Summary
Detta är ett protokoll för akut skiva beredning från vuxna och åldrande mus hippocampi som drar nytta av transkardialaperfusion och skiva skärning med iskall NMDG-aCSF att minska hypoxisk skada på vävnaden. De resulterande skivorna håller sig friska under många timmar, och är lämpliga för långsiktiga patch-clamp och fält-inspelningar.
Abstract
Akut hippocampus skivor har gjort det möjligt generationer av neuroforskare att utforska synaptiska, neuronala, och krets egenskaper i detalj och med hög trohet. Utforskning av LTP och LTD mekanismer, enda neuron dendritic beräkning och erfarenhet-beroende förändringar i kretsar, skulle inte ha varit möjligt utan denna klassiska beredning. Men med några få undantag, de flesta grundläggande forskning med akut hippocampus skivor har utförts med hjälp av skivor från gnagare i relativt unga åldrar, ~ P20-P40, även om synaptiska och inneboende retbarhet mekanismer har en lång utvecklingsstjärt som når förbi P60. Den viktigaste överklagandet av att använda unga hippocampus skivor är bevarande av neuronal hälsa med hjälp av högre tolerans mot hypoxisk skada. Det finns dock ett behov av att förstå neuronal funktion på mer mogna stadier av utveckling, ytterligare accentueras av utvecklingen av olika djurmodeller av neurodegenerativa sjukdomar som kräver en åldrande hjärnan förberedelse. Här beskriver vi en ändring av en akut hippocampus skiva beredning som på ett tillförlitligt sätt levererar friska skivor från vuxna och åldrande mus hippocampi. Protokollets kritiska steg är transkardial perfusion och skärning med iskall natriumfri NMDG-aSCF. Tillsammans dämpar dessa steg den hypoxiinducerade droppen i ATP vid halshuggning, samt cytotoxiskt ödem som orsakas av passiva natriumfluss. Vi visar hur man skär tvärgående skivor av hippocampus plus cortex med hjälp av en vibrerande mikrotom. Akut hippocampus skivor som erhållits på detta sätt är tillförlitligt friska under många timmar av inspelning, och är lämpliga för både fält-inspelningar och riktade patch-clamp inspelningar, inklusive inriktning av fluorescerande märkt nervceller.
Introduction
Tillkomsten av däggdjur akut hjärnan skiva preparat underlättas experiment på cellulär och synaptisk nivå som tidigare var möjligt endast i ryggradslösa preparat som Aplysia1. Utveckling av akut hippocampus skivor var av särskild betydelse, eftersom det är en struktur som ansvarar för arbetsminne och sammanhang bildning, och har en specialiserad tri-synaptiska kretsar som är mottagliga för lätt fysiologisk manipulation. Emellertid, de allra flesta akut hjärnan skivor är fortfarande beredda från relativt unga möss och råttor, eftersom det är lättare att bevara friska nervceller och kretsar, och skivorna förblir livskraftiga under längretidsperioder 2,3,4. Här inför vi ändringar i standard skivning protokoll som resulterar i ökad lönsamhet för akut hippocampus skivor från vuxna och åldrande möss.
Det stora hindret för den långsiktiga ex vivo livskraften hos däggdjurshjärnparenkym är den initiala hypoxiska skada som inträffar snabbt när blodflödet till hjärnan slutar efter halshuggning. Förlust av syre resulterar i snabb metabolisk konsumtion av större energiresurser i hjärnan med förlusten av fosfo-kreatin (P-kreatin) är den snabbaste, följt av glukos, adenosintrifosfat (ATP), och glykogen4. Bevarande av ATP är av särskild betydelse för den långsiktiga hälsan hos hjärnan skivor, som ATP behövs för att upprätthålla membranet potential via Na-K ATPase, och följaktligen den neurala aktiviteten5,6. ATP-nivån i den vuxna gnagare hjärnan är ~ 2,5 mM, och det droppar precipitously inom 20 s av halshuggning för att nå en basal steady state (~ 0,5 mM) på cirka 1 min post-halshuggning4,7,8. Hos unga djur tar det längre tid att observera samma droppe i ATP (~2 min); med fenobarbital anestesi det bromsas ytterligare till 4 min4. Dessa överväganden visar att förhindra förlust av ATP och andra energiresurser är en nödvändig strategi för att förhindra hypoxisk skada på hjärnan och i sin tur att upprätthålla hälsan hos hjärnan skivor över längre tidsperioder, särskilt hos vuxna djur.
Låga temperaturer saktar ner ämnesomsättningen. Följaktligen har det visats att blygsam hypotermi skyddar hjärnans energireserver: hos unga djur, sänka kroppstemperaturen med sex grader, från 37 °C till 31 °C, bevarar ATP-nivåer till cirka 80% av normala nivåer över 4 h av kontrollerad hypoxi9. P-kreatinhalterna bevaras på liknande sätt, liksom den totala fosforyleringspotentialen9. Detta tyder på att sänka kroppstemperaturen före halshuggning kan vara nervskyddande, som nästan normala nivåer av ATP skulle kunna upprätthållas genom skiva styckning och skiva återhämtning perioder.
Till den grad att en ATP-droppe inte helt kan förhindras vid halshuggning förväntas en delvis försämrad funktion av Na-K ATPase, följt av depolarisering via passiv natriumtillströmning. Eftersom den passiva natriumtillströmningen följs av vatteninträde i celler, orsakar det cytotoxiska ödem och så småningom pyknosis. Hos vuxna råttor har det varit en framgångsrik strategi att ersätta Na+ joner med sackaros i skärande lösningar som är en framgångsrik strategi för att lindra bördan av cytotoxisktödem 10,11. På senare tid har metylerade organiska katjoner som minskar natrium kanal permeabilitet12 visat sig erbjuda effektivare skydd än sackaros, särskilt i skivor från vuxna möss, med N-metyl-D-glucamine (NMDG) är mest allmänt tillämpliga i olika åldrar och regioner hjärnan13,14,15,16.
Många hjärnskärningsprotokoll innebär att man bara använder kalla temperaturer under det skärande steget, ibland i kombination med Na+ jonersättningsstrategi16,17. Hos unga djur, dessa protokoll verkar erbjuda tillräcklig neuroprotektion eftersom hjärnorna kan utvinnas snabbt efter halshuggning eftersom skallen är fortfarande tunn och lätt att ta bort3. Denna strategi producerar dock inte friska skivor från vuxna djur. Med tiden har ett antal laboratorier som studerar vuxna gnagare infört transkard perfusion med en iskall lösning för att minska djurets kroppstemperatur, och därför hypoxisk skada på hjärnan, före halshuggning. Detta förfarande tillämpades framgångsrikt för att producera cerebellar skivor18, midbrain skivor19, neokortikala skivor11,20, perirhinal cortex21, råtta hippocampus10,22,23, luktbulb24, ventral striatum25, visuell cortex26.
Trots de fördelar som erbjuds av transkardial perfusion och Na+ jonersättning i att förbereda skivor från råtta och i vissa regioner i hjärnan hos möss, är mus hippocampus fortfarande en av de mest utmanande områden för att skydda från hypoxi13,20. Hittills innebär en av de vanligaste metoderna för att skära hippocampus från åldrande möss och musmodeller av neurodegeneration den klassiska snabb skivning av den isolerade hippocampi27. I det protokoll som beskrivs här, minimerar vi förlusten av ATP i den vuxna hjärnan genom att införa hypotermi före halshuggning genom transcardially perfusing djuret med iskall Na+- fri NMDG-baserade konstgjorda ryggmärgsvätskan (NMDG-aCSF). Skivor skärs sedan i iskall Na+-fri NMDG-aCSF. Med detta förbättrade protokoll får vi akut hippocampus skivor från vuxna och åldrande möss som är friska för upp till 10 h efter skivning och är lämpliga för långsiktiga fält-inspelningar och patch-clamp studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet utförs i enlighet med Handledning för vård och användning av laboratoriedjur vid National Institutes of Health och godkänts av Stanford University Institutions Institutions Care and Use Committee. Metoder är också i enlighet med den politik som förs av Society for Neuroscience om användning av djur och människor i neurovetenskap forskning.
OBS: Alla möss bibehölls i en patogenfri miljö. Här användes möss av vildtyp på blandad C57Bl/ 6 x SV/ 129J genetisk bakgrund, om inget annat anges.
1. Installationsprogrammet
- Förbered 1 L av 1x aCSF (i mM): 125 NaCl, 26 NaHCO3, 2.3 KCl, 1.26 KH2PO4, 1.3 Mg2SO4·7H2O, 2.5 CaCl2, 25 glukos (Tabell 1). Använd denna lösning för återhämtningskammaren och efterföljande inspelningar.
OBS: Förvara aCSF som en 10x stamlösning som innehåller NaCl, NaHCO3, KCl och KH2PO4. Förvara Mg2SO4·7H2O och CaCl2 som 1 M lagerlösningar. Förbered arbetslösningen på dagen för experimentet från ovanstående lager lösningar, och tillsätt glukos innan du justerar den slutliga volymen med 18 MΩ vatten.
OBS: Beroende på hjärnregionen eller musstam, kyld aCSF kan också användas för transkardeal perfusion med framgång11,15,26. - Förbered 300 mL NMDG-aCSF (i mM): 135 NMDG, 1 KCl, 1,2 KH2PO4, 1,5 MgCl2, 0,5 CaCl2, 20 kolinbikarbonat, 10 glukos (Tabell 1). Denna volym av NMDG-aCSF är tillräcklig för både transcardial perfusion och skärsteg.
OBS: Förvara NMDG-aCSF som en 3x stamlösning vid 4 °C. Förbered arbetslösning på dagen för experimentet; tillsätt kolinbikarbonat och glukos innan den slutliga volymen justeras med 18 MΩ-vatten. Bubbla lösningen med 95%O2/5%CO2 för att buffra den, och mätta med syre.
OBS: NMDG-beståndet startar som mycket alkaliskt, och kräver koncentrerad saltsyra (HCl) för att justera pH till ~7.4. Tillsats av saltsyra bör vara långsam en gång under pH 8, eftersom det är lätt att försura lösningen till ~ pH 3 med överskott HCl. Denna justering bör göras innan du lägger till divalent katjoner. Detta NMDG-aCSF recept är natriumfri. Tidigare publicerade NMDG recept använda 30 mM NaHCO3 för buffring, vilket resulterar i 30 mM natrium närvarande i NMDG-aCSF13,20. - Ställ in den vibrerande skärbrickan för mikrotom och monteringsdisketten på -20 °C.
- Förbered återhämtningskammaren.
- Fyll återhämtningskammaren till strax ovanför skiva-innehav nätet, hålla den på bänken vid rumstemperatur, och bubbla.
OBS: Slice återhämtning kammare som används här är mycket lik de klassiska kamrarna beskrivs tidigare av Edwards och Konnerth3. aCSF hålls i en glasbägare (400 mL) som håller en rund akrylram med svart nylonnät limmat i botten. Akrylramen är upphängd mitt på bägaren via en akrylkrok som vilar över bägarens kant. Glasbubblaren sätts in hela vägen till botten. Konstruktionen möjliggör syresättning av båda sidor av skivor. Bubblande ger också konstant blandning av aCSF i återhämtningskammaren. Det svarta nätet ger en hög kontrast mot de off-white skivor, som sedan lättare att se.
- Fyll återhämtningskammaren till strax ovanför skiva-innehav nätet, hålla den på bänken vid rumstemperatur, och bubbla.
- Bered transkortperfusion och skärlösning.
- Kyl hela 300 mL NMDG-aCSF i en frys, tills iskristaller börjar bildas på ytan och flaskans väggar. INTE överfrys!
- Placera flaskan med kyld NMDG-aCSF på is och bubbla. Lösningen ska vara mellan 0\u20122 °C.
OBS: Slushy NMDG- aCSF innebär att ha det mesta av lösningen som vätska, medan en liten bråkdel av slaskig is närvarande kommer att hålla lösningen nära 0 °C hela perfusion och skärning. Försiktighet bör vidtas för att hålla borta iskristaller från hjärnan under skärning.
- Förbered vävnadsmontagedisken.
- Ta ut disken ur frysen, torka den torr om det behövs.
- Klipp ut ett block av 5% agar från den tidigare beredda agarplattan, och limma den i mitten av disken med hjälp av ett tunt lager cyanoakrylatlim. Agar bit bör vara ungefär lika stor som en mus hjärna. Placera disken med limmad agar på is, och täck med hushållspapper tills den är klar att använda.
- För 5% agar platta, lösa 5 g agar i 100 mL av 18 MΩ vatten genom microwaving, och häll i en ren petriskål. Håll vid 4 °C.
- Ta ut skärbrickan ur frysen, placera den i mikrotomen, omge den med is och ladda bladet.
2. Transcardial perfusion och hjärnutdragning
- Överdosering möss via en intraperitoneal injektion av bedövningsmedel cocktail. Kontrollera för anestesidjupet genom att kontrollera smärtreflexen (tå nypa); en mus bör inte uppvisa reflexen när den når djup anestesi.
OBS: Gnagare anestesi cocktail recept: Ketamin HCl (66 mg/mL), xylazine HCl (6.6 mg/mL), acepromazin maleate (0.1 mg/mL), 18 MΩ vatten till slutlig volym. Dos: 0,4 mg/g kroppsvikt, 0,04 mg/g kroppsvikt, 6 x 10-4 mg/g kroppsvikt för ketamin, xylazin, respektive acepromazin. - Uppställda den peristaltiska pumpen för transkardial perfusion. Sätt in ena sidan av pumpslangen i flaskan med iskallt NMDG-aCSF. Montera den andra sidan av slangen med 27 G-nålen som kommer att föras in i den vänstra ventrikeln.
- Ställ in pumphastigheten på ca 3,5 mL/min. Vid denna hastighet, utflödet av NMDG-aCSF är en snabb dropp, inte kontinuerligt flöde.
OBS: Perfusion genom gravitation är ett bra substitut för peristaltisk pumpperfusion, så länge som samma ungefärliga flödeshastighet kan uppnås. En perfusion vid hög flödeshastighet kommer att resultera i burst blodkärl i hjärnan. En kontrollampa tecken på en alltför snabb perfusion och ökat tryck i blodkärlen är lösning som kommer ut ur näsan på djuret. - Perfusion
- Placera den ordentligt sövda musen på ryggen på en blöja. Använda papperstejp, tejpa ner dess främre och bakben så att bröstet och buken utsätts.
- Klipp ut en stor fläck av huden ovanpå bröstet, går under bröstbenet till halsen; detta bör ge ett stort arbetsområde. Ta tag i bröstbenet med tärna, lyft försiktigt, och börja skära genom bröstkorgen på båda sidor tills brösthålan är utsatt.
- Skär genom membranet för att exponera brösthålan. Klaffen av bröstkorgen bör lämnas fäst via en tunn bit av muskeln. Det bör vara möjligt att ställa in den på en sida utan att ha det falla tillbaka på den exponerade brösthålan. Kontrollera att hjärtat fortfarande slår. Se till att de flesta av levern är synlig.
- Sätt in 27 G-nålen i den vänstra ventrikeln; musens vänstra kammare ser ljusare ut i färgen än den högra. Leta reda på det mörkröda högra atriumet. Skär genom det högra atriumet med liten sax; blodet ska börja rinna ut.
- Starta pumpen som har förinställts till rätt flödeshastighet. Om allt gjordes på rätt sätt, levern ska börja ändra färg från rött till brunt strax efter starten av perfusion. Övervaka leverfärgen för att bestämma längden på perfusionen; levern ska bli ljusbrun.
- Kör pumpen i ytterligare några minuter. Om du använder rektaltermometer bör kroppstemperaturen sjunka ner till 28\u201229 °C, och djurets näsa ska vara kall vid beröring.
- Hjärnutdragning.
OBS: För detta steg, ha följande dissekeringsverktyg redo: halshuggning sax, små saxar med rakt eller vinklat blad, skalpell och #10 blad, enkel kant blad, #3-tång, spatel med en sida böjd till 90 °, en spatel, en "60 °" verktyg (Figur 1A,B), och en liten mjuk borste.- Halshugga musen med stor halshuggningsax. Med hjälp av en skalpell #10 ett bladet, skär upp huden ovanpå skallen. Med liten vinklad sax, skär skallen vid mittlinjen. Därefter, med hjälp av #3 tärna, bända bort höger och vänster halvor av skallen, vara noga med att ta dura bort med den. Hjärnan ska exponeras nu.
OBS: Om dura lossnar från skallen, kommer det att stanna över hjärnan och måste tas bort separat. Kanterna på den återstående dura kan dra åt och skiva djupt genom hjärnan, potentiellt skadar hjärnan regionen av intresse. - Ta bort hjärnan genom att ösa ut den med en liten spatel. Släpp hjärnan i NMDG-aCSF-lösningen placerad i en separat liten bägare på is. Lämna den där i upp till en minut.
OBS: Förutom hypotermi, exponering för iskalla saltlösning företag upp hjärnan, vilket är nödvändigt för jämn skärning. Hela proceduren från halshuggning till hjärnextraktionen bör vara under 30 s.
- Halshugga musen med stor halshuggningsax. Med hjälp av en skalpell #10 ett bladet, skär upp huden ovanpå skallen. Med liten vinklad sax, skär skallen vid mittlinjen. Därefter, med hjälp av #3 tärna, bända bort höger och vänster halvor av skallen, vara noga med att ta dura bort med den. Hjärnan ska exponeras nu.
3. Skivning
- Ta hjärnan ur NMDG-aCSF och placera den på en bit filterpapper.
- Skär och ta bort en 60° kil från den rostala änden av framhjärnan med hjälp av ett "60°" verktyg centrerat vid mittlinjen. Snittytor kommer att användas för montering för att uppnå rätt vinkel för transversala hippocampusskivor enligt nedan diskuteras (Figur 1A,B).
OBS: Två enkeleglade blad som hålls samman via en hemmagjord hållare gör ett lättansat verktyg för att göra 60°-snittet (Bild 1A). - Separera halvklot ner mittlinjen med skalpell.
- Limma på halvkloten på monteringsdisketten enligt följande. Ta monteringsdisketten som har varit på is tills nu. Om det behövs, torka den igen. Lim varje halvklot framför agarblocket, skär sidan ner.
- Se till att den ventrala sidan av varje halvklot vidrör agarblocket. Agarblocket ger ytterligare stöd under skärning och är väsentligt för jämna skivor. Dorsala sidor av varje halvklot ska vara vänd mot bladet. När limmade på den skurna sidan, varje halvklot är orienterad i förhållande till bladet på ett sätt som resulterar i tvärgående skivor av dorsala hippocampus in situ (Figur 1B).
- Dränka disken med halvklot i en skärkammare som innehåller iskall carbogenated NMDG-aCSF.
- Skär 400 μm sektioner. Kapning ska ske på mindre än 10 min. Olika mikrotomer kommer att kräva olika inställningar för att uppnå denna tid. Totalt 8\u201210 skivor från regionen dorsala hippocampus kommer att erhållas.
4. Återhämtning
- Överför skivor till en återhämtningskammare som innehåller karbiogenerad aCSF i rumstemperatur med hjälp av engångsöverföringspipetter med cut-off-spetsar (Figur 1C).
OBS: Det rekommenderas starkt att befästa återhämtning kammare-aSCF med 5 mM Na-askorbate och 3 mM Na-pyruvat. Pyruvat är ett energisubstrat som visat sig öka produktionen av ATPi skivor 28, medan Na-ascorbate är en friradikala quencher29. - Inkubera i rumstemperatur (22\u201224 °C) i ungefär 2 h före inspelning (upp till 4 h).
OBS: En längre inkubering vid rumstemperatur resulterar i friskare skivor under längre tidsperioder, i förhållande till standardinkubationen vid 37 °C i 30 min följt av inkubering av rumstemperatur. Rewarming vid 37 °C kan införa cytotoxiska ödem13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi tillämpade ovanstående protokoll för att generera hippocampus skivor från CamKIIa-Cre +; WT-möss på en blandad genetisk bakgrund C57Bl/ 6 x SV/ 129J, vid P > 120. Stort antal pyramidceller i CA1-fältet (Figur 2A) och subiculum (Bild 2B) förekommer i låg kontrast när de observeras under infraröd differentialkontrastmikroskopi (IR-DIC), ett kännetecken för friska celler i en skiva beredning. Med denna beredning, en hög hastighet av giga-ohm tätningar (> 90%) uppnås rutinmässigt när man riktar in sig på de mest hälsosamma cellerna ungefär 20\u201250 mikrometer under ytan. För denna framgång är det viktigt att använda ett högt NA-mål för IR-DIC, såsom ett 60x vatten-nedsänkning mål, i syfte att uppnå tillräcklig visualisering av pyramidala celler på detta djup (Figur 2A,B).
Patch-clamp inspelningar från enda nervceller är lätt att uppnå med hjälp av denna hippocampus skiva beredning även i möss över sex månader. Figur 2C visar ett exempel experiment med miniatyr excitatoriska postynaptic strömmar (mEPSCs) inspelningar från CA1 nervceller. Induktion av kemiska NMDA-LTD med bad tillämpning av 20 μM NMDA i 3 min sänker mEPSC frekvens i CA1 celler när bedömt 60 min post-NMDA behandling. Denna slutsats tyder på att NMDA-LTD orsakar aktivitetsberoende beskärning av synapser i CA1 hos äldre möss (resultat anpassade från Djurisic et al.15). Förändring av mEPSC amplitud upptäcktes inte. Under mEPSC inspelningar, CA1 celler var också fylld med biocytin. Figur 2D avslöjar en intakt dendritic berså och friska cell habitus av biocytin-fyllda CA1 pyramidala nervceller. En robust fördelning av fluorescerande färgämnet i hela cellen möjliggör rutinmässig utvärdering av dendritiska ryggradsegenskaper under olika experimentella förhållanden.
Med hjälp av fält-inspelningar, långsiktiga potentiering (LTP) av ~ 170% av CA3-CA1 synapser i skivor från vuxna möss var lätt observeras, vilket tyder på underhåll av signalering kaskader som behövs för LTP (Figur 2E, F). Nätverksanslutning som behövs för en robust fält excitatoriska postynaptic potential (fEPSP) signal bevaras också (Figur 2E). Förmågan att bedöma synaptisk plasticitet i hippocampus skivor från vuxna eller åldrande möss är särskilt relevant för musmodeller av neurodegenerativa sjukdomar som deras kännetecken synaptisk dysfunktion utvecklas senare i livet.
Tillsammans visar våra resultat att en akut hippocampus beredning från vuxna och åldrande möss tillåter bedömning av synaptisk funktion på nivån för både enstaka celler och population av celler rutinmässigt, så länge transcardial perfusion och iskalla NMDG-baserade lösningar används för att minimera hypoxisk skada.
Figur 1: Klippmetod och återvinning av transversala hippocampusskivor från vuxna och åldrande möss. (A) Ett "60°" verktyg som används för att avlägsna 60° kilen från den rostrala änden av hjärnan, centrerat på mittlinjen. (B) Positionering av halvkloten för skärning av tvärgående skivor. En illustration av en 60° snitt visas på vänster och de övre högra panelerna; positionering av de två halvkloten på ytan med lim i sätt som visas i den nedre högra panelen säkerställer en vinkelrät orientering av dorsala hippocampus i förhållande till bladet. Denna orientering resulterar i transversala skivor av hippocampus. Gula strukturer är en 3D-rendering av hippocampi inom gnagare hjärnan (grå). Denna illustration är anpassad från SynapseWeb30. Alla vyer är av den dorsala sidan av hjärnan. (C) Transversal hippocampus skivor skära från en 4-månader gammal mus i en återhämtning kammare. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Patch-clamp och synaptiska plasticitetsmätningar i hippocampusskivor från möss vid P120\u2012180. (A) Ett exempel IR-DIC mikrograf av CA1 region. (B) Exempel IR-DIC mikrografer av subiculum. I både A och B tas bilder 3 h efter kapning med ett 60x vatten-nedsänkning mål. Kalibreringsstång är 10 μm. (C) Effekten av kemiska NMDA-LTD på mEPSCs i CA1 nervceller från P120\u2012180 möss. Övre panelen är exempel spår av mEPSCs registreras vid baslinjen och efter NMDA-LTD puls. Nedre vänstra panelen: NMDA-LTD resulterade i lägre mEPSC frekvens. Nedre högra panelen: mEPSC amplitud förändring efter NMDA-LTD inte upptäcks. N = 17 celler vid baslinjen och n = 15 celler för NMDA-LTD, 6 möss. P = 0,004, t-test. Denna siffra har modifierats från Djurisic et al.15. (D) Exempel på biocytinfylld CA1 pyramidal cell. (E) Exempel på fEPSP signal från CA1 stratum radiatum efter Schaffer säkerhet stimulering. Den grå spår erhålls under baslinjen inspelningen, och den svarta spår observeras 20 min efter tetanic stimulering. Varje spår är i genomsnitt 30 på varandra följande spår. (F) Ackumulerat genomsnitt av långsiktig potentiering av CA3-CA1 synapser efter 4 tåg på 100 Hz induktion; n = 23 skivor från 8 WT-möss vid ungefär P90. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Konstgjord ryggmärgsvätska (aCSF) | ||||
| Ingredienser | Mw | Slutlig conc. (mM) | g/2 Liter (10X) | g/Liter (1X) |
| Nacl | 58.44 | 125 | 146.1 | - |
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | 43.68 | - |
| KCl | 74.55 | 2.3 | 3.43 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.26 | 3.44 | - |
| Mg2SO4*7H2O | 203.3 | 1.3 | - | 1,3 ml 1M-bestånd |
| CaCl2*2H2O | 147.02 | 2.5 | - | 2,5 ml 1M bestånd |
| Glukos*H2O | 180.2 | 25 | - | 4,5 g |
| a) Lägg Till Mg2SO4*7H2O och CaCl2*2H2O från 1M-lager | ||||
| b) aCSF 10X hålla @RT | ||||
| c) aCSF 1X @4°C för 24h | ||||
| NMDG-aCSF | ||||
| Ingredienser | Mw | Slutlig conc. (mM) | g/2 Liter (3X) | g/300 ml (1X) |
| NMDG | 195.22 | 135 | 158.13 | - |
| pH=7,4 med HCl | ||||
| KCl | 74.55 | 1 | 0.4473 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.2 | 0.9799 | - |
| MgCl2*6H2O | 203.3 | 1.5 | 1.8297 | - |
| CaCl2*2H2O | 147.02 | 0.5 | 0.4411 | - |
| Kolin bikarbonat | 80% | 20 | - | 1238 μl |
| Glukos*H2O | 180.2 | 10 | - | 0.54 |
| a) Filtrera och förvara 3X stamlösning vid 4°C | ||||
Tabell 1: Formuleringar av media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som beskrivs här visar att hippocampus skivor som erhållits från vuxna och åldrande möss kan förbli friska och livskraftiga i många timmar efter styckning. De skivor som bereds med hjälp av detta protokoll är lämpliga för patch-clamp-inspelningar, samt långvariga fältinspelningar i CA1-regionerna.
Det finns två kritiska steg i det här protokollet. Första steget är transkardialperfusionssteget med en iskall lösning. Snabb clearance av blod signaleras genom snabb förändring av leverfärg. Extraherade hjärnan bör vara off-white i färg. Om hjärnan förblir rosa, betyder det att systemiskt blod inte ersattes med den kalla NMDG-aCSF, och nedgången i kroppstemperaturen uppnåddes inte. Detta kan orsakas av felaktig placering av nålen i hjärtat, eller för att hjärtat var punkterad igenom. Hjärnor från dåligt perfunderade möss ska inte användas för skivning. Det andra kritiska steget är användningen av NMDG som ett natriumjonersättningssubstitut. En välkänd tidigare variant av protokollet som framgångsrikt använder sackaros som ersättning för Na+ i råtthjärnor10,31 producerar inte tillräckligt friska hippocampusskivor hos möss (se även Ting et al.13). Användningen av NMDG som natriumjonersättning är avgörande för mus hippocampus skivor.
Medan friska hippocampus skivor är tillförlitligt erhålls med hjälp av det beskrivna protokollet, hippocampus beredning från vuxna och åldrande djur är fortfarande utmanande. Dess svårighet ändras också med olika muslinjer och genetiska bakgrunder. Potentiella ändringar att överväga är tillsatser till NMDG-aCSF och återvinning-aCSF lösningar som taurin, D-serin, eller N-acetylcystein (NAC), som skulle kunna öka neuronal och synaptiskfunktion 13,29, öka syresättning29. Substitution av Cl- joner bör också övervägas under perfusion och kapning32. Användning av ett gränssnitt återhämtning kammare är ett annat sätt att upprätthålla ökad syresättning, vilket är särskilt relevant för långsiktig plasticitet fält-inspelningar. Den beskrivna återhämtningskammaren (Figur 1C) är modifierbar för det ändamålet (t.ex. en odlingsinsatsskål som fuktas underifrån av aSCF, skulle kunna ersätta det nedsänkta nätet). Byta stål blad med safir eller keramiska blad kan minska vävnadskompression förvärras av tung myelination av vit materia runt hippocampus; detta i sin tur skulle kunna ytterligare förbättra kvaliteten på nervceller nära skiva ytan. Att använda mikrotomer som är utformade för att minimera den vertikala vibrationen (t.ex. noll-z i Leica VT1200S), är ett annat modifierbart steg.
Andra hjärnregioner kan skäras med hjälp av det protokoll som beskrivs här, med lämpliga ändringar i skärvinklar. Dessutom kan strängheten av skiva beredningen justeras, som olika hjärnregioner är känsliga för hypoxi i olika grader.. Ett protokoll som använder en NMDG-aSCF har rapporterats för vuxna mus neocortex och striatum skivapreparat 13,20; den använder en NMDG-aCSF som innehåller 30 mM NaHCO3 (dvs. det är inte Na+-free)20, och i vissa fall transcardial perfusion är med NMDG-aCSF vid rumstemperatur13. Men för en region som är lika mottaglig för hypoxi som hippocampus, med hjälp av Na+-free NMDG-aCSF och iskall transkortperfusion kan göra en kritisk skillnad.
Detta protokoll är tillämpligt på det stora utbudet av transgena muslinjer som modellerar neurodegenerativa sjukdomar. Dessutom skulle protokollet kunna ändras ytterligare till hjärnskivor från andra däggdjursmodellarter också. Tillsammans skulle detta protokoll kunna tjäna som grund för en standardiserad förberedelse för akut hippocampus skivor från åldrande djur, och därmed underlätta jämförelser över studier i samband med sjukdomar mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inget att avslöja.
Acknowledgments
Jag tackar Dr Carla J. Shatz för råd och stöd, och Dr Barbara K. Brott och Michelle K. Drews för kritiskt läsa manuskriptet. Arbetet stöds av NIH EY02858 och Mathers Charitable Foundation beviljar CJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
- Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain. Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus. Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).
- Free Mandel, P. H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals. Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).
- Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).
- Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats. Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).
- Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex. Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).
- Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).
- Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G. Patch-Clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. 1183, Springer. Ch. 14 221-242 (2014).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 1-10 (2015).
- Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids. Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).
- Djurisic, M., et al. PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).
- Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
- Blot, A., Barbour, B. Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau. Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).
- Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli. Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).
- Frick, A., Magee, J., Johnston, D. LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites. Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).
- Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell. PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).
- Brooks, J. M., O'Donnell, P. Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).
- Goel, A., Lee, H. K. Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex. Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).
- Izumi, Y., Zorumski, C. F. Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices. Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).
- Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
- Fiala, J. C., Spacek, J. Hippocampus Rat. , Available from: https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat (1999).
- Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons. Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
