Описан способ создания органоидов с использованием полученных от пациента ксенотрансплантатов (PDX) для скрининга in vitro, в результате чего получаются совпадают пары моделей in vivo /in vitro. Опухоли PDX собирали / перерабатывали на мелкие кусочки механически или ферментаматически, за которым следовал метод Клеверса для выращивания опухолевых органоидов, которые были проницаемы, криоконсервированы и охарактеризованы против оригинального PDX.
Полученные от пациента опухолевые ксенотрансплантаты (PDX) считаются наиболее прогностическими доклиническими моделями, которые, как полагают, в значительной степени основаны на раковых стволовых клетках (CSC) для обычной оценки лекарств от рака. Большая библиотека PDX отражает разнообразие популяций пациентов и, таким образом, позволяет проводить доклинические испытания на основе популяций («Фаза II-подобных клинических испытаний на мышах»); однако PDX имеют практические ограничения низкой пропускной способности, высоких затрат и длительности. Опухолевые органоиды, также производные от пациента моделями, управляемыми CSC, можно рассматривать как эквивалент PDX in vitro, преодолевая определенные ограничения PDX для работы с большими библиотеками органоидов или соединений. Это исследование описывает метод создания органоидов, полученных из PDX (PDXO), что приводит к парным моделям для фармакологических исследований in vitro и in vivo. Подкожно пересаженные опухоли PDX-CR2110 были собраны у опухоленосных мышей, когда опухоли достигали 200-800мм3,согласно утвержденной процедуре вскрытия, с последующим удалением соседних неопухолевых тканей и диссоциацией на мелкие фрагменты опухоли. Небольшие фрагменты опухоли промывали и пропускали через клеточный сетчатый фильтр 100 мкм для удаления обломков. Кластеры клеток собирали и суспендировали в растворе экстракта базальной мембраны (BME) и покрыли 6-скважинной пластиной в виде твердой капли с окружающей жидкой средой для роста в инкубаторе CO2. Рост органоидов контролировали два раза в неделю под световой микроскопией и регистрировали фотографированием с последующим изменением жидкой среды 2 или 3 раза в неделю. Выращенные органоиды были дополнительно проходимы (через 7 дней) в соотношении 1:2 путем разрушения встроенных органоидов BME с помощью механической сдвига, чему способствовало добавление трипсина и добавление 10 мкМ Y-27632. Органоиды были криоконсервированы в криотрубках для длительного хранения после высвобождения из BME путем центрифугирования, а также отобраны (например, ДНК, РНК и блок FFPE) для дальнейшей характеристики.
Рак — это совокупность разнообразных генетических и иммунологических нарушений. Успешная разработка эффективных методов лечения в значительной степени зависит от экспериментальных моделей, которые эффективно предсказывают клинические результаты. Большие библиотеки хорошо охарактеризованных ксенотрансплантатов, полученных от пациента (PDX), уже давно рассматриваются как трансляционная система in vivo выбора для тестирования химио- и / или таргетной терапии из-за их способности резюмировать характеристики опухоли пациента, гетерогенность и реакцию пациента на лекарства1,что позволяет клиническим испытаниям на мышах, подобным фазеII,улучшить клинический успех2,3. PDX обычно рассматриваются как заболевания раковых стволовых клеток, отличающиеся генетической стабильностью, в отличие от ксенотрансплантатов, полученных из клеточных линий2. За последние несколько десятилетий во всем мире были созданы большие коллекции PDX, которые сегодня становятся рабочей лошадкой разработки лекарств от рака. Несмотря на широкое использование и большую трансляционную ценность, эти модели животных по своей сути являются дорогостоящими, трудоемкими и малопроизводительными, поэтому недостаточны для крупномасштабного скрининга. PDX также нежелательны для иммуноонкологического тестирования (IO) из-за иммуноскомпрометированной природы4. Таким образом, нецелесообразно в полной мере использовать доступную большую библиотеку PDX.
Недавние открытия, впервые сделанные лабораторией Ганса Клеверса5,привели к созданию in vitro культур органоидов, полученных из взрослых стволовых клеток, в большинстве органов человека эпителиального происхождения5. Эти протоколы были дополнительно доработаны, чтобы обеспечить рост органоидов из предполагаемых CSC при карциномах человека различных показаний6,7. Эти органоиды, полученные от пациента (PPO), являются геномно-стабильными8,9 и, как было показано, высоко прогнозируют результаты клиническоголечения 10,11,12. Кроме того, природа PPO in vitro обеспечивает высокопроизводительный скрининг (HTS)13,тем самым потенциально предлагая преимущество перед моделями in vivo и используя большие библиотеки органоидов в качестве суррогата популяции пациентов. PPO готовы стать важной платформой для открытий и трансляции, преодолевая многие ограничения PDX, описанные выше.
Как PDO, так и PDX являются моделями, полученными от пациентов и управляемыми CSC, с возможностью оценки терапевтических средств в контексте либо персонализированного лечения, либо формата клинических испытаний. Существующие большие библиотеки PDX, такие как собственная коллекция >3000 PDXs14,15,16,17,поэтому подходят для быстрой генерации библиотек опухолевых органоидов (PDX-производных органоидов или PDXO), что приводит к сопоставлению библиотеки парных моделей PDX и PDXO. В настоящем отчете описана процедура создания и характеристики колоректального рака PDXO-CR2110 по отношению к его родительской модели PDX-CR211016.
Предварительные данные для PDX-/PDXO-CR2110 в этом отчете подтверждают биологическую эквивалентность между PDX и его производным, PDXO, в отношении геномики, гистопатологии и фармакологии, поскольку обе модели представляют формы заболевания, полученные из исходного CSC пациента. Обе модели являю?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Джоди Барбо, Федерику Паризи и Раджендру Кумари за критическое прочтение и редактирование рукописи. Авторы также хотели бы поблагодарить команду Crown Bioscience Oncology in vitro и in vivo за их большие технические усилия.
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |