Het creëren van gematchte in vivo/in vitro patiënt-afgeleide modelparen van PDX en PDX-afgeleide organoïden voor kankerfarmacologisch onderzoek
Summary
Er wordt beschreven dat een methode wordt beschreven om organoïden te maken met behulp van patiënt-afgeleide xenografts (PDX) voor in vitro screening, wat resulteert in overeenkomende paren in vivo/in vitro modellen. PDX-tumoren werden mechanisch of enzymatisch in kleine stukjes geoogst/verwerkt, gevolgd door de Clevers’-methode om tumororganoïden te kweken die werden gepasseerd, cryopreserved en gekarakteriseerd tegen de oorspronkelijke PDX.
Abstract
Patiënt-afgeleide tumor xenografts (PDXs) worden beschouwd als de meest voorspellende preklinische modellen, grotendeels verondersteld te worden aangedreven door kanker stamcellen (CSC) voor conventionele kanker drug evaluatie. Een grote bibliotheek van PDX’s weerspiegelt de diversiteit van patiëntenpopulaties en maakt zo populatiegebaseerde preklinische studies mogelijk (“Fase II-achtige muis klinische studies”); PDX heeft echter praktische beperkingen van lage doorvoer, hoge kosten en lange duur. Tumororganoïden, ook door de patiënt afgeleide CSC-gestuurde modellen, kunnen worden beschouwd als het in vitro equivalent van PDX, waarmee bepaalde PDX-beperkingen voor het omgaan met grote bibliotheken van organoïden of verbindingen worden overschreden. Deze studie beschrijft een methode om PDX-afgeleide organoïden (PDXO) te maken, wat resulteert in gekoppelde modellen voor in vitro en in vivo farmacologisch onderzoek. Subcutaan getransplanteerde PDX-CR2110 tumoren werden verzameld van tumordragende muizen toen de tumoren 200-800 mm3bereikten, volgens een goedgekeurde autopsieprocedure, gevolgd door verwijdering van de aangrenzende niet-tumorweefsels en dissociatie in kleine tumorfragmenten. De kleine tumorfragmenten werden gewassen en door een 100 μm celzeef gepasseerd om het puin te verwijderen. Celclusters werden verzameld en opgehangen in keldermembraanextract (BME) oplossing en geplateerd in een 6-put plaat als een vaste druppel met omringende vloeibare media voor groei in een CO2 incubator. Organoïde groei werd tweemaal per week gecontroleerd onder lichte microscopie en opgenomen door fotografie, gevolgd door vloeibare mediumverandering 2 of 3 keer per week. De gekweekte organoïden werden verder gepasseerd (7 dagen later) in een verhouding van 1:2 door de BME ingebedde organoïden te verstoren met behulp van mechanisch scheren, geholpen door toevoeging van trypsine en de toevoeging van 10 μM Y-27632. Organoïden werden cryopreserved in cryo-buizen voor langdurige opslag, na versie van BME door centrifugation, en ook bemonsterd (b.v., DNA, RNA en FFPE blok) voor verdere karakterisering.
Introduction
Kankers zijn een verzameling van verschillende genetische en immunologische aandoeningen. Succesvolle ontwikkeling van effectieve behandelingen is sterk afhankelijk van experimentele modellen die klinische resultaten effectief voorspellen. Grote bibliotheken van goed gekarakteriseerde patiënt-afgeleide xenografts (PDX) worden al lang gezien als het translationele in vivo systeem bij uitstek om chemo- en/of gerichte therapieën te testen vanwege hun vermogen om patiënttumorkenmerken, heterogeniteit en respons van patiëntengeneesmiddelen samen tevatten 1, waardoor fase II-achtige muis klinische studies het klinische succes kunnen verbeteren2,3. PDX’s worden over het algemeen beschouwd als kankerstamcelziekten, met genetische stabiliteit, in tegenstelling tot cellijn afgeleide xenografts2. In de afgelopen decennia zijn over de hele wereld grote collecties PDX’s gemaakt, die vandaag de dag het werkpaard worden van de ontwikkeling van kankermedicijnen. Hoewel ze veel worden gebruikt en met een grote vertaalwaarde, zijn deze diermodellen intrinsiek duur, tijdrovend en lage doorvoer, daarom ontoereikend voor grootschalige screening. PDX zijn ook ongewenst voor immuno-oncologie (IO) testen als gevolg van een immuun-gecompromitteerd karakter4. Het is dus onpraktisch om ten volle te profiteren van de beschikbare grote bibliotheek met PDX’s.
Recente ontdekkingen, die door het laboratorium van Hans Clevers5zijn geïntroduceerd, hebben geleid tot de oprichting van in vitro culturen van organoïden die worden gegenereerd uit volwassen stamcellen in de meeste menselijke organen van epitheliale oorsprong5. Deze protocollen zijn verder verfijnd om de groei van organoïden van veronderstelde CSC ‘s in menselijke carcinomen van verschillende indicaties6,7mogelijk te maken . Deze patiënt-afgeleide organoïden (BOB ‘s) zijn genomisch stabiel8,9 en zijn zeer voorspellend gebleken voor klinische behandelingsuitkomsten10,11,12. Bovendien maakt het in vitro karakter van BOB’s screening met hoge doorvoer (HTS)13mogelijk, waardoor mogelijk een voordeel wordt geboden ten opzichte van in vivo modellen en grote organoïde bibliotheken worden gebruikt als surrogaat van de patiëntenpopulatie. PPO’s staan op het punt om een belangrijk ontdekkings- en vertaalplatform te worden en de vele beperkingen van PDX’s die hierboven worden beschreven, te overwinnen.
Zowel BOB als PDX zijn patiënt- en CSC-gestuurde modellen, met de mogelijkheid om therapeutische onderzoeken te evalueren in de context van een gepersonaliseerde behandeling of een klinisch onderzoeksformaat. Bestaande grote bibliotheken van PDX’s, zoals de eigen collectie van >3000 PDXs14,15,16,17, zijn daarom geschikt voor de snelle generatie van bibliotheken van tumororganoïden (PDX-afgeleide organoïden, of PDXO), wat resulteert in een bijpassende bibliotheek van gekoppelde PDX- en PDXO-modellen. Dit rapport beschrijft de procedure voor het maken en karakteriseren van colorectale kanker PDXO-CR2110 in relatie tot het ouderlijke PDX-CR2110 model16.
Protocol
Representative Results
Discussion
De voorlopige gegevens voor PDX-/PDXO-CR2110 in dit rapport ondersteunen de biologische gelijkwaardigheid tussen PDX en zijn derivaat PDXO, met betrekking tot genomica, histopathologie en farmacologie, aangezien beide modellen de ziektevormen vertegenwoordigen die zijn afgeleid van de oorspronkelijke CSC van de patiënt. Beide modellen zijn patiënt-afgeleide ziektemodellen, potentieel voorspellend voor de klinische respons van patiënten10,11,<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Dr. Jody Barbeau, Federica Parisi en Rajendra Kumari bedanken voor het kritisch lezen en redigeren van het manuscript. De auteurs willen ook het Crown Bioscience Oncology in vitro en in vivo team bedanken voor hun grote technische inspanningen.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
| Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
| Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Yang, M., et al. Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients. International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in Cancer Researchearch. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Muthuswamy, S. K. Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities. Cell Stem Cell. 22 (3), 290-291 (2018).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Yang, J. P., et al. A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation. Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).
- Zhang, L., et al. A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy. Scientific Reports. 3, 2992 (2013).
- Chen, D., et al. A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations. Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).
- Guo, S., et al. Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines. Cancer Research. 76 (16), 4619-4626 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Corcoran, R. B., et al. Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. , (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
