Создание соответствующих пар моделей IN vivo/In vitro, полученных от пациента, органоидов PDX и PDX для исследований фармакологии рака
Summary
Описан способ создания органоидов с использованием полученных от пациента ксенотрансплантатов (PDX) для скрининга in vitro, в результате чего получаются совпадают пары моделей in vivo /in vitro. Опухоли PDX собирали / перерабатывали на мелкие кусочки механически или ферментаматически, за которым следовал метод Клеверса для выращивания опухолевых органоидов, которые были проницаемы, криоконсервированы и охарактеризованы против оригинального PDX.
Abstract
Полученные от пациента опухолевые ксенотрансплантаты (PDX) считаются наиболее прогностическими доклиническими моделями, которые, как полагают, в значительной степени основаны на раковых стволовых клетках (CSC) для обычной оценки лекарств от рака. Большая библиотека PDX отражает разнообразие популяций пациентов и, таким образом, позволяет проводить доклинические испытания на основе популяций («Фаза II-подобных клинических испытаний на мышах»); однако PDX имеют практические ограничения низкой пропускной способности, высоких затрат и длительности. Опухолевые органоиды, также производные от пациента моделями, управляемыми CSC, можно рассматривать как эквивалент PDX in vitro, преодолевая определенные ограничения PDX для работы с большими библиотеками органоидов или соединений. Это исследование описывает метод создания органоидов, полученных из PDX (PDXO), что приводит к парным моделям для фармакологических исследований in vitro и in vivo. Подкожно пересаженные опухоли PDX-CR2110 были собраны у опухоленосных мышей, когда опухоли достигали 200-800мм3,согласно утвержденной процедуре вскрытия, с последующим удалением соседних неопухолевых тканей и диссоциацией на мелкие фрагменты опухоли. Небольшие фрагменты опухоли промывали и пропускали через клеточный сетчатый фильтр 100 мкм для удаления обломков. Кластеры клеток собирали и суспендировали в растворе экстракта базальной мембраны (BME) и покрыли 6-скважинной пластиной в виде твердой капли с окружающей жидкой средой для роста в инкубаторе CO2. Рост органоидов контролировали два раза в неделю под световой микроскопией и регистрировали фотографированием с последующим изменением жидкой среды 2 или 3 раза в неделю. Выращенные органоиды были дополнительно проходимы (через 7 дней) в соотношении 1:2 путем разрушения встроенных органоидов BME с помощью механической сдвига, чему способствовало добавление трипсина и добавление 10 мкМ Y-27632. Органоиды были криоконсервированы в криотрубках для длительного хранения после высвобождения из BME путем центрифугирования, а также отобраны (например, ДНК, РНК и блок FFPE) для дальнейшей характеристики.
Introduction
Рак — это совокупность разнообразных генетических и иммунологических нарушений. Успешная разработка эффективных методов лечения в значительной степени зависит от экспериментальных моделей, которые эффективно предсказывают клинические результаты. Большие библиотеки хорошо охарактеризованных ксенотрансплантатов, полученных от пациента (PDX), уже давно рассматриваются как трансляционная система in vivo выбора для тестирования химио- и / или таргетной терапии из-за их способности резюмировать характеристики опухоли пациента, гетерогенность и реакцию пациента на лекарства1,что позволяет клиническим испытаниям на мышах, подобным фазеII,улучшить клинический успех2,3. PDX обычно рассматриваются как заболевания раковых стволовых клеток, отличающиеся генетической стабильностью, в отличие от ксенотрансплантатов, полученных из клеточных линий2. За последние несколько десятилетий во всем мире были созданы большие коллекции PDX, которые сегодня становятся рабочей лошадкой разработки лекарств от рака. Несмотря на широкое использование и большую трансляционную ценность, эти модели животных по своей сути являются дорогостоящими, трудоемкими и малопроизводительными, поэтому недостаточны для крупномасштабного скрининга. PDX также нежелательны для иммуноонкологического тестирования (IO) из-за иммуноскомпрометированной природы4. Таким образом, нецелесообразно в полной мере использовать доступную большую библиотеку PDX.
Недавние открытия, впервые сделанные лабораторией Ганса Клеверса5,привели к созданию in vitro культур органоидов, полученных из взрослых стволовых клеток, в большинстве органов человека эпителиального происхождения5. Эти протоколы были дополнительно доработаны, чтобы обеспечить рост органоидов из предполагаемых CSC при карциномах человека различных показаний6,7. Эти органоиды, полученные от пациента (PPO), являются геномно-стабильными8,9 и, как было показано, высоко прогнозируют результаты клиническоголечения 10,11,12. Кроме того, природа PPO in vitro обеспечивает высокопроизводительный скрининг (HTS)13,тем самым потенциально предлагая преимущество перед моделями in vivo и используя большие библиотеки органоидов в качестве суррогата популяции пациентов. PPO готовы стать важной платформой для открытий и трансляции, преодолевая многие ограничения PDX, описанные выше.
Как PDO, так и PDX являются моделями, полученными от пациентов и управляемыми CSC, с возможностью оценки терапевтических средств в контексте либо персонализированного лечения, либо формата клинических испытаний. Существующие большие библиотеки PDX, такие как собственная коллекция >3000 PDXs14,15,16,17,поэтому подходят для быстрой генерации библиотек опухолевых органоидов (PDX-производных органоидов или PDXO), что приводит к сопоставлению библиотеки парных моделей PDX и PDXO. В настоящем отчете описана процедура создания и характеристики колоректального рака PDXO-CR2110 по отношению к его родительской модели PDX-CR211016.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предварительные данные для PDX-/PDXO-CR2110 в этом отчете подтверждают биологическую эквивалентность между PDX и его производным, PDXO, в отношении геномики, гистопатологии и фармакологии, поскольку обе модели представляют формы заболевания, полученные из исходного CSC пациента. Обе модели являю?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Джоди Барбо, Федерику Паризи и Раджендру Кумари за критическое прочтение и редактирование рукописи. Авторы также хотели бы поблагодарить команду Crown Bioscience Oncology in vitro и in vivo за их большие технические усилия.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
| Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
| Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Yang, M., et al. Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients. International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in Cancer Researchearch. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Muthuswamy, S. K. Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities. Cell Stem Cell. 22 (3), 290-291 (2018).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Yang, J. P., et al. A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation. Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).
- Zhang, L., et al. A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy. Scientific Reports. 3, 2992 (2013).
- Chen, D., et al. A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations. Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).
- Guo, S., et al. Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines. Cancer Research. 76 (16), 4619-4626 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Corcoran, R. B., et al. Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. , (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
