为癌症药理学研究创建匹配的体内/体外患者衍生模型对 PDX 和 PDX 衍生器官
Summary
描述使用患者衍生的异种格拉夫特 （PDX） 进行体外筛查的方法，从而形成匹配的体内/体外模型对。PDX 肿瘤被机械或酶地收获/加工成小块，然后是 Clevers 的生长肿瘤器官的方法，这些器官是通过、冷冻保存和针对原始 PDX 进行特征的。
Abstract
患者衍生的肿瘤异种移植（PDXs）被认为是最具预测性的前科模型，主要被认为是由癌症干细胞（CSC）驱动的常规癌症药物评估。一个大型的PDX库反映了患者群体的多样性，从而能够进行基于人群的临床前试验（”第二阶段类似小鼠的临床试验”）：但是，PDX 具有吞吐量低、成本高、持续时间长的实际局限性。肿瘤器官，也是患者衍生的CSC驱动模型，可以被认为是PDX的体外等价物，克服了某些PDX限制，用于处理大型器官库或化合物库。这项研究描述了一种创建PDX衍生器官（PDXO）的方法，从而产生了体外和体内药理学研究的配对模型。皮下移植的PDX-CR2110肿瘤是从肿瘤携带小鼠身上采集的，当肿瘤达到200-800毫米3时，按照批准的尸检程序，然后切除相邻的非肿瘤组织，分离成小肿瘤片段。小肿瘤碎片被洗净，并通过一个100μm细胞过滤器去除碎片。细胞簇被收集并悬挂在地下室膜提取物 （BME） 溶液中，并镀在 6 井板中，作为与周围液体介质一起生长的固体液滴，用于 CO2 孵化器的生长。在光显微镜下每周监测两次器官生长，并记录摄影，然后每周进行2次或3次液体介质变化。通过机械剪切破坏BME嵌入器官，辅之以添加滴虫素和添加10μM Y-27632，进一步通过（7天后）1：2的比例。器官在离心从BME释放后，在低温管中冷冻保存，用于长期储存，并取样（如DNA、RNA和FFPE块）以作进一步鉴定。
Introduction
癌症是各种遗传和免疫学疾病的集合。有效治疗的成功开发高度依赖于有效预测临床结果的实验模型。长期以来，大型患者衍生异种移植（PDX）库一直被视为体外系统的转化系统，以测试化疗和/或靶向疗法，因为他们能够重新概括患者肿瘤特征、异质性和患者药物反应1，从而使II期样小鼠临床试验能够提高临床成功率。PDX通常被认为是癌症干细胞疾病，具有遗传稳定性，与细胞系衍生的异种移植2形成鲜明对比。在过去的几十年里，世界各地都建立了大量的PDX系列，成为当今癌症药物开发的主力军。这些动物模型虽然应用广泛，转化价值巨大，但内在成本高、耗时、吞吐量低，因此不足以进行大规模筛选。PDX也不适合免疫肿瘤学（IO）测试，由于免疫损害的性质4。因此，充分利用现有的大型 PDX 库是不切实际的。
最近由汉斯·克莱弗斯实验室5号开创的发现，在大多数上皮起源5的人类器官中，建立了由成人干细胞产生的器官体外培养。这些协议已经进一步完善，使有机体从假定的CSC在人类癌的各种迹象6，7的增长。这些患者衍生的器官（PDOs）是基因稳定的8，9，并已被证明是高度预测临床治疗结果10，11，12。此外，PDOs 的体外性质使高通量筛查 （HTS）13能够实现，从而有可能提供比体内模型更优越的优势，并利用大型器官库作为患者群体的代名词。PDOs 有望成为重要的发现和转化平台，克服上述 PDX 的许多局限性。
PDO 和 PDX 都是患者衍生和 CSC 驱动的模型，能够在个性化治疗或临床试验格式的背景下评估治疗。现有的大型PDX库，如专有收藏的>3000 PDXs 14，15，16，17，因此适合肿瘤器官库（PDX衍生器官，或PDXO），从而形成了一个匹配的配对PDX和PDXO模型库。本报告描述了创建和描述结肠直肠癌PDXO-CR2110与其父母PDX-CR2110模型16相关的程序。
Protocol
Representative Results
Discussion
本报告中PDX-/PDXO-CR2110的初步数据支持PDX与其衍生物PDXO在基因组学、组织病理学和药理学方面的生物学等价性，因为这两种模型都代表了从患者原始CSC衍生的疾病形式。这两种模型都是患者衍生的疾病模型，可能预测患者10、11、12、21的临床反应。匹配的体外模型和体内模型可以相辅相成，在体内进行…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢乔迪·巴博博士、费德里卡·帕里西博士和拉金德拉·库马里博士对手稿的批判性阅读和编辑。作者还要感谢皇家生物科学肿瘤学体外和体内团队的巨大技术努力。
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
| Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
| Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Yang, M., et al. Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients. International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in Cancer Researchearch. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Muthuswamy, S. K. Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities. Cell Stem Cell. 22 (3), 290-291 (2018).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Yang, J. P., et al. A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation. Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).
- Zhang, L., et al. A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy. Scientific Reports. 3, 2992 (2013).
- Chen, D., et al. A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations. Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).
- Guo, S., et al. Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines. Cancer Research. 76 (16), 4619-4626 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Corcoran, R. B., et al. Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. , (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
