Summary
Bu doku hipoksik hasarı azaltmak için buz gibi NMDG-aCSF ile transkardiyal perfüzyon ve dilim kesme yararlanır yetişkin ve yaşlanma fare hipokampi akut dilim hazırlanması için bir protokoldür. Elde edilen dilimler saatlerce sağlıklı kalır ve uzun süreli yama kıskaçları ve alan kayıtları için uygundur.
Abstract
Akut hipokampal dilimler nörolognesiller sinaptik keşfetmek için sağlamıştır, nöronal, ve ayrıntılı olarak devre özellikleri ve yüksek sadakat ile. LTP ve LTD mekanizmalarının araştırılması, tek nöron dendritik hesaplaması ve devrelerde deneyime bağlı değişiklikler, bu klasik hazırlık olmadan mümkün olamazdı. Ancak, birkaç istisna dışında, akut hipokampal dilimleri kullanarak en temel araştırma nispeten genç yaşlarda kemirgenler dilimleri kullanılarak yapılmıştır, ~ P20-P40, sinaptik ve içsel uyarılabilirlik mekanizmaları geçmiş P60 ulaşan uzun bir gelişimsel kuyruk olmasına rağmen. Genç hipokampal dilimleri kullanarak ana itiraz hipoksik hasara daha yüksek tolerans tarafından desteklenen nöronal sağlık korunmasıdır. Ancak, gelişmenin daha olgun aşamalarında nöronal fonksiyonu anlamak için bir ihtiyaç vardır, daha da yaşlanan bir beyin hazırlık gerektiren nörodejeneratif hastalıkların çeşitli hayvan modellerinin geliştirilmesi ile vurgulanan. Burada güvenilir yetişkin ve yaşlanma fare hipokampi sağlıklı dilimler sunar akut hipokampal dilim hazırlanması için bir değişiklik açıklar. Protokolün kritik adımları transkardiyal perfüzyon ve buz gibi sodyumiçermeyen NMDG-aSCF ile kesimdir. Birlikte, bu adımlar decapitation üzerine ATP hipoksilen damla zayıflatmak, yanı sıra pasif sodyum akılarının neden olduğu sitotoksik ödem. Titreşen bir mikrotom kullanarak hipokampus artı korteksin transversal dilimlerinin nasıl kesilen yolu göstereceğiz. Bu şekilde elde edilen akut hipokampal dilimler, saatlerce kayıt ta güvenilir bir şekilde sağlıklıdır ve floresan etiketli nöronların hedefalınması da dahil olmak üzere hem alan kayıtları hem de hedeflenen yama-kıskaç kayıtları için uygundur.
Introduction
Memeli akut beyin dilimi preparatları gelişiyle daha önce Aplysia gibi omurgasız preparatlar sadece mümkün olan hücresel ve sinaptik düzeyde deneyler kolaylaştırdı1. Akut hipokampal dilimlerin gelişimi özellikle önem taşıyordu, çünkü çalışan hafıza ve bağlam oluşumundan sorumlu bir yapıdır ve kolay fizyolojik manipülasyona uygun özel bir tri-sinaptik devreye sahiptir. Ancak, akut beyin dilimleri büyük çoğunluğu hala nispeten genç fare ve sıçanlar hazırlanır, sağlıklı nöronlar ve devreleri korumak daha kolay olduğu gibi, ve dilimleri uzun süre canlı kalır2,3,4. Burada, yetişkin ve yaşlanan farelerden akut hipokampal dilimlerin daha canlı olması yla sonuçlanan standart dilimleme protokollerinde değişiklikler sıyoruz.
Memeli beyin parankim uzun vadeli ex vivo canlılık için büyük engel beyin kan akışını n için decapitation aşağıdaki durur kez hızla meydana gelen ilk hipoksik hasardır. Oksijen kaybı fosfo-kreatin kaybı ile beyinde büyük enerji kaynaklarının hızlı metabolik tüketimi sonuçları (P-kreatin) en hızlı olmak, glikoz takip, adenozin trifosfat (ATP), ve glikojen4. ATP korunması beyin dilimlerinin uzun vadeli sağlığı için özel önem taşımaktadır, ATP Na-K ATPase ile membran potansiyelini korumak için gerekli olduğu gibi, ve sonuç olarak nöral aktivite5,6. Yetişkin kemirgen beyinDE ATP seviyesi ~ 2.5 mM, ve bir bazal sabit durumuna ulaşmak için 20 s içinde hızla düşer (~ 0.5 mM) etrafında 1 dk post-decapitation4,7,8. Genç hayvanlarda, ATP aynı damla gözlemlemek için daha uzun sürer (~ 2 dk); fenobarbital anestezi ile 4 dk4'edaha da yavaşlar. Bu hususlar ATP ve diğer enerji kaynaklarının kaybını önlemek için gerekli bir strateji beyin hipoksik hasarı önlemek ve sırayla uzun süreler boyunca beyin dilimlerinin sağlığını korumak için gerekli bir strateji olduğunu göstermektedir, özellikle yetişkin hayvanlarda.
Düşük sıcaklıklar metabolizmayı yavaşlatır. Sonuç olarak, mütevazı hipotermi beyin enerji rezervlerini korur gösterilmiştir: genç hayvanlarda, altı derece vücut ısısını düşüren, 37 °C'den 31 °C'ye, KONTROLLÜ hipoksi nin 4 saat üzerindeki normal seviyelerin yaklaşık %80'ine kadar ATP seviyelerini korur9. P-kreatin düzeyleri benzer şekilde korunur, yanı sıra genel fosforilasyon potansiyeli9. Bu, kafa kesmeden önce vücut ısısını düşürmenin nöroprotektif olabileceğini düşündürmektedir, çünkü normale yakın ATP seviyeleri dilim kesme ve dilim geri kazanım dönemlerinde korunabilir.
Bir ATP düşüştamamen decapitation üzerine önlenemez ölçüde, Na-K ATPase kısmen bozulmuş fonksiyonu bekleniyor, pasif sodyum akını ile depolarizasyon takip. Pasif sodyum akını hücrelere su girişi takip gibi, sitotoksik ödem ve sonunda pyknoz neden olur. Yetişkin sıçanlarda, dilim kesme çözeltilerinde Na+ iyonlarının sakaroz la değiştirilmesi sitotoksik ödemin yükünü hafifletmek için başarılı bir strateji olmuştur10,11. Daha yakın zamanda, sodyum kanal geçirgenliği azaltmak metillenmiş organik katyonlar12 sakaroz daha etkili koruma sunmak için göstermiştir, özellikle yetişkin farelerden dilimleri, N-metil-D-glukagon ile (NMDG) en yaygın farklı yaş ve beyin bölgeleri arasında uygulanabilir olan13,14,15,16.
Çok sayıda beyin dilimleme protokolleri sadece dilim kesme adımı sırasında soğuk sıcaklıklar kullanarak içerir, bazen Na+ iyon değiştirme stratejisi ile birlikte16,17. Genç hayvanlarda, beyinler kafa kesme den sonra hızlı bir şekilde ayıklanabilir çünkü kafatası hala ince ve kaldırmak kolay olduğu için yeterli nörokoruma sunmak için görünür3. Ancak, bu strateji yetişkin hayvanlardan sağlıklı dilimler üretmez. Zamanla, yetişkin kemirgenler inceleyen laboratuvarların bir dizi hayvanın vücut ısısını azaltmak için buz gibi bir çözelti ile transkardiyal perfüzyon tanıttı, ve bu nedenle beyne hipoksik hasar, önce decapitation. Bu işlem başarıyla serebellar dilimleri üretmek için uygulandı18, orta beyin dilimleri19, neokortikal dilimler11,20, perirhinal korteks21, sıçan hipokampus10,22,23, koku ampul24, ventral striatum25, görme korteks26.
Sıçan ve farelerde bazı beyin bölgelerinde dilimleri hazırlanmasında transkardiyal perfüzyon ve Na+ iyon replasmanı tarafından sunulan avantajlara rağmen, fare hipokampus hipoksi korumak için en zorlu alanlardan biri olmaya devam etmektedir13,20. Bugüne kadar, nörodejenerasyon yaşlanma fareler ve fare modelleri hipokampus dilimleme için en yaygın yaklaşımlardan biri izole hipokampi klasik hızlı dilimleme içerir27. Burada açıklanan protokolde, hayvana çapraz olarak buz gibi Na+- serbest NMDG tabanlı yapay beyin-omurilik sıvısı (NMDG-aCSF) ile transkardi olarak nüfuz ederek beyin kesiti uygulayarak yetişkin beyindeki ATP kaybını en aza indiriyoruz. Dilimler daha sonra buz gibi Na+-free NMDG-aCSF olarak kesilir. Bu gelişmiş protokol ile dilimleme den sonra 10 saate kadar sağlıklı ve uzun süreli alan kayıtları ve yama-kıskaç çalışmaları için uygun olan yetişkin ve yaşlanan farelerden akut hipokampal dilimler elde ediyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülür ve Stanford Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanır. Yöntemler aynı zamanda Nörobilim Araştırmalarında Hayvan ve İnsanların Kullanımına Ilişkin Nörobilim Derneği'nin politikalarına da uygun olarak kullanılmaktadır.
NOT: Tüm fareler patojensiz bir ortamda muhafaza edildi. Karışık C57Bl/ 6 x SV/ 129J genetik arka plan üzerinde yabani tip fareler, aksi belirtilmedikçe burada kullanılmıştır.
1. Kurulum
- Hazırlamak 1 L 1x aCSF (mM): 125 NaCl, 26 NaHCO3, 2.3 KCl, 1.26 KH2PO4, 1.3 Mg2SO4·7H2O, 2.5 CaCl2, 25 glikoz(Tablo 1). Kurtarma odası ve sonraki kayıtlar için bu çözümü kullanın.
NOT: ACSF'yi NaCl, NaHCO3,KCl ve KH2PO4içeren 10 x stok çözümü olarak saklayın. Mg2SO4·7H2O ve CaCl2'yi 1 M stok çözeltisi olarak saklayın. Yukarıdaki stok çözeltilerinden deney gününde çalışma çözümlerini hazırlayın ve son hacmi 18 MΩ su yla ayarlamadan önce glikoz ekleyin.
NOT: Beyin bölgesi ne de fare zorlanmabağlı olarak, soğutulmuş aCSF de başarı ile transkardiyal perfüzyon için kullanılabilir11,15,26. - Hazırlamak 300 mL NMDG-aCSF (mM): 135 NMDG, 1 KCl, 1.2 KH2PO4, 1.5 MgCl2, 0.5 CaCl2, 20 kolin bikarbonat, 10 glikoz(Tablo 1). NMDG-aCSF'nin bu hacmi hem transkardiyal perfüzyon hem de kesme adımları için yeterlidir.
NOT: NMDG-aCSF'yi 4 °C'de 3x stok çözeltisi olarak saklayın. Deney gününde çalışma çözümü hazırlayın; 18 MΩ su ile son hacmi ayarlamadan önce kolin bikarbonat ve glikoz ekleyin. Tampon lamak için çözeltiyi %95 O2/5%2 ile kabarcıklayın ve oksijenle doygunlayın.2
NOT: NMDG stoku yüksek alkali olarak başlar ve pH'ı ~7.4'e ayarlamak için konsantre hidroklorik asit (HCl) gerektirir. Hidroklorik asit ilavesi pH 8'in altında bir kez yavaş olmalıdır, çünkü çözeltiyi aşırı HCl ile ~pH 3'e asitlemek kolaydır. Bu ayarlama, yaygın katyonlar eklemeden önce yapılmalıdır. Bu NMDG-aCSF tarifi sodyum içermez. Daha önce yayınlanan NMDG tarifleri tamponlama için 30 mM NaHCO3 kullanın, hangi NMDG-aCSF13,mevcut 30 mM sodyum mevcut,20. - Titreşen mikrotom kesme tepsisini ve montaj diskini -20 °C'ye ayarlayın.
- Kurtarma odasını hazırlayın.
- Geri kazanım odasını dilim tutan kafesin hemen üstüne doldurun, oda sıcaklığında tezgahta tutun ve kabarcık.
NOT: Burada kullanılan dilim geri kazanım odası edwards ve Konnerth3tarafından daha önce açıklanan klasik odaları çok benzer. aCSF, alta yapıştırılmış siyah naylon örgülü yuvarlak akrilik çerçeve tutan cam bir kabın (400 mL) içinde tutulur. Akrilik çerçeve kabın kenarına istirahat bir akrilik kanca ile kabın ortasında askıya alınır. Cam kabarcıkçı dibe kadar yerleştirilir. Tasarım dilimlerin her iki tarafında oksijenleme sağlar. Köpürme de kurtarma odasında aCSF sürekli karıştırma sağlar. Siyah örgü, beyaz olmayan dilimlere karşı yüksek kontrast sağlar ve bu da daha sonra daha kolay görebilirsiniz.
- Geri kazanım odasını dilim tutan kafesin hemen üstüne doldurun, oda sıcaklığında tezgahta tutun ve kabarcık.
- Transkardiyal perfüzyon ve kesme çözeltisini hazırlayın.
- Buz kristalleri yüzey ve şişe duvarları oluşmaya başlayana kadar, bir dondurucuda NMDG-aCSF tüm 300 mL chill. Aşırı donma YAPMAYIN!
- Buz ve kabarcık üzerine soğutulmuş NMDG-aCSF ile şişe yerleştirin. Çözelti 0\u20122 °C arasında olmalıdır.
NOT: Slushy NMDG- aCSF çözeltinin çoğunun sıvı olarak sahip olduğunu ima ederken, çamurlu buz mevcut küçük bir kısmı perfüzyon ve kesim boyunca çözeltiyi 0 °C'ye yakın tutar. Kesme sırasında beyindeki buz kristallerini uzak tutmaya özen yapılmalıdır.
- Doku montaj diskini hazırlayın.
- Diski dondurucudan çıkar, gerekirse kurutun.
- Daha önce hazırlanmış agar plaka% 5 agar bir blok kesip ve siyanoakrilat tutkal ince bir tabaka kullanarak diskin merkezinde tutkal. Agar parçası fare beyni büyüklüğünde olmalı. Buz üzerine yapıştırılmış agar ile disk yerleştirin ve kullanıma hazır olana kadar kağıt havlu ile kaplayın.
- %5 agar plaka için, 18 MΩ suyun 100 mL'lik 5 g'ını mikro dalgaile eritin ve temiz bir petri kabına dökün. 4 °C'de tutun.
- Kesme tepsisini dondurucudan çıkarın, mikrotome yerleştirin, buzla çevreleyin ve bıçağı yükleyin.
2. Transkardiyal perfüzyon ve beyin çekimi
- Anestezik kokteyl intraperitoneal enjeksiyon yoluyla aşırı doz fareler. Ağrı refleksini kontrol ederek anestezi derinliğini kontrol edin (ayak ucutu); bir fare derin anestezi ulaştığında refleks sergilememelidir.
NOT: Kemirgen anestezi kokteyli tarifi: Ketamin HCl (66 mg/mL), ksilazin HCl (6.6 mg/mL), asetpromazin maleat (0.1 mg/mL), 18 MΩ su son hacmi. Doz: 0.4 mg /g vücut ağırlığı, 0.04 mg/g vücut ağırlığı, ketamin için 6 x 10-4 mg/g vücut ağırlığı, ksilazin, ve asetpromazin, sırasıyla. - Transkardiyal perfüzyon için peristaltik pompayı ayarlayın. Buzlu NMDG-aCSF ile şişeiçine pompa boru bir tarafı yerleştirin. Tüpün diğer tarafına sol ventriküle yerverilecek 27 G iğne ile takın.
- Pompa hızını yaklaşık 3,5 mL/dk olarak ayarlayın. Bu hızda, NMDG-aCSF çıkışı hızlı bir damla değil, sürekli akış.
NOT: Yerçekimi ile perfüzyon peristaltik pompa perfüzyonu için iyi bir yedek, sürece aynı yaklaşık akış hızı elde edilebilir. Yüksek akış hızında bir perfüzyon beyinde patlama kan damarları neden olacaktır. Aşırı hızlı perfüzyon ve kan damarlarında artan basınç bir telltale işareti hayvanın burun gelen çözümdür. - Perfüzyon
- Düzgün bir şekilde anestezi edilmiş fareyi sırtına bir bez üzerine yerleştirin. Kağıt bant kullanarak, göğüs ve karın maruz böylece ön ve arka bacaklar aşağı bant.
- Göğüs üstüne deri büyük bir yama kesip, boğaz ait sternum altından gidiyor; bu geniş bir çalışma alanı sağlamalıdır. Göğüs kafesini forsepsle alın, hafifçe kaldırın ve göğüs boşluğu açığa çıkana kadar her iki taraftaki göğüs kafesini kesmeye başlayın.
- Göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için diyaframı kesin. Göğüs kafesinin kapağı ince bir kas parçası ile bağlı bırakılmalıdır. Bu maruz göğüs boşluğuna geri düşmeden bir tarafa ayarlamak mümkün olmalıdır. Kalbin hala atıyor mu kontrol et. Karaciğerin çoğunun görünür olduğundan emin olun.
- 27 G iğneyi sol ventriküle takın; farenin sol ventrikül sağ dan daha açık renk görünüyor. Koyu kırmızı renkli sağ atriyum bulun. Küçük makas ile sağ atriyum ile kesin; Kan akmaya başlamalı.
- Doğru akış hızına önceden ayarlanmış pompayı çalıştırın. Her şey doğru yapıldıysa, karaciğer perfüzyon başladıktan kısa bir süre sonra kırmızıdan kahverengiye renk değiştirmeye başlamalıdır. Perfüzyon uzunluğunu belirlemek için karaciğer rengini izleyin; karaciğer soluk kahverengi ye dönüşmelidir.
- Pompayı birkaç dakika daha çalıştırın. Rektal termometre kullanıyorsanız vücut ısısı 28\u201229 °C'ye düşmeli ve hayvanın burnu dokunmak için soğuk olmalıdır.
- Beyin çekimi.
NOT: Bu adım için aşağıdaki diseksiyon araçları hazır: decapitation makas, düz veya açılı bıçak, neşter ve #10 bıçak, tek kenar bıçak, #3 forseps, bir tarafı 90 ° bükülmüş spatula ile küçük bir makas, bir spatula, bir "60 ° " aracı(Şekil 1A,B), ve küçük bir yumuşak fırça.- Farenin kafasını büyük decapitation makasla decapitate. #10 bıçak ile bir neşter kullanarak, kafatası nın üstündeki deri açık kesti. Küçük açılı makas ile, orta hatta kafatası kesti. Daha sonra, #3 forceps kullanarak, kafatasının sağ ve sol yarısı uzak gözetlemek, onunla dura götürmek için dikkatli olmak. Beyin şimdi açığa çıktı.
NOT: Dura kafatasından ayrılırsa, beynin üzerinde kalır ve ayrı olarak çıkarılması gerekir. Kalan dura kenarları sıkın ve beyin yoluyla derin dilim, potansiyel ilgi beyin bölgesizarar. - Küçük bir spatula ile dışarı kepçe tarafından beyin çıkarın. NMDG-aCSF çözeltisi içine buz üzerinde ayrı bir küçük kabın yerleştirilen içine beyin bırakın. Bir dakika kadar orada bırakın.
NOT: Hipotermiye ek olarak, hatta kesmek için gerekli olan beyin, kadar buz gibi tuzlu firmalara maruz kalma. Beyin çekimine kadar tüm prosedür 30 s altında olmalıdır.
- Farenin kafasını büyük decapitation makasla decapitate. #10 bıçak ile bir neşter kullanarak, kafatası nın üstündeki deri açık kesti. Küçük açılı makas ile, orta hatta kafatası kesti. Daha sonra, #3 forceps kullanarak, kafatasının sağ ve sol yarısı uzak gözetlemek, onunla dura götürmek için dikkatli olmak. Beyin şimdi açığa çıktı.
3. Dilimleme
- Beyni NMDG-aCSF'den çıkar ve bir filtre kağıdına yerleştirin.
- Orta hatta ortalanmış bir "60°" aleti kullanarak ön beynin rostral ucundan 60° bir kama kesin ve çıkarın. Kesme yüzeyleri aşağıda anlatıldığı gibi transversal hipokampal dilimler için uygun açıyı elde etmek için montaj için kullanılacaktır (Şekil 1A,B).
NOT: Ev yapımı bir tutucu aracılığıyla bir arada tutulan iki tek kenarlı bıçak, 60° kesim yapmak için kullanımı kolay bir araç tır (Şekil 1A). - Neşterle orta hattan ayrı yarıküreler.
- Aşağıdaki gibi montaj diski üzerine hemisfer tutkal. Şu ana kadar buz üzerinde olan montaj diskini alın. Gerekirse tekrar kurutun. Tutkal agar blok önünde her yarımkürede, yan aşağı kesti.
- Her yarımkürenin ventral tarafının agar bloğuna dokunduğundan emin olun. Agar blok kesme sırasında ek destek sağlar ve hatta dilimler için gereklidir. Her yarımkürenin dorsal kenarları bıçak karşı karşıya olmalıdır. Kesilen tarafa yapıştırıldığında, her yarımküre bıçakla göreceli olarak, dorsal hipokampusun enine dilimlerini yerinde olacak şekilde yönlendirilir (Şekil 1B).
- Diski yarımkürelerle birlikte buz gibi karbogenated NMDG-aCSF içeren bir kesme odasına batırın.
- 400 μm'lik kesitler kesin. Kesme en az 10 dakika içinde yapılmalıdır. Farklı mikrotomlar bu süreyi elde etmek için farklı ayarlar gerektirir. Dorsal hipokampus bölgesinden toplam 8\u201210 dilim elde edilecektir.
4. Kurtarma
- Kesme uçlu tek kullanımlık transfer pipetleri kullanarak oda sıcaklığında karbogenated aCSF içeren bir kurtarma odasına dilimaktarma(Şekil 1C).
NOT: 5 mM Na-askorbat ve 3 mM Na-pirüvat ile geri kazanım odası-aSCF'yi fortife etmek tavsiye edilir. Pyruvate bir enerji substrat dilimleri ATP üretimini artırmak için gösterilen28, Na-askorbat ise serbest radikal quencher29. - Kayıt öncesi oda sıcaklığında (22\u201224 °C) yaklaşık 2 saat kuluçka (en fazla 4 saat).
NOT: Oda sıcaklığında daha uzun bir kuluçka, 37 °C'de standart kuluçkaya göre 30 dk ve ardından oda sıcaklığında kuluçka daha uzun süre daha sağlıklı dilimler sağlar. 37 °C'de Yeniden ısınma sitotoksik ödem13'eneden olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CamKIIa-Cre+'dan hipokampus dilimleri oluşturmak için yukarıdaki protokolü uyguladık; WT fareler karışık genetik arka plan C57Bl / 6 x SV / 129J, P > 120. Ca1 alanında çok sayıda piramidal hücre(Şekil 2A)ve subikülum(Şekil 2B)bir dilim hazırlama sağlıklı hücrelerin bir özelliği olan kızılötesi diferansiyel kontrast mikroskopisi (IR-DIC) altında gözlendiğinde düşük kontrast görünür. Bu hazırlık la birlikte yüksek oranda giga-ohm mühürler (>90%) yüzeyin yaklaşık 20\u201250 mikron altında en sağlıklı hücreleri hedef alırken rutin olarak elde edilir. Bu başarı oranı için, bu derinlikte piramidal hücrelerin yeterli görselleştirmeelde etmek için 60x su daldırma hedefi gibi IR-DIC için yüksek bir NA hedefi kullanmak önemlidir(Şekil 2A,B).
Tek nöronlardan patch-kelepçe kayıtları yaş altı ay boyunca farelerde bile bu hipokampal dilim hazırlık kullanılarak kolayca ulaşılabilir. Şekil 2C, CA1 nöronlarından minyatür uyarıcı postsinaptik akımlar (mEPSCs) kayıtları kullanılarak yapılan örnek bir deneyi göstermektedir. NMDA-LTD kimyasalının 3 dk için 20 μM NMDA banyo uygulaması ile indüksiyonu, 60 dk nm sonrası tedavi değerlendirildiğinde CA1 hücrelerinde mEPSC frekansını düşürür. Bu bulgu, NMDA-LTD'nin eski farelerde CA1'de sinapsların aktiviteye bağlı budama neden olduğunu göstermektedir (sonuçlar Djurisic ve ark.15'tenuyarlanmıştır). mEPSC genliğinde değişiklik saptamadı. mEPSC kayıtları sırasında CA1 hücreleri de biyositin ile dolduruldu. Şekil 2D, biyositin dolu CA1 piramidal nöronların sağlam bir dendritik arbor ve sağlıklı hücre habitusortaya koymaktadır. Hücre boyunca floresan boya sağlam bir dağılımı farklı deneysel koşullar altında dendritik omurga özelliklerirutin değerlendirilmesi için izin verir.
Alan kayıtları kullanılarak, ca3-CA1 sinapslarının ~%170'inin yetişkin farelerden gelen dilimler halinde uzun süreli potansiyasyonu (LTP) kolayca gözlemlendi ve LTP için gerekli sinyal basamaklarının sürdürülmesi önerildi (Şekil 2E,F). Sağlam bir alan uyarıcı postsinaptik potansiyel (fEPSP) sinyali için gereken ağ bağlantısı da korunur(Şekil 2E). Yetişkin veya yaşlanan farelerden hipokampal dilimlerde sinaptik plastisiteyi değerlendirme yeteneği, özellikle hastalığın damgasını vuran sinaptik disfonksiyon olarak nörodejeneratif hastalıkların fare modelleri için önemlidir.
Birlikte, bizim sonuçlar yetişkin ve yaşlanan fareler bir akut hipokampal hazırlık transkardiyal perfüzyon ve buz gibi NMDG tabanlı çözümler hipoksik hasarı en aza indirmek için kullanıldığı sürece, rutin olarak hem tek hücre ve hücre popülasyonu düzeyinde sinaptik fonksiyonun değerlendirilmesi sağlar göstermektedir.
Şekil 1: Yetişkin ve yaşlanan farelerden transversal hipokampal dilimlerin kesilmesi ve geri kazanımı. (A) Beynin rostral ucundan 60 ° kama kaldırmak için kullanılan bir "60 °" aracı, orta hat üzerinde ortalanmış. (B) Hemisferlerin transversal dilimlerin kesilmesi için konumlandırılması. 60° kesimin bir çizimi sol ve sağ üst panellerinde gösterilir; sağ alt panelde gösterilen şekilde tutkal ile yüzeyüzerinde iki yarımkürenin konumlandırma bıçak göre dorsal hipokampus dik bir yönelim sağlar. Bu oryantasyon hipokampus transversal dilimler ile sonuçlanır. Sarı yapılar kemirgen beyin içinde hipokampi bir 3D render vardır (gri). Bu illüstrasyon SynapseWeb30uyarlanmıştır. Tüm görünümleri beynin sırt tarafı vardır. (C) Bir kurtarma odasında 4 aylık bir fareden kesilen transversal hipokampal dilimler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: P120\u20\u2012180'deki farelerden gelen hipokampal dilimlerde yama-kelepçe ve sinaptik plastisite ölçümleri. (A) CA1 bölgesinin bir örnek IR-DIC mikrografı. (B) Örnek IR-DIC subikülum mikrografları. Hem A hem de B'de görüntüler 60x su daldırma hedefiyle kesimden sonra 3 saat alınır. Kalibrasyon çubuğu 10 μm. (C) P120\u2012180 farelerden CA1 nöronlarında kimyasal NMDA-LTD'nin mEPSC'ler üzerindeki etkisi. Üst panel, temel olarak ve NMDA-LTD darbesi sonrasında kaydedilen mEPSC'lerin örnek izleridir. Sol alt panel: NMDA-LTD düşük mEPSC frekansı ile sonuçlandı. Sağ alt panel: NMDA-LTD tespit edilmedikten sonra mEPSC genlik değişimi. N = 17 hücre taban çizgisinde ve n = 15 hücre NMDA-LTD için, 6 fare. P = 0.004, t-testi. Bu rakam Djurisic ve ark.15'tendeğiştirilmiştir. (D) Biyositin dolgulu CA1 piramidal hücre örneği. (E) Schaffer kollateral stimülasyon sonrası CA1 stratum radyatumdan fEPSP sinyali örneği. Gri iz temel kayıt sırasında elde edilir ve tetanik stimülasyondan 20 dk sonra siyah iz gözlenir. Her iz ortalama 30 ardışık izdir. (F) 100 Hz indüksiyon 4 trenler sonra CA3-CA1 sinapsuzun uzun vadeli potentiation kümülatif ortalama; n = Yaklaşık P90'da 8 WT fareden 23 dilim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) | ||||
| Malzemeler | Mw | Son conc. (mM) | g/2 Litre (10X) | g/Litre (1X) |
| Nacl | 58.44 | 125 | 146.1 | - |
| NaHCO3 | 84.01 | 26 | 43.68 | - |
| Kartal | 74.55 | 2.3 | 3.43 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.26 | 3.44 | - |
| Mg2SO4*7H2O | 203.3 | 1.3 | - | 1M stok 1.3 ml |
| CaCl2*2H2O | 147.02 | 2.5 | - | 1M stok 2,5 ml |
| Glikoz*H2O | 180.2 | 25 | - | 4,5 g |
| a) 1M stoklarından Mg2SO4*7H2O ve CaCl2*2H2O ekleyin | ||||
| b) aCSF 10X @RT tutmak | ||||
| c) 24 saat için aCSF 1X @4°C | ||||
| NMDG-aCSF | ||||
| Malzemeler | Mw | Son conc. (mM) | g/2 Litre (3X) | g/300 ml (1X) |
| NMDG | 195.22 | 135 | 158.13 | - |
| pH=7.4 HCl ile | ||||
| Kartal | 74.55 | 1 | 0.4473 | - |
| KH2PO4 | 136.1 | 1.2 | 0.9799 | - |
| MgCl2*6H2O | 203.3 | 1.5 | 1.8297 | - |
| CaCl2*2H2O | 147.02 | 0.5 | 0.4411 | - |
| Kolin Bikarbonat | 80% | 20 | - | 1238 μl |
| Glikoz*H2O | 180.2 | 10 | - | 0.54 |
| a) 3X stok çözeltisi 4°C'de filtreleme ve depolama | ||||
Tablo 1: Ortam formülasyonları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol, yetişkin ve yaşlanan farelerden elde edilen hipokampal dilimlerin kesimden sonra saatlerce sağlıklı ve canlı kalabildiğini göstermektedir. Bu protokol kullanılarak hazırlanan dilimler, yama kelepçesi kayıtlarının yanı sıra CA1 bölgelerindeuzun ömürlü alan kayıtları için uygundur.
Bu protokolde iki kritik adım vardır. İlk adım buz gibi bir çözelti ile transkardiyal perfüzyon adımıdır. Kan hızlı açıklık karaciğer renginin hızlı bir değişiklik ile sinyal. Çıkarılan beyin beyaz renkte olmalı. Beyin pembe kalırsa, bu sistemik kan soğuk NMDG-aCSF ile değiştirilmedi anlamına gelir, ve vücut ısısında düşüş elde edilmedi. Bu, iğnenin kalbe yanlış yerleştirilmesinden ya da kalbin delinmiş olması nedeniyle olabilir. Kötü perfüzyon farelerin beyinleri dilimleme için kullanılmamalıdır. İkinci kritik adım sodyum iyon yerine NMDG kullanımıdır. Başarıyla sıçan beyinlerinde Na+ yerine sakaroz kullanan protokolün iyi bilinen bir öncekivaryasyonu 10,31 farelerde yeterince sağlıklı hipokampal dilimler üretmez (ayrıca Ting ve ark.13bakınız). Sodyum iyon yerine NMDG kullanımı fare hipokampal dilimleri için çok önemlidir.
Sağlıklı hipokampal dilimler güvenilir açıklanan protokol kullanılarak elde edilirken, yetişkin ve yaşlanan hayvanların hipokampal hazırlık zor kalır. Onun zorluk da farklı fare çizgileri ve genetik arka planlar ile değişir. Göz önünde bulundurulması gereken potansiyel değişiklikler NMDG-aCSF ve kurtarma-aCSF çözümleri taurin, D-serine veya N-asetilsistein (NAC) gibi katkı maddeleri vardır, bu nöronal ve sinaptik fonksiyon artırabilir13,29, oksijenasyon artırmak29. Perfüzyon ve kesim sırasında Cl- iyonlarının ikamesi de düşünülmelidir32. Bir arayüz kurtarma odası kullanımı özellikle uzun vadeli plastisite alan kayıtları için ilgili artan oksijenasyon, korumak için başka bir yoludur. Açıklanan geri kazanım odası(Şekil 1C)bu amaç için değiştirilebilir (örneğin, aşağıdan aSCF tarafından nemlendirilmiş bir kültür ekleme kabı, batık kafesin yerini alabilir). Çelik bıçakların safir veya seramik bıçaklarla değiştirilmesi, hipokampus çevresindeki beyaz maddenin ağır miyelininin şiddetlendirdiği doku sıkıştırmalarını azaltabilir; bu da daha fazla dilim yüzeyine yakın nöronların kalitesini artırabilir. Dikey titreşimi en aza indirmek için tasarlanmış mikrotomların kullanılması (örneğin, Leica VT1200S'de sıfır-z), değiştirilebilir bir adımdır.
Diğer beyin bölgeleri burada açıklanan protokol kullanılarak kesilebilir, kesme açılarında uygun değişikliklerle. Buna ek olarak, dilim hazırlama sıkılığı ayarlanabilir, farklı beyin bölgeleri farklı derecelerde hipoksi duyarlı olduğu gibi ... Bir NMDG-aSCF kullanan bir protokol yetişkin fare neokorteks ve striatum dilim preparatları için bildirilmiştir13,20; 30 mM NaHCO3 içeren bir NMDG-aCSF kullanır (yani Na+-free değildir)20, ve bazı durumlarda transkardiyal perfüzyon oda sıcaklığında NMDG-aCSF ile13. Ancak, hipokampus gibi hipoksiduyarlı bir bölge için, Na+-free NMDG-aCSF ve buz gibi transkardiyal perfüzyon kullanarak kritik bir fark yaratabilir.
Bu protokol nörodejeneratif hastalıkları modelleyen çok çeşitli transgenik fare hatları için geçerlidir. Ayrıca, protokol diğer memeli model türlerin in beyin dilimleri için de değiştirilebilir. Birlikte, bu protokol yaşlanan hayvanlardan akut hipokampal dilimler için standart bir hazırlık için bir temel olarak hizmet verebilir, ve böylece hastalık mekanizmaları bağlamında çalışmalar arasında karşılaştırmalar kolaylaştırmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarın açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Dr. Carla J. Shatz'a tavsiye ve destek için teşekkür ederim ve Dr. Barbara K. Brott ve Michelle K. Drews'a taslağı eleştirel olarak okudukları için teşekkür ederim. Çalışma NIH EY02858 ve Mathers Charitable Foundation tarafından CJS hibe desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
- Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain. Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus. Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).
- Free Mandel, P. H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals. Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).
- Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).
- Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats. Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).
- Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex. Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).
- Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).
- Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G. Patch-Clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. 1183, Springer. Ch. 14 221-242 (2014).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 1-10 (2015).
- Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids. Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).
- Djurisic, M., et al. PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).
- Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
- Blot, A., Barbour, B. Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau. Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).
- Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli. Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).
- Frick, A., Magee, J., Johnston, D. LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites. Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).
- Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell. PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).
- Brooks, J. M., O'Donnell, P. Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).
- Goel, A., Lee, H. K. Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex. Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).
- Izumi, Y., Zorumski, C. F. Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices. Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).
- Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
- Fiala, J. C., Spacek, J. Hippocampus Rat. , Available from: https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat (1999).
- Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons. Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
