خلق مطابقة في الجسم الحي / في المختبر المريض المستمدة من أزواج نموذج PDX وPDX المستمدة Organoids لأبحاث الصيدلة السرطان
Summary
يتم وصف طريقة لإنشاء organoids باستخدام xenografts المشتقة من المريض (PDX) للفحص في المختبر ، مما أدى إلى أزواج متطابقة من نماذج في الجسم الحي / في المختبر. تم حصاد أورام PDX / معالجتها إلى قطع صغيرة ميكانيكيا أو أنزيميا ، تليها طريقة Clevers لزراعة الأعضاء السرطانية التي تم تمريرها والتبريد وتميزها ضد PDX الأصلي.
Abstract
تعتبر xenografts الورم المشتقة من المريض (PDXs) النماذج قبل السريرية الأكثر تنبؤا، ويعتقد إلى حد كبير أن تكون مدفوعة بالخلايا الجذعية السرطانية (CSC) لتقييم أدوية السرطان التقليدية. مكتبة كبيرة من PDXs يعكس تنوع مجموعات المرضى، وبالتالي تمكن التجارب قبل السريرية القائمة على السكان (“المرحلة الثانية مثل التجارب السريرية الماوس”); ومع ذلك، فإن PDX لديها قيود عملية على الإنتاجية المنخفضة، والتكاليف المرتفعة والمدة الطويلة. يمكن اعتبار الأورام العضوية ، التي هي أيضا نماذج مشتقة من المريض مدفوعة ب CSC ، مكافئا في المختبر ل PDX ، متغلبة على بعض قيود PDX للتعامل مع المكتبات الكبيرة من الأعضاء العضوية أو المركبات. تصف هذه الدراسة طريقة لإنشاء الأجهزة العضوية المشتقة من PDX (PDXO) ، مما يؤدي إلى نماذج مقترنة لأبحاث الصيدلة في المختبر وفي الجسم الحي. تم جمع الأورام المزروعة تحت الجلد PDX-CR2110 من الفئران الحاملة للورم عندما وصلت الأورام إلى 200-800 مم3، وفقا لإجراء تشريح معتمد ، يليه إزالة الأنسجة غير السرطانية المجاورة والتفكك إلى شظايا ورم صغيرة. تم غسل شظايا الورم الصغيرة ومرت عبر مصفاة خلايا 100 ميكرومتر لإزالة الحطام. تم جمع مجموعات الخلايا وتعليقها في محلول مستخلص غشاء الطابق السفلي (BME) ومطلية في لوحة من 6 آبار كقطرات صلبة مع الوسائط السائلة المحيطة للنمو فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون. تم رصد نمو الجهاز مرتين أسبوعيا تحت المجهر الخفيف وسجلت عن طريق التصوير الفوتوغرافي، تليها تغيير متوسط السائل 2 أو 3 مرات في الأسبوع. تم تمرير الأعضاء المزروعة كذلك (7 أيام في وقت لاحق) بنسبة 1:2 عن طريق تعطيل الأجهزة العضوية المضمنة BME باستخدام القص الميكانيكي ، بمساعدة إضافة التريبسين وإضافة 10 ميكرومتر Y-27632. وكانت الأرغنويدات تقدم في أنابيب التبريد للتخزين الطويل الأجل، بعد إطلاقها من BME عن طريق الطرد المركزي، كما تم أخذ عينات منها (مثل الحمض النووي والحمض النووي الريبي وكتلة FFPE) لمزيد من التوصيف.
Introduction
السرطانات هي مجموعة من الاضطرابات الوراثية والمناعية المتنوعة. يعتمد التطوير الناجح للعلاجات الفعالة بشكل كبير على النماذج التجريبية التي تتنبأ بفعالية بالنتائج السريرية. مكتبات كبيرة من xenografts المريض المستمدة من سمات جيدة (PDX) منذ فترة طويلة ينظر إليها على أنها ترجمة في النظام الحي للاختيار لاختبار العلاج الكيميائي و / أو العلاجات المستهدفة بسبب قدرتها على تلخيص خصائص ورم المريض، وعدم التجانس والاستجابة للأدوية المريض1،وبالتالي تمكين المرحلة الثانية مثل التجارب السريرية الماوس لتحسين النجاح السريري2،3. تعتبر PDXs عموما كأمراض الخلايا الجذعية السرطانية، ويضم الاستقرار الوراثي، على النقيض من خط الخلية المستمدة xenografts2. على مدى العقود القليلة الماضية ، تم إنشاء مجموعات كبيرة من PDXs في جميع أنحاء العالم ، لتصبح العمود الفقري لتطوير أدوية السرطان اليوم. وعلى الرغم من استخدامها على نطاق واسع وقيمتها النقلية الكبيرة، فإن هذه النماذج الحيوانية مكلفة في جوهرها، وتستغرق وقتا طويلا، وتستغرق إنتاجية منخفضة، وبالتالي فهي غير كافية للفحص على نطاق واسع. PDX هي أيضا غير مرغوب فيها لاختبار الأورام المناعية (IO) بسبب طبيعة المناعة للخطر4. وبالتالي فمن غير العملي الاستفادة الكاملة من المكتبة الكبيرة المتوفرة من PDXs.
وقد أدت الاكتشافات الأخيرة، رائدة من قبل مختبر هانز ذكيز5،إلى إنشاء الثقافات في المختبر من organoids ولدت من الخلايا الجذعية الكبار في معظم الأعضاء البشرية من أصلظهاري 5. وقد تم تنقيح هذه البروتوكولات للسماح لنمو organoids من CSCs المفترضة في سرطان الإنسان من مؤشرات مختلفة6،7. هذه الأجهزة المشتقة من المريض (PDOs) هي مستقرة جينيا8،9 وقد ثبت أنها تنبؤية للغاية لنتائج العلاج السريري10،11،12. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الطبيعة المختبرية ل PDOs تمكن من الفحص عالي الإنتاجية (HTS)13، وبالتالي من المحتمل أن تقدم ميزة في نماذج الجسم الحي والاستفادة من المكتبات العضوية الكبيرة كبديل للسكان المرضى. تستعد PDOs لتصبح منصة اكتشاف وترجمة مهمة ، والتغلب على العديد من القيود المفروضة على PDXs المذكورة أعلاه.
كل من PDO و PDX هي نماذج مشتقة من المريض وCSC مدفوعة ، مع القدرة على تقييم العلاجات في سياق العلاج الشخصي أو شكل التجربة السريرية. المكتبات الكبيرة الموجودة من PDXs ، مثل مجموعة الملكية من >3000 PDXs14،15،16،17، وبالتالي فهي مناسبة لتوليد سريع من المكتبات من organoids الورم (PDX المستمدة من الأجهزة العضوية ، أو PDXO) ، مما أدى إلى مكتبة مطابقة من نماذج PDX و PDXO المقترنة. يصف هذا التقرير الإجراء لإنشاء وتوصيف سرطان القولون والمستقيم PDXO-CR2110 فيما يتعلق بنموذجه الأبوي PDX-CR211016.
Protocol
Representative Results
Discussion
تدعم البيانات الأولية ل PDX-/PDXO-CR2110 في هذا التقرير التكافؤ البيولوجي بين PDX ومشتقه ، PDXO ، فيما يتعلق بعلم الجينوم وعلم الأنسجة وعلم الأدوية ، لأن كلا النموذجين يمثلان أشكال المرض المستمدة من CSC الأصلي للمريض. كلا النموذجين هي نماذج المرض المشتقة من المريض، ويحتمل أن تكون تنبؤية للاستجابة الس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتور جودي باربو وفيديريكا باريزي وراجندرا كوماري على القراءة النقدية للمخطوطة وتحريرها. كما يود المؤلفون أن يشكروا فريق كراون للأورام في مجال العلوم البيولوجية في المختبر وفي الجسم الحي على جهودهم التقنية الكبيرة.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
| Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
| Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Yang, M., et al. Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients. International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in Cancer Researchearch. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Muthuswamy, S. K. Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities. Cell Stem Cell. 22 (3), 290-291 (2018).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Yang, J. P., et al. A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation. Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).
- Zhang, L., et al. A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy. Scientific Reports. 3, 2992 (2013).
- Chen, D., et al. A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations. Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).
- Guo, S., et al. Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines. Cancer Research. 76 (16), 4619-4626 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Corcoran, R. B., et al. Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. , (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
