Criando pares de modelos derivados do paciente in vivo/in vitro de PDX e Organoides Derivados de PDX para pesquisa de farmacologia do câncer
Summary
Um método é descrito para criar organoides usando xenoenxertos derivados do paciente (PDX) para triagem in vitro, resultando em pares combinados de modelos in vivo/in vitro. Os tumores PDX foram colhidos/processados em pequenos pedaços mecanicamente ou enzimáticamente, seguidos pelo método dos Clevers para cultivar organoides tumorais que foram passagem, criopreservados e caracterizados contra o PDX original.
Abstract
Os xenoenxertos tumorais derivados do paciente (PDXs) são considerados os modelos pré-clínicos mais preditivos, em grande parte acredita-se que sejam impulsionados por células-tronco cancerígenas (CSC) para avaliação convencional de medicamentos contra o câncer. Uma grande biblioteca de PDXs reflete a diversidade das populações de pacientes e, portanto, permite ensaios pré-clínicos baseados na população (“Ensaios clínicos de camundongos semelhantes à fase II”); no entanto, o PDX tem limitações práticas de baixo rendimento, custos elevados e longa duração. Os organoides tumorais, também sendo modelos derivados do CSC derivados do paciente, podem ser considerados como o equivalente in vitro do PDX, superando certas limitações de PDX para lidar com grandes bibliotecas de organoides ou compostos. Este estudo descreve um método para criar organoides derivados do PDX (PDXO), resultando assim em modelos emparelhados para pesquisa de farmacologia in vitro e in vivo. Tumores PDX-CR2110 transplantados subcutâneos foram coletados de camundongos portadores de tumor quando os tumores atingiram 200-800 mm3, por um procedimento de autópsia aprovado, seguido pela remoção dos tecidos não tumorais adjacentes e dissociação em pequenos fragmentos tumorais. Os pequenos fragmentos tumorais foram lavados e passaram por um coador de células de 100 μm para remover os detritos. Os agrupamentos celulares foram coletados e suspensos na solução de extrato de membrana do porão (BME) e banhados em uma placa de 6 poços como uma gotícula sólida com mídia líquida circundante para crescimento em uma incubadora de CO2. O crescimento organoide foi monitorado duas vezes por semana sob microscopia leve e registrado pela fotografia, seguido por variação média líquida 2 ou 3 vezes por semana. Os organoides cultivados foram ainda mais aprovados (7 dias depois) em uma proporção de 1:2, interrompendo os organoides incorporados da BME usando tesoura mecânica, auxiliados pela adição de trippsina e a adição de 10 μM Y-27632. Os organoides foram criopreservados em crio-tubos para armazenamento a longo prazo, após a liberação da BME por centrifugação, e também amostrados (por exemplo, DNA, RNA e bloco FFPE) para caracterização posterior.
Introduction
Os cânceres são uma coleção de diversos distúrbios genéticos e imunológicos. O desenvolvimento bem-sucedido de tratamentos eficazes é altamente dependente de modelos experimentais que efetivamente predizem resultados clínicos. Grandes bibliotecas de xenoenxertos bem caracterizados pelo paciente (PDX) têm sido vistas há muito tempo como o sistema translacional in vivo de escolha para testar terapias de quimioterapia e/ou direcionadas devido à sua capacidade de recapitular características tumorais do paciente, heterogeneidade e resposta a medicamentos para pacientes1, permitindo assim que os ensaios clínicos do camundongo da Fase II melhorem o sucesso clínico2,3. Os PDXs são geralmente considerados como doenças cancerígenas, apresentando estabilidade genética, em contraste com os xenoenxertos derivados da linha celular2. Nas últimas décadas, grandes coleções de PDXs foram criadas em todo o mundo, tornando-se o cavalo de trabalho do desenvolvimento de medicamentos contra o câncer hoje. Embora amplamente utilizados e com grande valor translacional, esses modelos animais são intrinsecamente caros, demorados e de baixa produtividade, portanto inadequados para a triagem em larga escala. PDX também são indesejáveis para testes de imuno-oncologia (IO) devido a uma natureza imunocompensado4. Portanto, é impraticável aproveitar ao máximo a grande biblioteca disponível dos PDXs.
Descobertas recentes, pioneiras pelo laboratório Hans Clevers5,levaram ao estabelecimento de culturas in vitro de organoides gerados a partir de células-tronco adultas na maioria dos órgãos humanos de origem epitelial5. Esses protocolos foram ainda mais refinados para permitir o crescimento de organoides de CSCs assumidos em carcinomas humanos de várias indicações6,7. Estes organoides derivados do paciente (PDOs) são genomicamente estáveis8,9 e têm se mostrado altamente preditivos dos desfechos do tratamento clínico10,11,12. Além disso, a natureza in vitro dos PDOs permite a triagem de alto rendimento (HTS)13, potencialmente oferecendo uma vantagem sobre modelos in vivo e aproveitando grandes bibliotecas organoides como substituto da população paciente. Os PDOs estão prontos para se tornar uma importante plataforma de descoberta e tradução, superando as muitas limitações dos PDXs descritos acima.
Tanto o PDO quanto o PDX são modelos derivados do paciente e orientados pelo CSC, com a capacidade de avaliar terapêuticas no contexto de tratamento personalizado ou formato de ensaio clínico. As grandes bibliotecas existentes de PDXs, como a coleção proprietária de >3000 PDXs14,15,16,17, são, portanto, adequadas para a rápida geração de bibliotecas de organoides tumorais (organoides derivados do PDX, ou PDXO), resultando em uma biblioteca combinada de modelos PDX e PDXO emparelhados. Este relatório descreve o procedimento para criar e caracterizar o câncer colorretal PDXO-CR2110 em relação ao seu PDX-CR2110 parental modelo16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os dados preliminares do PDX-/PDXO-CR2110 neste relatório suportam a equivalência biológica entre pdx e seu derivado, PDXO, no que diz respeito à genômica, histopatologia e farmacologia, uma vez que ambos os modelos representam as formas da doença derivadas do CSC original do paciente. Ambos os modelos são modelos de doenças derivadas do paciente, potencialmente preditivos da resposta clínica dos pacientes10,11,12,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Jody Barbeau, Federica Parisi e Rajendra Kumari pela leitura crítica e edição do manuscrito. Os autores também gostariam de agradecer à Crown Bioscience Oncology in vitro e equipe in vivo por seus grandes esforços técnicos.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
| Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
| Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |
References
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