Oprettelse matchede In vivo / In vitro Patient-Afledte Model Par af PDX og PDX-afledte organoider til Cancer Farmakologi Research
Summary
En metode beskrives for at skabe organoider ved hjælp af patientafledte xenografts (PDX) til in vitro-screening, hvilket resulterer i matchede par in vivo/in vitro-modeller. PDX tumorer blev høstet / forarbejdet i små stykker mekanisk eller enzymatisk, efterfulgt af Clevers ‘metode til at dyrke tumor organoider, der blev passeret, cryopreserved og karakteriseret mod den oprindelige PDX.
Abstract
Patient-afledt tumor xenografts (PDXs) betragtes som de mest prædiktive prækliniske modeller, stort set menes at være drevet af kræft stamceller (CSC) for konventionelle kræft stof evaluering. Et stort bibliotek af PDX’er afspejler patientpopulationernes mangfoldighed og muliggør således befolkningsbaserede prækliniske forsøg (“Fase II-lignende kliniske museforsøg”).); PDX har dog praktiske begrænsninger af lav overførselshastighed, høje omkostninger og lang varighed. Tumororganoider, der også er patient-afledte CSC-drevne modeller, kan betragtes som in vitro-ækvivalenten af PDX, der overvinder visse PDX-begrænsninger for håndtering af store biblioteker af organoider eller forbindelser. Denne undersøgelse beskriver en metode til at skabe PDX-afledte organoider (PDXO), hvilket resulterer i parrede modeller til in vitro og in vivo farmakologiforskning. Subkutant transplanterede PDX-CR2110 tumorer blev indsamlet fra tumorbærende mus, da tumorerne nåede 200-800 mm3, pr. En godkendt obduktionsprocedure, efterfulgt af fjernelse af de tilstødende ikke-tumorvæv og dissociation i små tumorfragmenter. De små tumorfragmenter blev vasket og passeret gennem en 100 μm celle si for at fjerne snavset. Celleklynger blev indsamlet og ophængt i BME-opløsning (Basement Membrane Extract) og belagt i en 6-brøndsplade som en solid dråbe med omgivende flydende medier til vækst i en CO 2-inkubator. Organoid vækst blev overvåget to gange om ugen under lys mikroskopi og registreres af fotografering, efterfulgt af flydende medium forandring 2 eller 3 gange om ugen. De dyrkede organoider blev yderligere passeret (7 dage senere) ved et 1:2-forhold ved at forstyrre BME-indlejrede organoider ved hjælp af mekanisk klipning, hjulpet ved tilsætning af trypsin og tilsætning af 10 μM Y-27632. Organoider blev kryopræserveret i kryorør til langtidsopbevaring, efter frigivelse fra BME ved centrifugering, og også udtaget (f.eks. DNA, RNA og FFPE-blok) til yderligere karakterisering.
Introduction
Kræft er en samling af forskellige genetiske og immunologiske lidelser. Vellykket udvikling af effektive behandlinger er meget afhængig af eksperimentelle modeller, der effektivt forudsiger kliniske resultater. Store biblioteker af velkarakteriseret patient-afledte xenografts (PDX) har længe været betragtet som translationelle in vivo system valg til at teste kemo-og / eller målrettede behandlinger på grund af deres evne til at opsummere patientens tumor egenskaber, heterogenitet og patient lægemiddelrespons1, hvilket gør det muligt fase II-lignende mus kliniske forsøg for at forbedre klinisk succes2,3. PDX’er betragtes generelt som kræftstamcellesygdomme med genetisk stabilitet i modsætning til cellelinje afledt xenografts2. I løbet af de sidste par årtier, store samlinger af PDX’er er blevet skabt i hele verden, bliver arbejdshest af kræft lægemiddeludvikling i dag. Selv om disse dyremodeller er meget udbredte og med stor translationel værdi, er de i sig selv dyre, tidskrævende og lave gennemløb, hvilket er utilstrækkeligt til storstilet screening. PDX er også uønskede for immuno-onkologi (IO) test på grund af en immun-kompromitteret karakter4. Det er derfor upraktisk at drage fuld fordel af det tilgængelige store bibliotek af PDX’er.
Nylige opdagelser, banebrydende af Hans Clevers ‘laboratorium5, har ført til etablering af in vitro kulturer af organoider genereret fra voksne stamceller i de fleste menneskelige organer af epiteloprindelse5. Disse protokoller er blevet yderligere forfinet for at muliggøre vækst af organoider fra formodede CSC’er i humane carcinomer af forskellige indikationer6,7. Disse patient-afledte organoider (BOB) er genomisk stabile8,9 og har vist sig at være meget forudsigende for kliniske behandlingsresultater10,11,12. Derudover muliggør in vitro-karakteren af BOB’er højoverførselsscreening (HTS)13, hvilket potentielt giver en fordel i forhold til in vivo-modeller og udnytter store organoidbiblioteker som surrogat for patientpopulationen. PDA’er er klar til at blive en vigtig opdagelses- og oversættelsesplatform, der overvinder de mange begrænsninger af PDX’er, der er beskrevet ovenfor.
Både BOB og PDX er patient-afledte og CSC-drevne modeller, med evnen til at evaluere terapeutiske i forbindelse med enten personlig behandling eller klinisk forsøg format. Eksisterende store biblioteker af PDX’er, som den proprietære samling af >3000 PDXs14,15,16,17, er derfor velegnede til den hurtige generering af biblioteker af tumororganoider (PDX-afledte organoider eller PDXO), hvilket resulterer i et matchet bibliotek med parrede PDX- og PDXO-modeller. Denne rapport beskriver proceduren for at skabe og karakterisere kolorektal cancer PDXO-CR2110 i forhold til sin forældre PDX-CR2110 model16.
Protocol
Representative Results
Discussion
De foreløbige data for PDX-/PDXO-CR2110 i denne rapport understøtter den biologiske ækvivalens mellem PDX og dets afledte, PDXO, med hensyn til genomik, histopatologi og farmakologi, da begge modeller repræsenterer sygdomsformerne fra den oprindelige CSC af patienten. Begge modeller er patient-afledte sygdomsmodeller, potentielt forudsigende for den kliniske respons hos patienter10,11,12,21…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Dr. Jody Barbeau, Federica Parisi og Rajendra Kumari for kritisk læsning og redigering af manuskriptet. Forfatterne vil også gerne takke Crown Bioscience Oncology in vitro og in vivo team for deres store tekniske indsats.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
| Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
| Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Yang, M., et al. Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients. International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in Cancer Researchearch. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Muthuswamy, S. K. Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities. Cell Stem Cell. 22 (3), 290-291 (2018).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Yang, J. P., et al. A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation. Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).
- Zhang, L., et al. A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy. Scientific Reports. 3, 2992 (2013).
- Chen, D., et al. A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations. Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).
- Guo, S., et al. Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines. Cancer Research. 76 (16), 4619-4626 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Corcoran, R. B., et al. Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. , (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
