Creación de pares de modelos in vivo/in vitro derivados de pacientes de PDX y organoides derivados de PDX para la investigación farmacológica del cáncer
Summary
Un método se describe para crear organoids usando los xenografts paciente-derivados (PDX) para la investigación in vitro, dando por resultado pares hechos juego de modelos in vivo/ines vitro. Los tumores de PDX fueron cosechados/procesados en pedazos pequeños mecánicamente o enzimático, seguidos por el Clevers’ método para crecer los organoids del tumor que fueron pasados, cryopreserved y caracterizados contra el PDX original.
Abstract
Los xenoinjertos de tumores derivados de pacientes (PDXs) se consideran los modelos preclínicos más predictivos, en gran parte se cree que son impulsados por células madre cancerosas (CSC) para la evaluación convencional de medicamentos contra el cáncer. Una gran biblioteca de PDXs refleja la diversidad de las poblaciones de pacientes y, por lo tanto, permite ensayos preclínicos basados en la población (“Ensayos clínicos con ratones tipo Fase II”); sin embargo, PDX tiene limitaciones prácticas de bajo rendimiento, altos costos y larga duración. Los organoides tumorales, también siendo modelos impulsados por CSC derivados por pacientes, pueden considerarse como el equivalente in vitro de PDX, superando ciertas limitaciones de PDX para tratar con grandes bibliotecas de organoides o compuestos. Este estudio describe un método para crear los organoids PDX-derivados (PDXO), así dando por resultado los modelos apareados para la investigación in vitro e in vivo de la farmacología. los tumores Subcutáneo-trasplantados PDX-CR2110 fueron recogidos de ratones del tumor-cojinete cuando los tumores alcanzaron 200-800 milímetros3,por un procedimiento aprobado de la autopsia, seguido por el retiro de los tejidos adyacentes del no-tumor y la disociación en pequeños fragmentos del tumor. Los pequeños fragmentos de tumor se lavaron y pasaron a través de un colador celular de 100 μm para eliminar los desechos. Los racimos celulares fueron recogidos y suspendidos en la solución del extracto de la membrana del sótano (BME) y plateados en una placa de 6 pozos como gotita sólida con los medios líquidos circundantes para el crecimiento en una incubadora del CO2. El crecimiento organoide fue supervisado dos veces semanalmente bajo microscopia ligera y registrado por la fotografía, seguida por el cambio medio líquido 2 o 3 veces por semana. Los organoides crecidos fueron pasados más a fondo (7 días más adelante) en un ratio 1:2 interrumpiendo los organoids encajados BME usando el esquileo mecánico, ayudado por la adición de tripsina y la adición de 10 μM Y-27632. Los organoides fueron criopreservados en crio-tubos para almacenamiento a largo plazo, después de la liberación de BME por centrifugación, y también muestreados (por ejemplo, ADN, ARN y bloque FFPE) para su posterior caracterización.
Introduction
Los cánceres son una colección de diversos trastornos genéticos e inmunológicos. El desarrollo exitoso de tratamientos efectivos depende en gran medida de los modelos experimentales que predicen eficazmente los resultados clínicos. Las bibliotecas grandes de xenoinjertos paciente-derivados bien-caracterizados (PDX) se han visto durante mucho tiempo como el sistema in vivo traslacional de la opción para probar chemo- y/o terapias apuntadas debido a su capacidad de recapitular características del tumor paciente, heterogeneidad y respuesta de la droga paciente1,así permitiendo que la fase II-como los ensayos clínicos del ratón mejore éxito clínico2,3. Los PDX se consideran generalmente como enfermedades de células madre cancerosas, con estabilidad genética, en contraste con los xenoinjertos derivados de la línea celular2. En las últimas décadas, se han creado grandes colecciones de PDXs en todo el mundo, convirtiéndose en el caballo de batalla del desarrollo de medicamentos contra el cáncer en la actualidad. Aunque son ampliamente utilizados y con un gran valor de traslación, estos modelos animales son intrínsecamente costosos, consumen mucho tiempo y bajo rendimiento, por lo tanto, inadecuados para el cribado a gran escala. Los PDX también son indeseables para las pruebas de inmunooncología (IO) debido a una naturaleza inmunocomprocomprotege4. Por lo tanto, no es práctico aprovechar al máximo la gran biblioteca disponible de PDXs.
Descubrimientos recientes, iniciados por el laboratorio5de Hans Clevers, han llevado al establecimiento de cultivos in vitro de organoides generados a partir de células madre adultas en la mayoría de los órganos humanos de origen epitelial5. Estos protocolos se han perfeccionado aún más para permitir el crecimiento de organoides a partir de supuestos CSCs en carcinomas humanos de diversas indicaciones6,7. Estos organoides derivados de pacientes (DOP) son genómicamente estables8,9 y se ha demostrado que son altamente predictivos de los resultados del tratamiento clínico10,11,12. Además, la naturaleza in vitro de las DOP permite el cribado de alto rendimiento (HTS)13,lo que potencialmente ofrece una ventaja sobre los modelos in vivo y aprovecha las grandes bibliotecas organoides como sustituto de la población de pacientes. Las DOP están preparadas para convertirse en una importante plataforma de descubrimiento y traslación, superando las muchas limitaciones de las PDX descritas anteriormente.
Tanto la DOP como la PDX son modelos derivados de pacientes e impulsados por CSC, con la capacidad de evaluar la terapéutica en el contexto de un tratamiento personalizado o un formato de ensayo clínico. Las grandes bibliotecas existentes de PDXs, como la colección patentada de >3000 PDXs14,15,16,17,son por lo tanto adecuadas para la rápida generación de bibliotecas de organoides tumorales (organoides derivados de PDX, o PDXO), lo que resulta en una biblioteca emparejada de modelos pdx y pdxo emparejados. Este informe describe el procedimiento para crear y para caracterizar el cáncer colorrectal PDXO-CR2110 en lo referente a su modeloparental 16de PDX-CR2110.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los datos preliminares para PDX-/PDXO-CR2110 en este informe apoyan la equivalencia biológica entre PDX y su derivado, PDXO, con respecto a la genómica, la histopatología y la farmacología, puesto que ambos modelos representan las formas de la enfermedad derivadas del CSC original del paciente. Ambos modelos son modelos de enfermedad derivados del paciente, potencialmente predictivos de la respuesta clínica de los pacientes10,11,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a la Dra. Jody Barbeau, Federica Parisi y Rajendra Kumari por la lectura crítica y la edición del manuscrito. Los autores también quieren agradecer al equipo de Oncología in vitro e in vivo de Crown Bioscience por sus grandes esfuerzos técnicos.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
| Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
| Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |
References
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