Summary

Oprettelse matchede In vivo / In vitro Patient-Afledte Model Par af PDX og PDX-afledte organoider til Cancer Farmakologi Research

Published: May 05, 2021
doi:

Summary

En metode beskrives for at skabe organoider ved hjælp af patientafledte xenografts (PDX) til in vitro-screening, hvilket resulterer i matchede par in vivo/in vitro-modeller. PDX tumorer blev høstet / forarbejdet i små stykker mekanisk eller enzymatisk, efterfulgt af Clevers ‘metode til at dyrke tumor organoider, der blev passeret, cryopreserved og karakteriseret mod den oprindelige PDX.

Abstract

Patient-afledt tumor xenografts (PDXs) betragtes som de mest prædiktive prækliniske modeller, stort set menes at være drevet af kræft stamceller (CSC) for konventionelle kræft stof evaluering. Et stort bibliotek af PDX’er afspejler patientpopulationernes mangfoldighed og muliggør således befolkningsbaserede prækliniske forsøg (“Fase II-lignende kliniske museforsøg”).); PDX har dog praktiske begrænsninger af lav overførselshastighed, høje omkostninger og lang varighed. Tumororganoider, der også er patient-afledte CSC-drevne modeller, kan betragtes som in vitro-ækvivalenten af PDX, der overvinder visse PDX-begrænsninger for håndtering af store biblioteker af organoider eller forbindelser. Denne undersøgelse beskriver en metode til at skabe PDX-afledte organoider (PDXO), hvilket resulterer i parrede modeller til in vitro og in vivo farmakologiforskning. Subkutant transplanterede PDX-CR2110 tumorer blev indsamlet fra tumorbærende mus, da tumorerne nåede 200-800 mm3, pr. En godkendt obduktionsprocedure, efterfulgt af fjernelse af de tilstødende ikke-tumorvæv og dissociation i små tumorfragmenter. De små tumorfragmenter blev vasket og passeret gennem en 100 μm celle si for at fjerne snavset. Celleklynger blev indsamlet og ophængt i BME-opløsning (Basement Membrane Extract) og belagt i en 6-brøndsplade som en solid dråbe med omgivende flydende medier til vækst i en CO 2-inkubator. Organoid vækst blev overvåget to gange om ugen under lys mikroskopi og registreres af fotografering, efterfulgt af flydende medium forandring 2 eller 3 gange om ugen. De dyrkede organoider blev yderligere passeret (7 dage senere) ved et 1:2-forhold ved at forstyrre BME-indlejrede organoider ved hjælp af mekanisk klipning, hjulpet ved tilsætning af trypsin og tilsætning af 10 μM Y-27632. Organoider blev kryopræserveret i kryorør til langtidsopbevaring, efter frigivelse fra BME ved centrifugering, og også udtaget (f.eks. DNA, RNA og FFPE-blok) til yderligere karakterisering.

Introduction

Kræft er en samling af forskellige genetiske og immunologiske lidelser. Vellykket udvikling af effektive behandlinger er meget afhængig af eksperimentelle modeller, der effektivt forudsiger kliniske resultater. Store biblioteker af velkarakteriseret patient-afledte xenografts (PDX) har længe været betragtet som translationelle in vivo system valg til at teste kemo-og / eller målrettede behandlinger på grund af deres evne til at opsummere patientens tumor egenskaber, heterogenitet og patient lægemiddelrespons1, hvilket gør det muligt fase II-lignende mus kliniske forsøg for at forbedre klinisk succes2,3. PDX’er betragtes generelt som kræftstamcellesygdomme med genetisk stabilitet i modsætning til cellelinje afledt xenografts2. I løbet af de sidste par årtier, store samlinger af PDX’er er blevet skabt i hele verden, bliver arbejdshest af kræft lægemiddeludvikling i dag. Selv om disse dyremodeller er meget udbredte og med stor translationel værdi, er de i sig selv dyre, tidskrævende og lave gennemløb, hvilket er utilstrækkeligt til storstilet screening. PDX er også uønskede for immuno-onkologi (IO) test på grund af en immun-kompromitteret karakter4. Det er derfor upraktisk at drage fuld fordel af det tilgængelige store bibliotek af PDX’er.

Nylige opdagelser, banebrydende af Hans Clevers ‘laboratorium5, har ført til etablering af in vitro kulturer af organoider genereret fra voksne stamceller i de fleste menneskelige organer af epiteloprindelse5. Disse protokoller er blevet yderligere forfinet for at muliggøre vækst af organoider fra formodede CSC’er i humane carcinomer af forskellige indikationer6,7. Disse patient-afledte organoider (BOB) er genomisk stabile8,9 og har vist sig at være meget forudsigende for kliniske behandlingsresultater10,11,12. Derudover muliggør in vitro-karakteren af BOB’er højoverførselsscreening (HTS)13, hvilket potentielt giver en fordel i forhold til in vivo-modeller og udnytter store organoidbiblioteker som surrogat for patientpopulationen. PDA’er er klar til at blive en vigtig opdagelses- og oversættelsesplatform, der overvinder de mange begrænsninger af PDX’er, der er beskrevet ovenfor.

Både BOB og PDX er patient-afledte og CSC-drevne modeller, med evnen til at evaluere terapeutiske i forbindelse med enten personlig behandling eller klinisk forsøg format. Eksisterende store biblioteker af PDX’er, som den proprietære samling af >3000 PDXs14,15,16,17, er derfor velegnede til den hurtige generering af biblioteker af tumororganoider (PDX-afledte organoider eller PDXO), hvilket resulterer i et matchet bibliotek med parrede PDX- og PDXO-modeller. Denne rapport beskriver proceduren for at skabe og karakterisere kolorektal cancer PDXO-CR2110 i forhold til sin forældre PDX-CR2110 model16.

Protocol

Alle protokoller og ændringer eller procedurer vedrørende pasning og anvendelse af dyr blev gennemgået og godkendt af Crown Bioscience Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), inden undersøgelserne blev gennemført. Pasning og anvendelse af dyr blev udført i overensstemmelse med AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) Internationale retningslinjer som rapporteret i Vejledning for Pasning og brug af forsøgsdyr, National Research Council (2011). Alle dyreforsøg var…

Representative Results

Morfologi af PDCO’er, typisk for organoider under let mikroskopi, og i overensstemmelse med forældrenes PDX pr H &E farvningUnder lysmikroskopi demonstrerer PDXO-CR2110 typisk cystisk morfologi (Figur 1A), som beskrevet tidligere for patient-afledte organoider (BOB), dokumentation til støtte for ligheden mellem PDXO og BOB under de samme kulturforhold. Histopatologiske undersøgelser foretaget af H&E farvning viser, at vævsstrukturer og cel…

Discussion

De foreløbige data for PDX-/PDXO-CR2110 i denne rapport understøtter den biologiske ækvivalens mellem PDX og dets afledte, PDXO, med hensyn til genomik, histopatologi og farmakologi, da begge modeller repræsenterer sygdomsformerne fra den oprindelige CSC af patienten. Begge modeller er patient-afledte sygdomsmodeller, potentielt forudsigende for den kliniske respons hos patienter10,11,12,21

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne takke Dr. Jody Barbeau, Federica Parisi og Rajendra Kumari for kritisk læsning og redigering af manuskriptet. Forfatterne vil også gerne takke Crown Bioscience Oncology in vitro og in vivo team for deres store tekniske indsats.

Materials

Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634028 Base medium
DMEM Hyclone SH30243.01 Washing medium
Collagenese type II Invitrogen 17101015 Digest tumor
Matrigel Corning 356231 Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced)
N-Ac Sigma A9165 Organoid culture medium
A83-01 Tocris 2939 Organoid culture medium
B27 Life Technologies 17504044 Organoid culture medium
EGF Peprotech AF-100-15 Organoid culture medium
Noggin Peprotech 120-10C Organoid culture medium
Nicotinamide Sigma N0636 Organoid culture medium
SB202190 Sigma S7076 Organoid culture medium
Gastrin Sigma G9145 Organoid culture medium
Rspondin Peprotech 120-38-1000 Organoid culture medium
L-glutamine Life Technologies 35050038 Organoid culture medium
Hepes Life Technologies 15630056 Organoid culture medium
penicillin-streptomycin Life Technologies 15140122 Organoid culture medium
Y-27632 Abmole M1817 Organoid culture medium
Dispase Life Technologies 17105041 Screening assay
CellTiter-Glo 3D Promega G9683 Screening assay (luminescent ATP indicator)
Multidrop dispenser Thermo Fisher Multidrop combi Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition
Digital dispener Tecan D300e Compound addition
Envision Plate reader Perkin Elmer 2104 Luminescence reading
Balb/c nude mice Beijing HFK Bio-Technology Co
RNAeasy Mini kit Qiagen 74104 tRNA purification kit
DNAeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506 DNA purification kit
Histogel Thermo Fisher HG-4000-012 Organoid embedding

References

  1. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
  2. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
  3. Yang, M., et al. Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients. International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).
  4. Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
  5. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  6. Drost, J., Clevers, H. Organoids in Cancer Researchearch. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  7. Muthuswamy, S. K. Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities. Cell Stem Cell. 22 (3), 290-291 (2018).
  8. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  9. Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13308-13311 (2015).
  10. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  11. Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  12. Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
  13. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  14. Yang, J. P., et al. A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation. Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).
  15. Zhang, L., et al. A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy. Scientific Reports. 3, 2992 (2013).
  16. Chen, D., et al. A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations. Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).
  17. Guo, S., et al. Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines. Cancer Research. 76 (16), 4619-4626 (2016).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  19. Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).
  20. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
  21. Corcoran, R. B., et al. Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. , (2015).
  22. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).

Play Video

Cite This Article
Xu, X., Shang, L., Wang, P., Zhou, J., Ouyang, X., Zheng, M., Mao, B., Zhang, L., Chen, B., Wang, J., Chen, J., Qian, W., Guo, S., Huang, Y., Li, Q. Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research. J. Vis. Exp. (171), e61382, doi:10.3791/61382 (2021).

View Video