Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Oprettelse matchede In vivo / In vitro Patient-Afledte Model Par af PDX og PDX-afledte organoider til Cancer Farmakologi Research

doi: 10.3791/61382 Published: May 5, 2021

Summary

En metode beskrives for at skabe organoider ved hjælp af patientafledte xenografts (PDX) til in vitro-screening, hvilket resulterer i matchede par in vivo/in vitro-modeller. PDX tumorer blev høstet / forarbejdet i små stykker mekanisk eller enzymatisk, efterfulgt af Clevers 'metode til at dyrke tumor organoider, der blev passeret, cryopreserved og karakteriseret mod den oprindelige PDX.

Abstract

Patient-afledt tumor xenografts (PDXs) betragtes som de mest prædiktive prækliniske modeller, stort set menes at være drevet af kræft stamceller (CSC) for konventionelle kræft stof evaluering. Et stort bibliotek af PDX'er afspejler patientpopulationernes mangfoldighed og muliggør således befolkningsbaserede prækliniske forsøg ("Fase II-lignende kliniske museforsøg").); PDX har dog praktiske begrænsninger af lav overførselshastighed, høje omkostninger og lang varighed. Tumororganoider, der også er patient-afledte CSC-drevne modeller, kan betragtes som in vitro-ækvivalenten af PDX, der overvinder visse PDX-begrænsninger for håndtering af store biblioteker af organoider eller forbindelser. Denne undersøgelse beskriver en metode til at skabe PDX-afledte organoider (PDXO), hvilket resulterer i parrede modeller til in vitro og in vivo farmakologiforskning. Subkutant transplanterede PDX-CR2110 tumorer blev indsamlet fra tumorbærende mus, da tumorerne nåede 200-800 mm3, pr. En godkendt obduktionsprocedure, efterfulgt af fjernelse af de tilstødende ikke-tumorvæv og dissociation i små tumorfragmenter. De små tumorfragmenter blev vasket og passeret gennem en 100 μm celle si for at fjerne snavset. Celleklynger blev indsamlet og ophængt i BME-opløsning (Basement Membrane Extract) og belagt i en 6-brøndsplade som en solid dråbe med omgivende flydende medier til vækst i en CO 2-inkubator. Organoid vækst blev overvåget to gange om ugen under lys mikroskopi og registreres af fotografering, efterfulgt af flydende medium forandring 2 eller 3 gange om ugen. De dyrkede organoider blev yderligere passeret (7 dage senere) ved et 1:2-forhold ved at forstyrre BME-indlejrede organoider ved hjælp af mekanisk klipning, hjulpet ved tilsætning af trypsin og tilsætning af 10 μM Y-27632. Organoider blev kryopræserveret i kryorør til langtidsopbevaring, efter frigivelse fra BME ved centrifugering, og også udtaget (f.eks. DNA, RNA og FFPE-blok) til yderligere karakterisering.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kræft er en samling af forskellige genetiske og immunologiske lidelser. Vellykket udvikling af effektive behandlinger er meget afhængig af eksperimentelle modeller, der effektivt forudsiger kliniske resultater. Store biblioteker af velkarakteriseret patient-afledte xenografts (PDX) har længe været betragtet som translationelle in vivo system valg til at teste kemo-og / eller målrettede behandlinger på grund af deres evne til at opsummere patientens tumor egenskaber, heterogenitet og patient lægemiddelrespons1, hvilket gør det muligt fase II-lignende mus kliniske forsøg for at forbedre klinisk succes2,3. PDX'er betragtes generelt som kræftstamcellesygdomme med genetisk stabilitet i modsætning til cellelinje afledt xenografts2. I løbet af de sidste par årtier, store samlinger af PDX'er er blevet skabt i hele verden, bliver arbejdshest af kræft lægemiddeludvikling i dag. Selv om disse dyremodeller er meget udbredte og med stor translationel værdi, er de i sig selv dyre, tidskrævende og lave gennemløb, hvilket er utilstrækkeligt til storstilet screening. PDX er også uønskede for immuno-onkologi (IO) test på grund af en immun-kompromitteret karakter4. Det er derfor upraktisk at drage fuld fordel af det tilgængelige store bibliotek af PDX'er.

Nylige opdagelser, banebrydende af Hans Clevers 'laboratorium5, har ført til etablering af in vitro kulturer af organoider genereret fra voksne stamceller i de fleste menneskelige organer af epiteloprindelse5. Disse protokoller er blevet yderligere forfinet for at muliggøre vækst af organoider fra formodede CSC'er i humane carcinomer af forskellige indikationer6,7. Disse patient-afledte organoider (BOB) er genomisk stabile8,9 og har vist sig at være meget forudsigende for kliniske behandlingsresultater10,11,12. Derudover muliggør in vitro-karakteren af BOB'er højoverførselsscreening (HTS)13, hvilket potentielt giver en fordel i forhold til in vivo-modeller og udnytter store organoidbiblioteker som surrogat for patientpopulationen. PDA'er er klar til at blive en vigtig opdagelses- og oversættelsesplatform, der overvinder de mange begrænsninger af PDX'er, der er beskrevet ovenfor.

Både BOB og PDX er patient-afledte og CSC-drevne modeller, med evnen til at evaluere terapeutiske i forbindelse med enten personlig behandling eller klinisk forsøg format. Eksisterende store biblioteker af PDX'er, som den proprietære samling af >3000 PDXs14,15,16,17, er derfor velegnede til den hurtige generering af biblioteker af tumororganoider (PDX-afledte organoider eller PDXO), hvilket resulterer i et matchet bibliotek med parrede PDX- og PDXO-modeller. Denne rapport beskriver proceduren for at skabe og karakterisere kolorektal cancer PDXO-CR2110 i forhold til sin forældre PDX-CR2110 model16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle protokoller og ændringer eller procedurer vedrørende pasning og anvendelse af dyr blev gennemgået og godkendt af Crown Bioscience Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), inden undersøgelserne blev gennemført. Pasning og anvendelse af dyr blev udført i overensstemmelse med AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) Internationale retningslinjer som rapporteret i Vejledning for Pasning og brug af forsøgsdyr, National Research Council (2011). Alle dyreforsøg var under sterile forhold på SPF -faciliteter (specifikke patogenfrie) faciliteter og udført i nøje overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af forsøgsdyr fra forskellige offentlige institutioner (f.eks. Protokollerne blev godkendt af Komitéen for Etik i Dyreforsøg på facilitetsinstitutionen (f.eks. den institutionelle IACUC-komité).

1. Forberedelse til tumortransplantation

  1. Dyrehus
    1. House Balb/c nøgenmus (n=5) i individuelle ventilerede bure ved 20-26 °C, 30-70% fugtighed og en belysningscyklus på 12-timers lys/12-timers mørk, med majskolbestøelse ændret ugentligt, og bestråling steriliseret tør granulatføde plus sterilt drikkevand ad libitum.
  2. Donor tumor fragment forberedelse
    1. Nøje overvåge tumorbærende donormus for kropsvægt (BW, via vejebalance) og tumorvolumen (TV, ved calipermåling).
    2. Når TV når 800-1000 mm3, aflive de tumorbærende dyr i en biofaret hætte.
      1. Placer mus i et aktiv dødshjælpskammer med et låg, der leverer CO2-gas ind i kammeret. Udledning gas ind i kammeret med en strømningshastighed, der producerer hurtig bevidstløshed med minimal nød for dyret. Den optimale strømningshastighed for CO2 er omkring 2-2,5 Lpm.
      2. Sørg for aktiv dødshjælp ved at observere, at dyrene ikke genvinder bevidstheden.
      3. Efter tilsyneladende klinisk død skal du opretholde gasstrømmen i >1 min. for at minimere muligheden for, at et dyr kan komme sig.
    3. Steriliser huden omkring tumoren ved hjælp af iodophor podninger. Opsamle tumorer ved at fjerne tilstødende ikke-tumor væv og placere i en petriskål, der indeholder 20 mL PBS, forkølet (4 °C) før aktiv dødshjælp.
    4. Vask tumorer med PBS i en anden Petri parabol for at fjerne blodkomponenter efterfulgt af at skære i halve og fjerne eventuelle ekstra hud, blodkar, forkalkning og / eller nekrose.
    5. Placer kun intakte tumorstykker i et sterilt 50 mL centrifugerør med 20 mL PBS, før du transporterer til et separat dyrerum til transplantation.

2. Subkutan tumor vækst

  1. Subkutan podning af tumorstykke i immunkompromitterede mus
    1. Skær PDX tumor i 2 mm stykker med en skalpel, og læg hver i trocars for subkutane (SC) implantation.
    2. Bedøve modtagerdyrene med 5% isoflurane (vedligeholdes af en næsekegler ved 1%). Dyrene slapper af, mister deres retsrefleks og bliver til sidst immobile, indtil de ikke reagerer på smerte. Fix bedøvede mus på et eksperiment bord i højre lateral position og sterilisere med iodophor podninger, især de områder, der omgiver det sted, tumor podning.
    3. På venstre flanke hud bare kranie til hoften, lave en 0,5 cm snit med en skalpel og skabe en tunnel under huden mod forben, 2-3 cm, ved hjælp af stumpe pincet.
    4. Aseptisk overføre en terning af tumor fragment per podning site fra mediet og sted dybt inde i subkutane tunnel. Bekræft visuelt fragmentets placering inden lukning af sår med sårklemmer.
    5. Overvåg tumor implanterede mus (5), indtil de bliver bevidste om at opretholde sternal recumbence, og derefter returnere dem til deres bur først efter deres fulde helbredelse fra anæstesi.
  2. Tumorbærende mus sundhedsovervågning
    1. Tjek vand- og fødevareforbruget dagligt og optag kropsvægt ugentligt.
    2. Kontroller musene under rutinemæssig overvågning. Registrer eventuelle virkninger på mobilitet, vejrtrækning, pleje og generelle udseende, mad og vandforbrug, BW gevinst / tab, ascites, osv.
    3. Mål tv to gange om ugen ved hjælp af calipre og udtrykke i mm3 per: TV = 0,5 en × b2, hvor a og b er længden og bredden af tumoren, henholdsvis.
    4. Ofre dyr til at indsamle prøver, når en af følgende tegn vises: BW tab >20%; nedsat mobilitet (ikke i stand til at spise eller drikke) ude af stand til at bevæge sig normalt på grund af betydelige ascites eller forstørret mave; indsats i respiration; død.

3. Obduktion og tumorhøst

  1. Når tumorvolumen nåede 200-800 mm3, aflive mus pr. Godkendte protokoller (se trin 1.2.2).
  2. Indsamle tumor væv ved at fjerne tilstødende ikke-tumor væv, efterfulgt af at placere vævet i en 50 mL plastrør med AD + + + (på is) før dissociation.

4. Forberedelse til PDX-afledt organoidkultur

BEMÆRK: Alle de følgende trin blev udført inde i et biosikkerhedsskab pr. vævskultursstandardretningslinjer. Der opbevares forvarmede lagre på 96-, 24- og 6-brøndsplader i en 37 °C inkubator før brug.

  1. Præparater til reagenser
    1. Forbered kældermembranekstrakt (BME) opløsning (vækstfaktor reduceret, Phenol Rødfri). Hold 10 mL BME i et 4 °C køleskab natten over. Når den er optøet, hvirvles BME-flasken for at sikre spredning.
    2. Forbered basismedie/vaskebuffer AD+++. Der tilsættes 5 mL 200 mM L-glutamin, 1 M HEPES og Pen/Strep til avancerede DMEM/F12-medier ved pipettering med en 5 mL pipette.
    3. Forbered kolon organoid medium som beskrevet af Sato et al.18 gennem supplering af basismedier med N-Ac (1 mM), A83-01 (500 nM), B27 (1x), EGF (50 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Nicotinamid (10 mM), SD20219 0 (10 nM), R-spondin (500 ng/mL), L-glutamin (2 mM), HEPES (10 μM), penicillin-streptomycin (1x) og Y-27623 (10 μM)19.
    4. Forbered AD+++Digestion medium: 10 mL 1x organoidkulturmedier med 500 μL kollagen type II (20 mg/mL) og 10 μL RhoKI Y-27632 (10 mM).
  2. Tumor dissociation20
    1. Overfør tumoren i et 50 mL plastrør til en 10 cm petriskål. Tag et makroskopisk fotografi sammen med en lineal, og optag en beskrivelse af dets tilstand (dvs. størrelse, fedtvæv, vaskularisering, nekrose osv.).
    2. Fjern overskydende AD + + + ved aspiration, og skær tumorvævet i små stykker med en saks efterfulgt af overførsel af 1-2 stykker i et 2 mL mikrorør til snapfrysning på tøris. Opbevares ved -80 °C til genomisk profilering. Hakke de resterende stykker i finere stykker med en saks, før overførsel til en 50 mL plastrør ved hjælp af AD + + +.
    3. Hakket væv vaskes 2-3 gange med 35 mL AD+++, efterfulgt af tilsætning af 10 mL fordøjelsesmedium (se trin 4.1.4) og placering på en orbital shaker ved 4 x g for 1 time ved 37 °C.
    4. Det fordøjede væv homogeniseres ved at pipette op og ned ved hjælp af en steril 5 mL plastpipette efterfulgt af tilsætning af 20 mL AD+++ og filtrering med 100 μm cellestængel.
    5. Pass-through vaskes to gange med AD+++ (spin ved 450 x g i 5 min), efterfulgt af genopstandning i BME (tilsæt 4x volumen BME til pellet til suspension) og hold på is19.
  3. Forberedelse af organoidkultur
    1. BME-celleaffjedringen til 6-brøndspladen tilsættes i flere dråber til i alt 200 μL pr. brønd.
    2. Pladen overføres til en inkubator på 37 °C. Efter 30 minutter falder gelen størkne.
    3. Der tilsættes 2 mL organoide medier til hver brønd, idet de repræsentative dråber registreres ved mikroskopisk fotografering, inden de overføres til en inkubator (37 °C og 5% CO2).
    4. Vedligehold organoidkulturerne med medium forandring hver 3-4 dage, og passage ved et 1:2-forhold hver 7. dag eller afhængigt af deres vækst og tæthed.

5. Histopatologi og næste generations sekventering (NGS) analyse

  1. Histopatologi
    1. Saml organoider fra brønden med det eksisterende medium ved hjælp af en P1000 pipette, efterfulgt af centrifugering (spin på 450 x g i 5 min), vask med PBS og fiksering i 10% formalin i 1 time.
    2. De faste organoider anbringes i 100% gelatine i bunden af 50 ml konisk rør efterfulgt af rutinemæssig vævsbehandling og indlejring.
    3. Haematoxylin-eosin(H&E) farvning ved hjælp af standardprotokoller på 4 mm paraffinsektioner.
  2. RNAseq og hele exome sekventering
    1. Organoider indsamles fra brønden med det eksisterende dyrkningsmedium ved hjælp af en P1000-pipette efterfulgt af centrifugering ved hjælp af en mikrocentrifuge ved maksimal hastighed (12.000 x g)i 5 min ved 4 °C.
    2. Pelleten opsamles ved at fjerne det mellemstore supernatant for at sikre, at der ikke var nogen synlig BME, efterfulgt af snapfrysning i et mikrorør (tøris) og derefter overføres til en fryser på -80 °C.
    3. Ekstrakt RNA eller DNA ved hjælp af standardprocedure fra producenter og udfør NGS-analyse for både RNAseq og hele exome sekventering (WES).

6. IC50 assay20

  1. Organoid såning i 384-brønd plade til IC50 assay
    1. Dissociater organoider i BME falder fra hver brønd (fordøje BME) ved at tilsætte 20 μL 100x dispase opløsning til hver brønd (6-brønds plade), som indeholdt 2 ml organoid medium, efterfulgt af 10 minutters inkubation ved 37 °C.
    2. Pipette fordøjede organoider fra alle brønde gennem et 70 μm filter i et 50 mL plastrør for at indsamle organoiderne.
    3. Tæl organoiderne under mikroskopi til bestemmelse af organoidkoncentration. Ophæng organoiderne ved hjælp af dyrkningsmediet, før der tilsættes BME for at nå den endelige koncentration på 5% (v/v) på is.
    4. Der tilsættes 50 μL af organoidaffjedringen til hver 384-brønds plade med væskedispenseren ifølge pladekortet med en såfylde på 200 CR2110 BOB pr. brønd i tilsvarende organoidkulturmedium.
  2. Cisplatin og irinotecan behandling
    1. Der anvendes cisplatin (med den højeste koncentration på 100 μM) og "irinotecan" (med den højeste koncentration på 10 μM). Der tilsættes SN-38 (en metabolit af irinotecan i modsætning til irinotecan, som normalt anvendes til in vivo-undersøgelser) til hver brønd i henhold til lægemiddelfortyndingsordningen for 9 doser i seriel fortynding ved digital dispenerg.
    2. Opret pladekortet ved hjælp af softwareværktøjet til den digitale dispenser. Omfatter et negativt kontrolkøretøj med 100 % levedygtighed og postiv kontrol på 5 μM stjerneurosporin, som viste 0 % levedygtighed.
    3. Placer de narkotikabehandlede 384-brøndsplader tilbage i 37 °C inkubator.
  3. Bestemmelse af organoidcelles levedygtighed efter lægemiddelbehandling
    1. Ved afslutningen af de 5 dages lægemiddelbehandling bestemmes organoidcellens levedygtighed ved hjælp af selvlysende cellerenseabilitetsreagenser i henhold til producentens anbefalede procedure. Tilsæt selvlysende reagens i hver brønd med væskedisent og bland i 5 minutter på en plade shaker, efterfulgt af en 30 minutters inkubation ved stuetemperatur i mørke.
    2. Optag det selvlysende signal på en luminescens multi-well pladelæser.
    3. Den normaliserede viabilities af hver brønd ved hjælp af de rå aflæsninger fra pladelæseren og skabe en dosis-respons kurve og IC50 værdier ved ikke-lineær kurve montering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Morfologi af PDCO'er, typisk for organoider under let mikroskopi, og i overensstemmelse med forældrenes PDX pr H &E farvning
Under lysmikroskopi demonstrerer PDXO-CR2110 typisk cystisk morfologi (Figur 1A), som beskrevet tidligere for patient-afledte organoider (BOB), dokumentation til støtte for ligheden mellem PDXO og BOB under de samme kulturforhold.

Histopatologiske undersøgelser foretaget af H&E farvning viser, at vævsstrukturer og celletyper af PDXO-CR2110 (Figur 1B) afspejler den oprindelige PDX-CR2110 (Figur 1C), der understøtter, at PDX og PDXO blev udviklet af samme oprindelse: CR2110. Denne observation giver histopatologi beviser til støtte for ligheden mellem PDXO til sin forældre PDX.

Transskriberingsudtryk og hel exomesekvensering viser høj korrelation mellem PDXO-CR2110 og den forældre pdx-CR2110
PDX-CR2110 tumorer har tidligere været genomisk profileret ved hjælp af transcriptome sekventering (RNAseq, mRNA)16 og hele exome (WES, DNA) sekventeret. Vi har nu ligeledes profileret den tilsvarende PDXO-CR2110. De genomiske profilsammenligninger af det tilsvarende matchede PDX- og PDXO(Figur 2) viser en høj korrelation på 94,92% i transskriptionsudtryk (mRNA) (epigenetisk) og en høj overensstemmelse på 97,67% af DNA-mutationer (WES) (genetisk), hvilket tyder på en samlet genomisk lighed mellem dette par modeller.

Ligheder observeret for de farmakologiske egenskaber mellem in vitro PDXO-CR2110 og in vivo PDX-CR2110
Narkotikafølsomhedsanalyser blev udført på PDXO-CR2110 i 384-brøndsplader, med resultater vist i figur 3A. PDXO-CR2110 var følsom over for irinotecan og resistent over for cisplatin, i overensstemmelse med PDX-behandlingsresultaterne (figur 3B), hvor TGI (tumorvæksthæmning) ved dosisniveauer på 100 mg/kg, dvs. Denne observerede farmakologiske konsistens understøtter begge modellers potentielt biologiske ækvivalens og kan anvendes til supplerende farmakologiske undersøgelser in vitro og in vivo.

Figure 1
Figur 1: Morfologi af PDXO-CR2110. (A) Morfologi af under lys mikroskopi (cystisk type). (B,C) Histopatologi af pdxo-CR2110 og PDX-CR2110, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Genomiske profiler af PDXO-CR2110 vs. PDX-CR2110, WES og RNAseq. Øverste panel: global mRNA-udtrykskorrelation mellem PDX-CR2110 og PDXO-CR2110 pr. RNAseq. Nederste panel: tabel over både mRNA-udtrykskorrelationer pr. RNAseq og DNA-mutationskordans pr. WES: PDX- vs PDXO-CR2110. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Farmakologiske egenskaber ved både PDXO-CR2110 in vitro og SC PDX-CR2110 in vivo. (A) PDXO-CR2110 in vitro-dosisrespons på testforbindelserne. (B) Tumorvækst hæmning fremkaldt af de samme testforbindelser på CR2110 in vivo. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De foreløbige data for PDX-/PDXO-CR2110 i denne rapport understøtter den biologiske ækvivalens mellem PDX og dets afledte, PDXO, med hensyn til genomik, histopatologi og farmakologi, da begge modeller repræsenterer sygdomsformerne fra den oprindelige CSC af patienten. Begge modeller er patient-afledte sygdomsmodeller, potentielt forudsigende for den kliniske respons hos patienter10,11,12,21. De matchede par in vitro- og in vivo-modeller kan supplere hinanden til in vitro-screening og validering in vivo, hvilket forbedrer succesraten for lægemiddelforskning og potentielt reducerer nedslidningsraterne i klinisk udvikling. Det er værd at bemærke, at PDXO nu kan gøre det muligt for HTS at drage fordel af tilgængelige store patient-afledte organoid biblioteker, hvor PDXs mislykkes på grund af høje in vivo omkostninger og længere tidslinjer. Det er overflødigt at sige, en matchet PDX-PDXO bibliotek vil sandsynligvis blive den foretrukne platform til at støtte opdagelse af lægemidler og translationel forskning i den nærmeste fremtid.

Konvertering af det eksisterende bibliotek af kommenterede PDX-modeller kan være en hurtig og produktiv tilgang til opbygning af et praktisk organoidbibliotek ved at anvende en industriel proces. Denne rapport konverterede en PDX til PDXO for at undersøge muligheden for en sådan proces, og den anvendte metode kunne være et fundament til at understøtte storstilet proces til at opbygge et omfattende PDXO-bibliotek. Praktisk set ligner metoderne til at skabe PDXO generelt den bredt beskrevne metode til generering af BOB18, med undtagelse af kilden til, at patientvævet er mus.

Der er kritiske skridt til at sikre, at PDXOs er oprettet med succes: 1) den friske PDX tumorer er fragmenteret til små stykker; 2) de kulturforhold, der er beskrevet for organoidkultur som beskrevet af Clevers og kolleger, implementeres trofast18,22, men kan justeres for forskellige organoider; 3) forskellige organoider har forskellige vækstrater, der påvirker varigheden af organoidkultur og sundhed samt varigheden af narkotikabehandling; 4) en effektiv analyse til bestemmelse af musens indhold vs menneskeligt indhold er helt afgørende for at sikre, at kulturerne er stort set menneskelige organoid, da nogle kulturer uundgåeligt kan have vedvarende musevæv / celle forurening (i det tilfælde rapporteret her, er der minimal musevæv forurening, data ikke vist). Museforurening kan være en af de vigtige begrænsninger i skabelsen af PDXO biobanker, hvis der ikke anvendes effektive detektions- og fjernelsesmetoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere er de nuværende fuldtidsansatte hos Crown Bioscience, Inc.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Jody Barbeau, Federica Parisi og Rajendra Kumari for kritisk læsning og redigering af manuskriptet. Forfatterne vil også gerne takke Crown Bioscience Oncology in vitro og in vivo team for deres store tekniske indsats.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634028 Base medium
DMEM Hyclone SH30243.01 Washing medium
Collagenese type II Invitrogen 17101015 Digest tumor
Matrigel Corning 356231 Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced)
N-Ac Sigma A9165 Organoid culture medium
A83-01 Tocris 2939 Organoid culture medium
B27 Life Technologies 17504044 Organoid culture medium
EGF Peprotech AF-100-15 Organoid culture medium
Noggin Peprotech 120-10C Organoid culture medium
Nicotinamide Sigma N0636 Organoid culture medium
SB202190 Sigma S7076 Organoid culture medium
Gastrin Sigma G9145 Organoid culture medium
Rspondin Peprotech 120-38-1000 Organoid culture medium
L-glutamine Life Technologies 35050038 Organoid culture medium
Hepes Life Technologies 15630056 Organoid culture medium
penicillin-streptomycin Life Technologies 15140122 Organoid culture medium
Y-27632 Abmole M1817 Organoid culture medium
Dispase Life Technologies 17105041 Screening assay
CellTiter-Glo 3D Promega G9683 Screening assay (luminescent ATP indicator)
Multidrop dispenser Thermo Fisher Multidrop combi Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition
Digital dispener Tecan D300e Compound addition
Envision Plate reader Perkin Elmer 2104 Luminescence reading
Balb/c nude mice Beijing HFK Bio-Technology Co
RNAeasy Mini kit Qiagen 74104 tRNA purification kit
DNAeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506 DNA purification kit
Histogel Thermo Fisher HG-4000-012 Organoid embedding

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, (6), 338-350 (2012).
  2. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, (11), 1318-1325 (2015).
  3. Yang, M., et al. Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients. International Journal of Cancer. 132, (2), 74-84 (2013).
  4. Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
  5. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  6. Drost, J., Clevers, H. Organoids in Cancer Researchearch. Nature Reviews Cancer. 18, (7), 407-418 (2018).
  7. Muthuswamy, S. K. Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities. Cell Stem Cell. 22, (3), 290-291 (2018).
  8. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, (1-2), 373-386 (2018).
  9. Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (43), 13308-13311 (2015).
  10. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359, (6378), 920-926 (2018).
  11. Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26, (1), 17-26 (2020).
  12. Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25, (10), 1607-1614 (2019).
  13. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161, (4), 933-945 (2015).
  14. Yang, J. P., et al. A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation. Genomics. 88, (3), 282-292 (2006).
  15. Zhang, L., et al. A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy. Scientific Reports. 3, 2992 (2013).
  16. Chen, D., et al. A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations. Oncotarget. 6, (38), 40815-40821 (2015).
  17. Guo, S., et al. Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines. Cancer Research. 76, (16), 4619-4626 (2016).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, (5), 1762-1772 (2011).
  19. Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).
  20. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25, (5), 838-849 (2019).
  21. Corcoran, R. B., et al. Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. (2015).
  22. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160, (1-2), 299-312 (2015).
Oprettelse matchede In vivo / In vitro Patient-Afledte Model Par af PDX og PDX-afledte organoider til Cancer Farmakologi Research
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, X., Shang, L., Wang, P., Zhou, J., Ouyang, X., Zheng, M., Mao, B., Zhang, L., Chen, B., Wang, J., Chen, J., Qian, W., Guo, S., Huang, Y., Li, Q. X. Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research. J. Vis. Exp. (171), e61382, doi:10.3791/61382 (2021).More

Xu, X., Shang, L., Wang, P., Zhou, J., Ouyang, X., Zheng, M., Mao, B., Zhang, L., Chen, B., Wang, J., Chen, J., Qian, W., Guo, S., Huang, Y., Li, Q. X. Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research. J. Vis. Exp. (171), e61382, doi:10.3791/61382 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter