Création de paires de modèles appariés in vivo/in vitro dérivés du patient d’organoïdes dérivés de PDX et de PDX pour la recherche en pharmacologie du cancer
Summary
Une méthode est décrite pour créer des organoïdes à l’aide de xénogreffes dérivées du patient (PDX) pour le dépistage in vitro, ce qui donne des paires appariées de modèles in vivo/in vitro. Des tumeurs de PDX ont été moissonnes/traitées en petits morceaux mécaniquement ou enzymatiquement, suivies du Clevers’ méthode pour cultiver des organoids de tumeur qui ont été passaged, cryopreserved et caractérisés contre le PDX original.
Abstract
Les xénogreffes tumorales dérivées du patient (PDX) sont considérées comme les modèles précliniques les plus prédictifs, largement considérés comme pilotés par les cellules souches cancéreuses (CSC) pour l’évaluation conventionnelle des médicaments anticancéreux. Une grande bibliothèque de PDX reflète la diversité des populations de patients et permet ainsi des essais précliniques basés sur la population (« essais cliniques de souris de type II »); cependant, pdx ont des limites pratiques de faible débit, coûts élevés et longue durée. Les organoïdes tumoraux, étant également des modèles CSC-conduits patients-dérivés, peuvent être considérés comme l’équivalent in vitro de PDX, surmontant certaines limitations de PDX pour traiter de grandes bibliothèques d’organoïdes ou de composés. Cette étude décrit une méthode pour créer des organoïdes dérivés de PDX (PDXO), résultant ainsi en des modèles appariés pour la recherche en pharmacologie in vitro et in vivo. Des tumeurs PDX-CR2110 sous-cutanées-transplantées ont été rassemblées des souris de tumeur-roulement quand les tumeurs ont atteint 200-800millimètres 3,par une procédure approuvée d’autopsie, suivie du déplacement des tissus non-tumoraux adjacents et de la dissociation dans de petits fragments de tumeur. Les petits fragments tumoraux ont été lavés et passés à travers une passoire cellulaire de 100 μm pour enlever les débris. Des amas de cellules ont été rassemblés et suspendus dans la solution d’extrait de membrane de sous-sol (BME) et plaqués dans une plaque de 6 puits comme gouttelette solide avec des milieux liquides environnants pour la croissance dans un incubateur de CO2. La croissance d’Organoid a été surveillée deux fois par semaine sous la photomicroscopie et enregistrée par la photographie, suivie du changement liquide de milieu 2 ou 3 fois par semaine. Les organoïdes cultivés ont ensuite été croisés (7 jours plus tard) à un rapport de 1:2 en perturbant les organoïdes incorporés au BME à l’aide d’un cisaillement mécanique, aidés par l’ajout de trypsine et l’ajout de 10 μM d’Y-27632. Les organoïdes ont été cryoconservés dans des cryo-tubes pour le stockage à long terme, après libération de BME par centrifugation, et également échantillonnés (par exemple, l’ADN, l’ARN et le bloc FFPE) pour une caractérisation plus approfondie.
Introduction
Les cancers sont un ensemble de divers troubles génétiques et immunologiques. Le succès de la mise au point de traitements efficaces dépend fortement de modèles expérimentaux qui prédisent efficacement les résultats cliniques. De grandes bibliothèques de xénogreffes dérivées du patient (PDX) bien caractérisées ont longtemps été considérées comme le système translationnel in vivo de choix pour tester les thérapies chimio- et / ou ciblées en raison de leur capacité à récapituler les caractéristiques tumorales du patient, l’hétérogénéité et la réponse du médicament patient1,permettant ainsi aux essais cliniques de souris de type Phase II d’améliorer le succès clinique2,3. Les PDX sont généralement considérés comme des maladies des cellules souches cancéreuses, présentant une stabilité génétique, contrairement aux xénogreffes dérivées de lignées cellulaires2. Au cours des dernières décennies, de grandes collections de PDX ont été créées dans le monde entier, devenant le cheval de bataille du développement de médicaments anticancéreux aujourd’hui. Bien que largement utilisés et ayant une grande valeur translationnelle, ces modèles animaux sont intrinsèquement coûteux, longs et à faible débit, donc inadéquats pour le criblage à grande échelle. Les PDX sont également indésirables pour les tests d’immuno-oncologie (IO) en raison d’une nature immunodéprimée4. Il n’est donc pas pratique de tirer pleinement parti de la grande bibliothèque de PDX disponible.
Des découvertes récentes, initiées par le laboratoire5de Hans Clevers, ont conduit à l’établissement de cultures in vitro d’organoïdes générés à partir de cellules souches adultes dans la plupart des organes humains d’origine épithéliale5. Ces protocoles ont été affinés pour permettre la croissance d’organoïdes à partir de CSC supposés dans des carcinomes humains de diverses indications6,7. Ces organoïdes dérivés du patient (PDO) sont génomiquement stables8,9 et se sont avérés hautement prédictifs des résultats du traitement clinique10,11,12. En outre, la nature in vitro des PDO permet un criblage à haut débit (HTS)13,offrant ainsi potentiellement un avantage sur les modèles in vivo et tirant parti de grandes bibliothèques organoïdes comme substitut de la population de patients. Les PDO sont sur le point de devenir une importante plate-forme de découverte et de traduction, surmontant les nombreuses limitations des PDX décrites ci-dessus.
L’AOP et la PDX sont des modèles dérivés du patient et axés sur le SCC, qui ont la capacité d’évaluer les traitements dans le contexte d’un traitement personnalisé ou d’un format d’essai clinique. Les grandes bibliothèques existantes de PDX, comme la collection propriétaire de >3000 PDX14,15,16,17,conviennent donc à la génération rapide de bibliothèques d’organoïdes tumoraux (organoïdes dérivés de PDX, ou PDXO), résultant en une bibliothèque appariée de modèles PDX et PDXO appariés. Ce rapport décrit la procédure pour créer et caractériser le cancer côlorectal PDXO-CR2110 par rapport à son pdx-cr2110 parental modèle16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les données préliminaires pour PDX-/PDXO-CR2110 dans ce rapport soutiennent l’équivalence biologique entre PDX et son dérivé, PDXO, en ce qui concerne la génomique, l’histopathologie et la pharmacologie, puisque les deux modèles représentent les formes de maladie dérivées du CSC original du patient. Les deux modèles sont des modèles de maladies dérivées du patient, potentiellement prédictifs de la réponse clinique des patients10,11,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Jody Barbeau, Federica Parisi et Rajendra Kumari pour la lecture critique et l’édition du manuscrit. Les auteurs tiennent également à remercier l’équipe in vitro et in vivo de Crown Bioscience Oncology pour ses grands efforts techniques.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
| Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
| Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |
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