Kanser Farmakolojisi Araştırmaları için PDX ve PDX Türevli Organoidlerin Eşleştirilmiş In vivo/In vitro Hasta Kaynaklı Model Çiftlerinin Oluşturulması
Summary
İn vitro tarama için hasta kaynaklı ksinograftlar (PDX) kullanılarak organoidler oluşturmak için bir yöntem açıklanmıştır, bu da eşleşen in vivo/in vitro model çiftleri ile sonuçlanır. PDX tümörleri mekanik veya enzmatik olarak küçük parçalara ayrıldı/işlendi, ardından Clevers’in orijinal PDX’e karşı pas geçen, kriyoprezerserve edilen ve karakterize edilen tümör organoidlerini yetiştirme yöntemi izlendi.
Abstract
Hasta kaynaklı tümör ksinograftları (PDX’ler), büyük ölçüde geleneksel kanser ilacı değerlendirmesi için kanser kök hücreleri (CSC) tarafından yönlendirildiğine inanılan en tahmine dayalı preklinik modeller olarak kabul edilir. Büyük bir PDX kütüphanesi hasta popülasyonlarının çeşitliliğini yansıtır ve böylece nüfusa dayalı preklinik çalışmalara olanak tanır (“Faz II benzeri fare klinik çalışmaları”); ancak, PDX düşük aktarım hızı, yüksek maliyetler ve uzun süre pratik sınırlamalara sahiptir. Aynı zamanda hasta kaynaklı CSC güdümlü modeller olan tümör organoidleri, büyük organoid veya bileşik kütüphaneleriyle başa çıkmak için belirli PDX sınırlamalarının üstesinden gelen PDX’in in vitro eşdeğeri olarak kabul edilebilir. Bu çalışma, PDX türevi organoidler (PDXO) oluşturmak için bir yöntem açıklar, böylece in vitro ve in vivo farmakoloji araştırmaları için eşleştirilmiş modeller elde edilir. Deri altı nakledilen PDX-CR2110 tümörleri tümör taşıyan farelerden, tümörler onaylanmış bir otopsi prosedürü başına 200-800 mm3‘e ulaştığında, ardından bitişik tümör dışı dokuların çıkarılması ve küçük tümör parçalarına ayrışması toplanmıştır. Küçük tümör parçaları yıkandı ve enkazı gidermek için 100 μm hücre süzgecinden geçirildi. Hücre kümeleri bodrum membran özü (BME) çözeltisinde toplanıp askıya alındı ve CO 2 inkübatörde büyümek için çevreleyen sıvı ortama sahip katı bir damlacık olarak6 kuyulu bir plakaya kaplandı. Organoid büyümesi ışık mikroskopisi altında haftada iki kez izlendi ve fotoğrafla kaydedildi, ardından haftada 2 veya 3 kez sıvı orta değişim izlendi. Yetiştirilen organoidler, tripin ilavesi ve 10 μM Y-27632 ilavesi ile birlikte mekanik kesme kullanarak BME gömülü organoidleri bozarak 1:2 oranında daha fazla geçiş yaptı (7 gün sonra). Organoidler, bme’den santrifüjleme ile serbest bırakıldıktan sonra uzun süreli depolama için kriyo tüplerde kriyopreziteserv edildi ve ayrıca daha fazla karakterizasyon için örneklendi (örneğin, DNA, RNA ve FFPE bloğu).
Introduction
Kanserler çeşitli genetik ve immünolojik bozuklukların bir koleksiyonudur. Etkili tedavilerin başarılı gelişimi, klinik sonuçları etkili bir şekilde öngören deneysel modellere oldukça bağlıdır. İyi karakterize hasta kaynaklı ksinograftların (PDX) büyük kütüphaneleri, uzun zamandır, hasta tümör özelliklerini, heterojenliği ve hasta ilaç yanıtını1yeniden yakalama yetenekleri nedeniyle kemoterapi ve / veya hedefli tedavileri test etmek için tercih edilen çevirisel in vivo sistemi olarak görmektedir, böylece Faz II benzeri fare klinik çalışmalarının klinik başarıyı iyileştirmesini sağlar2,3. PDX’ler genellikle hücre hattı türetilmiş ksinograftların aksine genetik stabiliteye sahip kanser kök hücre hastalıkları olarak kabul edilir2. Son birkaç on yılda, dünya çapında büyük PDX koleksiyonları oluşturuldu ve bugün kanser ilacı geliştirmenin atı haline geldi. Yaygın olarak kullanılmasına ve büyük çeviri değerine sahip olmasına rağmen, bu hayvan modelleri özünde maliyetli, zaman alıcı ve düşük verime sahiptir, bu nedenle büyük ölçekli tarama için yetersizdir. PDX ayrıca bağışıklıktan zarar gören bir doğa nedeniyle immün-onkoloji (GÇ) testi için istenmeyen4. Bu nedenle, mevcut büyük PDX kütüphanesinden tam olarak yararlanmak pratik değildir.
Hans Clevers’in laboratuvarı5tarafından öncülük edilen son keşifler, epitel kökenli çoğu insan organında yetişkin kök hücrelerden üretilen organoidlerin in vitro kültürlerinin kurulmasına yol açmıştır5. Bu protokoller, çeşitli endikasyonların insan karsinomlarında varsayılan CSC’lerden organoidlerin büyümesine izin vermek için daha da rafine edilmiştir6,7. Bu hasta kaynaklı organoidler (PDO’ lar) genomik olarak stabil8,9’dur ve klinik tedavi sonuçları 10 , 11,12’yioldukça tahmin ettiği gösterilmiştir. Ek olarak, PDO’ların in vitro doğası yüksek verimli tarama (HTS)13, böylece potansiyel olarak in vivo modellere göre bir avantaj sunar ve hasta popülasyonunun bir vekili olarak büyük organoid kütüphanelerinden yararlanır. PDO’lar, yukarıda açıklanan PDX’lerin birçok sınırlamasının üstesinden gelerek önemli bir keşif ve çeviri platformu olmaya hazırdır.
Hem PDO hem de PDX, terapötikleri kişiselleştirilmiş tedavi veya klinik çalışma formatı bağlamında değerlendirme yeteneğine sahip hasta kaynaklı ve CSC odaklı modellerdir. Bu nedenle,14, 15, 16, 17>3000 PDX’lerin tescilli koleksiyonu gibi mevcut büyük PDX kütüphaneleri, tümör organoidlerinin (PDX türevli organoidler veya PDXO) kütüphanelerinin hızlı üretimi için uygundur ve bu da eşleştirilmiş PDX ve PDXO modellerinin eşleştirilmiş bir kütüphanesiyle sonuçlanır. Bu rapor, kolorektal kanser PDXO-CR2110’u ebeveyn PDX-CR2110 model16ile ilgili olarak oluşturma ve karakterize etme prosedürünü açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu raporda pdx-/PDXO-CR2110 için ön veriler, her iki model de hastanın orijinal CSC’sinden elde edilen hastalık formlarını temsil ettiği için, genomik, histopatoloji ve farmakoloji açısından PDX ve türevi PDXO arasındaki biyolojik eşdeğerliği desteklemektedir. Her iki model de hasta kaynaklı hastalık modelleridir, potansiyel olarak hastaların klinik yanıtını tahmin eden10 , 11,12,<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, makalenin eleştirel okunması ve düzenlenmesi için Dr. Jody Barbeau, Federica Parisi ve Rajendra Kumari’ye teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Crown Bioscience Oncology in vitro ve in vivo ekibine büyük teknik çabaları için teşekkür eder.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
| Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
| Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Yang, M., et al. Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients. International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in Cancer Researchearch. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Muthuswamy, S. K. Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities. Cell Stem Cell. 22 (3), 290-291 (2018).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Yang, J. P., et al. A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation. Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).
- Zhang, L., et al. A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy. Scientific Reports. 3, 2992 (2013).
- Chen, D., et al. A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations. Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).
- Guo, S., et al. Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines. Cancer Research. 76 (16), 4619-4626 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Corcoran, R. B., et al. Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. , (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
