암 약리학 연구를 위한 PDX 및 PDX 유래 오르가노이드의 생체내/생체외 환자 유래 모델 쌍 생성
Summary
시험관 내 스크리닝을 위해 환자 유래 제노이식(PDX)을 사용하여 오가노이드를 생성하여 생체내/생체 외 모델의 쌍을 매칭하는 방법을 설명합니다. PDX 종양은 기계적 또는 효소적으로 작은 조각으로 수확/처리되었으며, 원래 PDX에 대해 처리, 냉동 보존 및 특징인 종양 오르가노이드를 성장시키는 영리한 방법.
Abstract
환자 유래 종양 이종이이식(PDXs)은 종래의 암 약물 평가를 위해 암 줄기세포(CSC)에 의해 구동되는 것으로 여겨지는 가장 예측적인 전임상 모델로 여겨진다. PDXs의 큰 라이브러리는 환자 인구의 다양성을 반영하고 따라서 인구 기반의 전임상 시험 (“단계 II 와 같은 마우스 임상 시험”);; 그러나 PDX는 낮은 처리량, 높은 비용 및 긴 기간의 실질적인 한계를 가지고 있습니다. 종양 오르가노이드는 환자 유래 CSC 구동 모델이기도 하며, PDX의 체외 동등한 것으로 간주될 수 있으며, 오르가노이드 또는 화합물의 대형 라이브러리를 다루기 위한 특정 PDX 제한을 극복한다. 이 연구는 PDX 유래 오르가노이드 (PDXO)를 만드는 방법을 설명하므로 시험관 내 및 생체 내 약리학 연구를위한 페어링 된 모델을 초래합니다. 피하 이식 PDX-CR2110 종양은 종양이 승인된 부검 절차에 따라 200-800mm3에도달했을 때 종양 을 낳은 마우스로부터 수집되었으며, 그 다음으로 인접한 비종양 조직을 제거하고 작은 종양 단편으로 해리하였다. 작은 종양 파편은 세척하고 파편을 제거하기 위해 100 μm 세포 여과기를 통과했다. 세포 클러스터는 지하 멤브레인 추출물(BME) 용액에서 수거 및 중단되었고CO2 인큐베이터에서 성장을 위한 주변 액체 매체를 가진 고체 액적물로서 6웰 플레이트에 도금하였다. 오르가노이드 성장은 가벼운 현미경 검사법에 따라 매주 두 번 모니터링되고 사진에 의해 기록되었으며, 액체 중간 크기 변화는 일주일에 2 또는 3 번 변경되었습니다. 재배된 오르가노이드는 1:2 비율로 기계 전단을 사용하여 BME 임베디드 오르가노이드를 방해하여 1:2 비율로 더 통과되었으며, 트립신을 추가하고 10 μM Y-27632를 첨가했습니다. 오르가노이드는 원심분리에 의해 BME에서 방출된 후 장기 저장을 위해 냉동 튜브에서 보존되었으며, 또한 추가 특성화를 위해 샘플링(예: DNA, RNA 및 FFPE 블록)을 샘플링하였다.
Introduction
암은 다양한 유전 및 면역 학적 장애의 모음입니다. 효과적인 치료법의 성공적인 개발은 임상 결과를 효과적으로 예측하는 실험 모델에 크게 의존합니다. 잘 특징화된 환자 유래 제노이식(PDX)의 대형 라이브러리는 환자 종양 특성, 이질성 및 환자 약물 반응1을회수하는 능력으로 인해 화학 요법 및/또는 표적 요법을 테스트하기 위해 생체 내 번역 시스템으로 오랫동안 간주되어임상2,3. PDX는 일반적으로 유전적 안정성을 특징으로 하는 암 줄기 세포 질환으로 간주되며, 세포주 유래 제노이식2와는 대조적이다. 지난 수십 년 동안 PDX의 대규모 컬렉션은 전 세계적으로 만들어졌으며 오늘날 암 약물 개발의 주력선수가 되었습니다. 널리 사용되고 큰 번역 가치와 있지만,이 동물 모델은 본질적으로 비용이 많이 들며 시간이 많이 걸리고 처리량이 적기 때문에 대규모 스크리닝에는 적합하지 않습니다. PDX는 면역 손상 된 자연4로인해 면역 종양학 (IO) 테스트에도 바람직하지 않다. 따라서 PDX의 사용 가능한 대형 라이브러리를 최대한 활용하는 것은 비실용적입니다.
한스 클레버의 실험실5에의해 개척 된 최근의 발견은 상피 기원의 대부분의 인간 기관에서 성인 줄기 세포에서 생성 된 오르가노이드의 체외 배양의 설립을 주도하고있다5. 이러한 프로토콜은 다양한 징후6,7의인간 암종에서 가정된 CSC에서 장기형의 성장을 허용하기 위해 더욱 정제되었다. 이러한 환자 유래 오르가노이드(PdOs)는 genomically 안정된8,9이며 임상 치료결과(10, 11,12)를높게 예측하는 것으로 나타났다. 또한, PdPo의 체외 특성은 높은 처리량 스크리닝(HTS)13을가능하게 하여 생체 내 모델보다 우위를 제공하고 환자 집단의 대리로서 대형 오르간성 라이브러리를 활용할 수 있다. PdSo는 위에서 설명한 PDF의 많은 한계를 극복하는 중요한 발견 및 번역 플랫폼이 될 태세입니다.
PDO와 PDX는 모두 환자 유래 및 CSC 구동 모델이며 개인화된 치료 또는 임상 시험 형식의 맥락에서 치료법을 평가할 수 있습니다. 기존 대형 PDF 라이브러리는 >3000PDXs 14,15,16,17의독점 컬렉션과 같이 종양 오르가노이드(PDX 유래 오르가노이드 또는 PDXO)의 신속한 라이브러리 생성에 적합하므로 PDX 및 PDXO 모델의 일치하는 라이브러리를 생성합니다. 본 보고서는 부모 PDX-CR2110 모델16과관련하여 대장암 PDXO-CR2110을 만들고 특성화하는 절차를 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 보고서에서 PDX/PDXO-CR2110의 예비 데이터는 유전체학, 조직병리학 및 약리학과 관련하여 PDX와 PDXO 사이의 생물학적 동등성을 뒷받침하며, 이는 두 모델이 환자의 원래 CSC에서 유래된 질병 형태를 나타내기 때문이다. 두 모델 모두 환자 유래 질환 모델이며, 잠재적으로 환자의 임상 반응을예측한다(10,11,12,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 조디 바르보 박사, 페데리카 파리시, 라젠드라 쿠마리 박사에게 원고의 비판적 독서와 편집에 감사드립니다. 저자는 또한 그들의 큰 기술적인 노력에 대 한 체외와 생체 내 팀에 크라운 생물 과학 종양학 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
| Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
| Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Yang, M., et al. Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients. International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in Cancer Researchearch. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Muthuswamy, S. K. Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities. Cell Stem Cell. 22 (3), 290-291 (2018).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Yang, J. P., et al. A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation. Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).
- Zhang, L., et al. A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy. Scientific Reports. 3, 2992 (2013).
- Chen, D., et al. A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations. Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).
- Guo, S., et al. Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines. Cancer Research. 76 (16), 4619-4626 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Corcoran, R. B., et al. Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. , (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
