезать череп на средней линии. Далее, используя #3 щипцы, подглядывать правой и левой половины черепа, стараясь взять dura прочь с ним. Мозг должен быть разоблачен сейчас.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если dura отделяется от черепа, он будет оставаться над мозгом и должен быть удален отдельно. Края оставшейся дюры могут затянуть и нарезать глубоко через мозг, потенциально повреждая область мозга, представляющих интерес. - Удалите мозг, зачерпнув его с небольшой шпателем. Бросьте мозг в раствор NMDG-aCSF, помещенный в отдельный маленький стакан на льду. Оставьте его там на минуту.
ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к переохлаждению, воздействие ледяного солевого раствора фирмы вверх по мозгу, что необходимо для даже резки. Вся процедура от обезглавливания до извлечения мозга должна быть в возрасте до 30 с.
- Обезглавливать мышь большими ножницами обезглавливания. Используя скальпель с #10 лезвием, разрезать кожу на верхней части черепа. С небольшими угловыми ножницами, вырезать череп на средней линии. Далее, используя #3 щипцы, подглядывать правой и левой половины черепа, стараясь взять dura прочь с ним. Мозг должен быть разоблачен сейчас.
3. Нарезка
- Возьмите мозг из NMDG-aCSF и поместите его на листе фильтровальной бумаги.
- Вырезать и удалить 60 "клин из рострального конца предтеко с помощью инструмента "60" по центру на средней линии. Вырезать поверхности будут использоваться для монтажа для достижения надлежащего угла для поперечного гиппокампа ломтиками, как говорилось ниже(Рисунок 1A,B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Два односхейных лезвия, удерживаемые вместе через самодельный держатель сделать простой в использовании инструмент для принятия 60 "вырезать (Рисунок 1A). - Отдельные полушария вниз по средней линии со скальпелем.
- Клей полушарий на монтаж диска следующим образом. Возьмите монтаж диск, который был на льду до сих пор. При необходимости протрите его высушить снова. Клей каждое полушарие перед блоком агара, вырезать сторону вниз.
- Убедитесь, что вентральная сторона каждого полушария касается блока агара. Блок агара обеспечивает дополнительную поддержку во время резки и необходим даже для ломтиков. Спинные стороны каждого полушария должны быть обращены к лезвию. При приклеивания на стороне разреза, каждое полушарие ориентировано по отношению к лезвию таким образом, что приводит к поперечными ломтиками спинной гиппокампа на месте (Рисунок 1B).
- Погрузите диск со полушариями в режущую камеру, содержащую ледяной карбогенированный NMDG-aCSF.
- Вырезать 400 мкм разделов. Резка должна быть сделана менее чем за 10 мин. Различные микротомы потребуют различных настроек для достижения этого времени. В общей сложности 8'u201210 ломтиков из спинной области гиппокампа будут получены.
4. Восстановление
- Передача ломтиков в камеру восстановления, содержащую карбогенированный aCSF при комнатной температуре, используя одноразовые трубки передачи с отрезанными наконечниками(Рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется укрепить восстановительную камеру-ASCF с 5 мМ На-аскорбатом и 3 мМ На-пирувате. Pyruvate является энергетический субстрат показано, чтобы увеличить производство АТФ в ломтики28, в то время как Na-ascorbate является свободно-радикальным quencher29. - Инкубировать при комнатной температуре (22х20 х 24 градусов) примерно за 2 ч до записи (до 4 ч).
ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительная инкубация при комнатной температуре приводит к более здоровым ломтикам в течение более длительных периодов времени, по сравнению со стандартной инкубацией при 37 градусах в течение 30 минут с последующим инкубацией комнатной температуры. Потепление при 37 градусов по Цельсию может ввести цитотоксический отек13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы применили вышеуказанный протокол для генерации ломтиков гиппокампа от CamKIIa-Cre'; WT мышей на смешанном генетическом фоне C57Bl / 6 х SV / 129J, на P Большое количество пирамидальных клеток в поле CA1(Рисунок 2A) и subiculum(Рисунок 2B) появляются в низком контрасте, когда наблюдается под инфракрасной дифференциальной контрастной микроскопией (IR-DIC), отличительной чертой здоровых клеток в подготовке кусок. При этом препарате высокая скорость гига-охм тюленей (90%) обычно достигается при ориентации на здоровые клетки примерно 20'u201250 микрон под поверхностью. Для этого успеха, важно использовать высокую цель NA для IR-DIC, такие как 60x водопойное цель, для того, чтобы достичь адекватной визуализации пирамидальных клеток на этой глубине(Рисунок 2A,B).
Патч-зажим записи из одного нейрона легко достижимы с помощью этого гиппокампа ломтик подготовки даже у мышей старше шести месяцев. Рисунок 2C показывает пример эксперимента с использованием миниатюрных возбуждающих постсинаптических токов (mEPSCs) записей из нейронов CA1. Индукция химических NMDA-LTD с применением ванны 20 м NMDA в течение 3 минут снижает частоту mEPSC в клетках CA1 при оценке 60 мин после NMDA лечения. Этот вывод свидетельствует о том, что NMDA-LTD вызывает деятельность зависит обрезки синапсов в CA1 у старых мышей (результаты адаптированы из Джуриси и др.15). Изменения в амплитуде mEPSC не были обнаружены. Во время записи mEPSC клетки CA1 также были заполнены биоцитином. Рисунок 2D показывает нетронутыми дендритной беседки и здоровых клеток habitus биоцитина заполненных CA1 пирамидальных нейронов. Надежное распределение флуоресцентного красителя по всей клетке позволяет проводить рутинную оценку свойств дендритного позвоночника в различных экспериментальных условиях.
Использование полевых записей, долгосрочная потенцирование (LTP) в размере 170% CA3-CA1 синапсов в ломтиках от взрослых мышей было легко наблюдаться, предлагая поддержание сигнальных каскадов, необходимых для LTP (Рисунок 2E, F). Сетевая связь, необходимая для надежного полевого возбуждающего постсинаптического потенциала (fEPSP), также сохраняется(рисунок 2E). Способность оценивать синаптической пластичности в гиппокампе ломтики от взрослых или старения мышей особенно актуальна для мышиных моделей нейродегенеративных заболеваний, как их отличительной чертой синаптической дисфункции развивается в более позднем возрасте.
Вместе наши результаты показывают, что острый препарат гиппокампа от взрослых и стареющих мышей позволяет оценить синаптической функции на уровне как отдельных клеток, так и популяции клеток регулярно, до тех пор, пока транскардиальная перфузия и холодные растворы NMDG используются для минимизации гипоксического ущерба.
Рисунок 1: Метод резки и восстановления поперечного гиппокампа ломтики от взрослых и старения мышей. (A) "60" инструмент, используемый для удаления 60 "клин из ростовского конца мозга, по центру на средней линии. (B) Позиционирование полушарий для резки поперечного ломтика. Иллюстрация среза на 60 градусов показана слева и в правом верхнем углу панелей; расположение двух полушарий на поверхности с клеем таким образом, показанным в нижней правой панели обеспечивает перпендикулярную ориентацию спинного гиппокампа по отношению к лезвию. Эта ориентация приводит к поперечной ломтикам гиппокампа. желтые структуры представляют собой 3D визуализацию гиппокампа в мозге грызунов (серый). Эта иллюстрация адаптирована из SynapseWeb30. Все виды спинной стороны мозга. (C) Трансверсионные гиппокампа ломтики вырезать из 4-месячной мыши в камере восстановления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Патч-зажим и синаптические измерения пластичности в гиппокампе ломтики от мышей на P120'u2012180. (A) Пример микрографа IR-DIC региона CA1. (B) Пример микрографов ИК-ДИК субикулума. В обоих A и B, изображения принимаются 3 ч после резки с 60x водо-погружения цели. Калибровка бар составляет 10 мкм (C) Влияние химических NMDA-LTD на mEPSCs в CA1 нейронов от P120'u2012180 мышей. Верхняя панель является примером следов mEPSCs, записанных на базовом уровне и после пульса NMDA-LTD. Нижняя левая панель: NMDA-LTD привела к снижению частоты mEPSC. Нижняя правая панель: изменение амплитуды mEPSC после того, как NMDA-LTD не обнаружена. N 17 клеток на базовом уровне и n No 15 клеток для NMDA-LTD, 6 мышей. P 0,004, т-тест. Эта цифра была изменена с Djurisic и др.15. (D) Пример биоцитина заполненные CA1 пирамидальной клетки. (E) Пример сигнала fEPSP от CA1 stratum радиации после Шаффера сопутствующей стимуляции. Серый след получен во время базовой записи, а черный след наблюдается через 20 минут после тетановой стимуляции. Каждый след в среднем 30 последовательных следов. (F) Совокупный средний долгосрочный потенцирования CA3-CA1 синапсов после 4 поездов 100 Гц индукции; n 23 ломтика от 8 мышей WT примерно при P90. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
| Искусственная спинномозговая жидкость (ACSF) | ||||
| Ингредиенты | Мвт | Окончательный conc. (mM) | g/2 Литры (10X) | g/Liter (1X) |
| Nacl | 58.44 | 125 | 146.1 | - |
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | 43.68 | - |
| Kcl | 74.55 | 2.3 | 3.43 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.26 | 3.44 | - |
| Mg2SO4-7H2O | 203.3 | 1.3 | - | 1,3 мл 1 млн штока |
| CaCl2-2H2O | 147.02 | 2.5 | - | 2,5 мл 1 млн штока |
| Глюкоза-H2O | 180.2 | 25 | - | 4,5 г |
| а) Добавить Mg2SO4'7H2O и CaCl2'2H2O из 1M запасов | ||||
| б) aCSF 10X держать @RT | ||||
| в) aCSF 1X 4'C для 24h | ||||
| NMDG-aCSF | ||||
| Ингредиенты | Мвт | Окончательный conc. (mM) | g/2 Литры (3X) | g/300 мл (1X) |
| NMDG | 195.22 | 135 | 158.13 | - |
| рХ-7,4 с HCl | ||||
| Kcl | 74.55 | 1 | 0.4473 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.2 | 0.9799 | - |
| MgCl2-6H2O | 203.3 | 1.5 | 1.8297 | - |
| CaCl2-2H2O | 147.02 | 0.5 | 0.4411 | - |
| Холин Бикарбонат | 80% | 20 | - | 1238 мл |
| Глюкоза-H2O | 180.2 | 10 | - | 0.54 |
| а) Фильтр и хранить 3X стоковое решение при 4 градусов по Цельсию | ||||
Таблица 1: Составы сми.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, показывает, что гиппокампе ломтики, полученные от взрослых и стареющих мышей может оставаться здоровым и жизнеспособным в течение многих часов после резки. Срезы, подготовленные с использованием этого протокола, подходят для записи патч-зажима, а также длительных полевых записей в регионах CA1.
В этом протоколе есть два важных шага. Первым шагом является шаг транскардиальной перфузии с ледяным раствором. Быстрый клиренс крови сигнализируется о быстром изменении цвета печени. Извлеченный мозг должен быть небелым цветом. Если мозг остается розовым, это означает, что системная кровь не была заменена на холодную NMDG-aCSF, и падение температуры тела не было достигнуто. Это может быть вызвано неправильным размещением иглы в сердце, или потому, что сердце было проколото. Мозги от плохо пронизанных мышей не следует использовать для нарезки. Вторым важным шагом является использование NMDG в качестве заменителя иона натрия. Известный ранее вариации протокола, который успешно использует сахарозу в качестве замены для Naй в крысиных мозгах10,31 не производит достаточно здоровых ломтиков гиппокампа у мышей (также см. Тинг и др.13). Использование NMDG в качестве заменителя иона натрия имеет решающее значение для мыши гиппокампа ломтиками.
В то время как здоровые ломтики гиппокампа надежно получены с помощью описанного протокола, гиппокампа подготовки взрослых и старения животных остается сложной задачей. Его сложность также меняется с различными линиями мыши и генетическим фоном. Потенциальные модификации для рассмотрения являются добавки к NMDG-aCSF и восстановления aCSF решения, такие как таурин, D-серин, или N-ацетилцистеин (NAC), которые могли бы увеличить нейрональной и синаптической функции13,29, увеличение оксигенации29. Замена ионов Cl- также следует учитывать во время перфузии и резки32. Использование камеры восстановления интерфейса является еще одним способом поддержания повышенной оксигенации, что особенно актуально для долгосрочной пластичности полевых записей. Описанная камера восстановления(Рисунок 1C)изменяется для этой цели (например, блюдо вставки культуры, которое смлажнеет снизу aSCF, может заменить погруженную сетку). Замена стальных лезвий сапфировыми или керамическими лезвиями может уменьшить сжатие тканей, усугубляемую тяжелой миелинизацией белого вещества вокруг гиппокампа; это, в свою очередь, может еще больше улучшить качество нейронов вблизи поверхности среза. Использование микротомов, предназначенных для минимизации вертикальной вибрации (например, нулевой z в Leica VT1200S), является еще одним изменяемым шагом.
Другие области мозга могут быть нарезаны с помощью протокола, описанного здесь, с соответствующими изменениями в углах резки. Кроме того, можно скорректировать строгость подготовки креза, так как различные области мозга чувствительны к гипоксии в разной степени. Протокол, который использует NMDG-aSCF было сообщено для взрослых мышей неокортекс и стриатум ломтик препараты13,20; он использует NMDG-aCSF, который содержит 30 mM NaHCO3 (т.е. это не Na-free)20, а в некоторых случаях транскардиальная перфузия с NMDG-aCSF при комнатной температуре13. Тем не менее, для региона, как восприимчивы к гипоксии, как гиппокамп, используя Na-freeNMDG-aCSF и ледяной транскардиальной перфузии может иметь решающее значение.
Этот протокол применим к широкому спектру трансгенных линий мыши моделирования нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, протокол может быть дополнительно изменен на кусочки мозга от других видов моделей млекопитающих, а также. В совокупности этот протокол может послужить основой для стандартизированной подготовки острых ломтиков гиппокампа от стареющих животных и тем самым способствовать сопоставлению между исследованиями в контексте механизмов болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автору нечего раскрывать.
Acknowledgments
Я благодарю д-ра Карлу Дж. Шац за совет и поддержку, а д-р Барбара К. Брот и Мишель К. Дрюс за критическое прочтение рукописи. Работа поддерживается NIH EY02858 и Благотворительный фонд Mathers гранты CJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
- Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain. Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus. Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).
- Free Mandel, P. H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals. Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).
- Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).
- Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats. Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).
- Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex. Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).
- Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).
- Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G. Patch-Clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. 1183, Springer. Ch. 14 221-242 (2014).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 1-10 (2015).
- Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids. Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).
- Djurisic, M., et al. PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).
- Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
- Blot, A., Barbour, B. Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau. Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).
- Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli. Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).
- Frick, A., Magee, J., Johnston, D. LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites. Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).
- Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell. PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).
- Brooks, J. M., O'Donnell, P. Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).
- Goel, A., Lee, H. K. Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex. Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).
- Izumi, Y., Zorumski, C. F. Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices. Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).
- Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
- Fiala, J. C., Spacek, J. Hippocampus Rat. , Available from: https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat (1999).
- Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons. Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
